【Nat.Chem.】一招鲜，吃遍天，通过色氨酸与多种常规荧光团偶联构建出覆盖紫外至近红外的全色系荧光免洗探针#

针对多肽荧光探针成像需洗涤的难题，该研究通过色氨酸与多种常规荧光团偶联诱导PeT/TICT分子内淬灭，构建出覆盖紫外至近红外的全色系荧光生色氨基酸。将其引入多肽不仅实现了活细胞快速免洗成像，还成功制备出PD-1靶向探针并筛选发现小分子阿伐麦布具有下调PD-1表达的活性，为免洗探针设计与免疫药物筛选提供了通用策略。

为什么多肽荧光探针总被背景噪音卡住#

在活细胞成像里，多肽探针因为分子量适中、容易合成而且对靶点具有特异性，一直是很常用的工具。但常规的多肽标记方式大多是把现成的商业荧光染料挂在多肽的末端或者侧链上。这种做法有一个很难避开的缺陷：游离的多肽和结合到靶点上的多肽发光强度几乎一样。为了看清细胞上的目标，实验人员通常要反复清洗细胞来洗掉没结合的游离探针，或者花很长时间等待结合平衡，否则背景荧光会直接把真正的信号淹没。

为了解决这个问题，领域内一直想做“开-关”型（Turn-on）荧光多肽，也就是探针在溶液里不亮，碰到靶点才亮起来，这样就能实现免洗成像。实现这个目标最直接的路线，就是开发荧光生色氨基酸（Fluorogenic amino acids, FgAAs），把它作为单体直接砌进多肽链里。

但以往开发这类氨基酸遇到了瓶颈。过去大家主要依赖丹酰（dansyl）、硝基苯并恶二唑（NBD）、氨基萘酰亚胺（naphthalimide）或prodan等对环境极性敏感的生色团。这些母体骨架本身的性质并不理想：吸收波长通常偏短（大部分在400 nm以下，容易激发细胞自身的自发荧光），而且摩尔消光系数偏低（通常在 $10^3\sim10^4\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$ 之间），整体亮度有限。

如果想直接改用本身就很亮、波长覆盖更广的经典荧光染料（比如香豆素、BODIPY、氧杂蒽、罗丹明、硅罗丹明等），领域内又缺乏一种通用的分子内淬灭机制，无法保证把每种亮荧光团做成氨基酸后都能在水相中维持足够暗的关闭状态。

换个思路：让色氨酸充当普适的内置淬灭开关#

这篇论文的核心思路没有从头设计新的荧光母核，而是选择反向操作：直接拿原本就很亮的经典荧光团做原料，利用色氨酸本身的电子特性去强行淬灭它们。

在天然蛋白质中，局部的色氨酸（Trp）残基经常会因为范德华接触而淬灭邻近荧光基团的发射。受这一现象启发，作者团队设想，如果把色氨酸作为一个功能性氨基酸骨架，通过短距离的共价键直接挂到各种荧光染料上，是否就能构建出一套通用的荧光生色氨基酸？

在化学合成路径上，作者通过钯催化的 $\text{C(sp}^2\text{)–H}$ 活化反应，将 Fmoc 保护的色氨酸（Fmoc-Trp-OH）的 2 位与各种带碘代基团的荧光染料直接偶联。这样合成出来的生色氨基酸具有几个预期特征：

距离短且结构紧凑：色氨酸吲哚环与荧光母核直接相连，有利于分子内能量或电荷的高效转移。
保持固相合成兼容性：保留了色氨酸主链的氨基与羧基，能够直接作为常规 Fmoc 保护氨基酸单体用于标准固相多肽合成（SPPS）。
通用性广：只要能制备出相应荧光团的芳基碘化物前体，就能套用同一套偶联条件合成覆盖全光谱的氨基酸单体。

Fig. 1: Design, synthesis and characterization of a chemically and optically diverse multicolour library of FgAAs.#

理论与实验证据：淬灭机理与细胞成像的实际表现#

作者围绕这套思路展开了从计算化学、光谱表征到细胞成像的完整验证。

1. 全色系生色氨基酸库的合成与光谱表现#

作者合成了六种覆盖紫外到近红外波段的荧光生色氨基酸（化合物 10–15），分别对应香豆素（Coumarin-AA, 10）、BODIPY（BODIPY-AA, 11）、6-羟基-9-苯基荧光酮（HPF-AA, 12）、氧杂罗丹明（O-rhodamine-AA, 13）、恶嗪酮（Oxazone-AA, 14）和硅罗丹明（Si-rhodamine-AA, 15）。

光谱数据给出了很直接的证据：

荧光量子产率显著压低：在乙醇溶剂中，原始母体荧光团的量子产率一般在 20% 到 66% 之间，而偶联色氨酸后制成的氨基酸（10–15），量子产率均降至 1% 到 11%（多数在 1%–4% 甚至未检出），实现了至少一个数量级的荧光淬灭。
消光系数得以保留：O-rhodamine-AA 和 Si-rhodamine-AA 的摩尔消光系数分别达到了 $96\times10^3\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$ 和 $148\times10^3\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$ ，并未因偶联而出现发色基团破坏。
环境响应开启倍数明确：在甘油与水的对比测试中，这些生色氨基酸在纯水中几乎不发光，而在高粘度或疏水环境（甘油）中荧光大幅恢复，开启倍数介于 8 倍到 40 倍 之间。

Fig. 2: Computational analysis of frontier molecular orbitals and excited-state properties of representative FgAAs exhibiting PeT- or TICT-based quenching.#

2. 计算化学揭示的两种淬灭路径#

通过 DFT 和 TD-DFT 理论计算，作者对分子前线轨道和第一激发态（ $S_1$ ）势能面进行了计算，阐明了淬灭的物理机制取决于体系的共轭程度：

光诱导电子转移（PeT）机制：在 BODIPY-AA、HPF-AA、O-rhodamine-AA 和 Si-rhodamine-AA 中，色氨酸与荧光团之间存在较大的二面角，电子处于隔离状态。计算显示色氨酸引入了一个能量略低于 HOMO 的 HOMO-1 轨道（能隙 $\Delta E$ 在 -0.28 eV 至 0.15 eV 之间）。光激发后，电子从 HOMO 跃迁至 LUMO，色氨酸迅速向 HOMO 注入电子，形成非辐射弛豫的电荷转移态（ET态）。在极性水溶液中，ET 态比局部激发态（LE态）更稳定（例如硅罗丹明中 ET 态能量比 LE 态低 0.88 eV），导致强荧光淬灭；而在疏水或受阻环境中，分子转动受限且极性降低，体系回到 LE 态发出强荧光。
扭曲分子内电荷转移（TICT）机制：在香豆素-AA 和恶嗪酮-AA 中，色氨酸的引入扩展了共轭体系，吸收光谱发生红移。基态下色氨酸与母核呈现预扭曲构型（如恶嗪酮二面角约为 -42°），激发态扫描显示体系能以极低能垒（驱动能达 0.78 eV）快速旋转至垂直构型（90°），进入无辐射的 TICT 暗态。

3. 固相合成稳定性与免洗活细胞膜成像#

作者测试了这批生色氨基酸对固相合成条件（95% TFA、TIS、DTT）的耐受性。除了 BODIPY-AA 在强酸条件下已知容易降解外，其余氨基酸均能稳定耐受裂解条件。

作者将 HPF-AA、O-rhodamine-AA 和 Si-rhodamine-AA 分别引入靶向脂质双层的多肽序列 KKRFSFKKF 中（制成多肽 22、23、24）。将其加入到大肠杆菌和人类中性粒细胞悬液中进行共聚焦显微镜观察，无需任何洗涤步骤：

多肽在几分钟内即可清晰点亮细菌细胞壁和中性粒细胞膜。
图像的信噪比（SNR）分别达到 18（多肽 22）、33（多肽 23）和 57（多肽 24），其中基于硅罗丹明的探针表现出极高的对比度。

Fig. 3: FgAAs are excellent fluorogenic building blocks for wash-free peptide-based imaging.*#

4. PD-1 靶向多肽设计与免疫调节药物筛选#

为了验证该策略在复杂生物靶点和药物筛选中的实用性，作者以近红外硅罗丹明为核心，针对免疫检查点受体 PD-1 展开了设计。

作者首先在硅罗丹明的间位苯环上引入甲基修饰，限制苯环旋转，合成了优化单体 28（消光系数达 $191\times10^3\text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$ ，亮度提高到 5,500）。随后合成了 6 种包含线性和环状结构的 PD-1 结合多肽（多肽 31–36）。

结合特异性：流式细胞术显示，包含二硫键的环肽 多肽 36 区分活化 T 细胞（高表达 PD-1）与未活化 T 细胞的能力最强（ $P < 0.0001$ ）。SPR 测得其与人 PD-1 蛋白的结合亲和力常数 $K_D$ 为 14 $\mu$ M，且该结合信号能被天然配体 PD-L1 竞争性抑制。
小分子药物筛选：利用多肽 36 的免洗荧光读数，作者对 9 种免疫相关药物进行了表型筛选。结果显示，调节胆固醇代谢的药物阿伐麦布（Avasimibe）呈现出明显的剂量依赖性下调活化 T 细胞表面 PD-1 表达的效果（10–50 $\mu$ M 下 MFI 显著下降，且无细胞毒性），同时 ELISA 检测显示其显著降低了活化 T 细胞的 TNF 释放量。

Fig. 4: Synthesis and evaluation of fluorogenic peptides for activated T cells.#

Fig. 5: Fluorogenic peptide 36 identifies avasimibe as a modulator of PD-1 expression in human activated T cells.#

结论的价值、适用范围与边界#

这项工作的价值主要体现在以下几个层面：

提供了通用的生色氨基酸制备方案：以往很难将高亮度的近红外染料和恶嗪类染料改造成稳定的开-关型氨基酸，该方法通过单一的色氨酸 C–H 活化偶联策略，把不同波段的亮荧光团直接转化为免洗探针构建单元。
机制解释较为完整：文章结合了基态与激发态的量子化学计算，较好地厘清了不同共轭程度分子分别走 PeT 还是 TICT 的物理图像，对后续设计其他染料（如花菁染料）具有参考价值。
建立了免洗的免疫细胞筛选模型：基于近红外多肽 36 构建的流式筛选平台，无需抗体染色和洗涤步骤，能够直接从表型上监测活细胞表面的免疫检查点蛋白丰度变化。

但这项工作的数据和方法也存在明确的局限性与边界：

合成收率普遍偏低：在微波辅助的钯催化偶联步骤中，多数生色氨基酸的分离收率在 15% 到 28% 之间（仅 BODIPY-AA 达到 74%），且部分需要重复补加催化剂和添加剂，对规模化放量合成存在一定工艺成本。
BODIPY 骨架的酸稳定性缺陷未解决：BODIPY-AA 依然无法耐受多肽固相合成常用的高浓度 TFA 裂解液，这限制了它在常规多肽合成中的通用性。
多肽亲和力处于微摩尔级：先导多肽 36 对 PD-1 的结合常数 $K_D$ 为 14 $\mu$ M，这一亲和力在多肽配体中属于中等偏弱水平，主要适用于细胞表面高丰度受体的快速染色，若用于体内成像可能面临亲和力不足和体内清除快的问题。
药物筛选仍属于体外表型初筛：阿伐麦布下调 PD-1 表达的现象仅在健康人外周血分离的活化 T 细胞体外模型中得到验证，其更深层的细胞内信号调控通路以及在体内肿瘤免疫微环境中的实际干预效果，文献中尚未进行动物实验层面的验证。

参考文献：Wong, M.S., Mendive-Tapia, L., Karmakar, U. et al. A general strategy towards multicolour fluorogenic peptides for wash-free bioassays. Nat. Chem. (2026). https://doi.org/10.1038/s41557-026-02228-0 #

【Nat.Chem.】一招鲜，吃遍天，通过色氨酸与多种常规荧光团偶联构建出覆盖紫外至近红外的全色系荧光免洗探针