想看清深层组织里的细菌，为什么这么难？#

在糖尿病等代谢性疾病中，宿主的免疫功能失调和微循环障碍会大幅增加细菌感染的风险。要想搞清楚病理状态下细菌在活体内究竟是怎么迁移、怎么定植的，最直接的办法就是用荧光照着它看。然而现实操作中一直有个硬伤：传统基因工程标记细菌可能会改变细菌自身的生理活性；生物正交化学虽然能把“标记”和“成像”在时间和空间上分开，但配套的荧光染料大多工作在近红外一区，组织穿透深度远远不够。如果把波长拉长到穿透力更强的近红外二区（1000 到 1700 纳米），分子又会撞上无辐射跃迁速率随能量间隔减小而呈指数级上升的“能量间隔律”墙壁，导致荧光量子效率断崖式下跌。

给分子骨架“做减法”与“做加法”：IFPy如何把发光亮度提升66倍#

为了破解近红外二区染料“波长拉长了、亮度却没了”的死局，研究团队没有沿着传统花菁染料（如印哚氰绿 ICG）的修饰老路继续走。在先前将电子供体替换为硅杂氧杂蒽的工作基础之上，作者这次做出了更彻底的骨架重构：删除了传统氧杂蒽结构中的杂原子，并将更平整、共轭程度更高的氨基芴结构融合进花菁染料的骨架中，构建出一种全新的杂化花菁染料（命名为 IF 系列）。

这种设计的核心考量，在于利用刚性的氨基芴骨架来削弱分子的振动耦合强度，同时增强分子在激发态下的芳香性。作者合成了一系列带有不同取代基的分子（IFM、IFPy、IFPi、IFQ），随着取代基推电子能力的增强，荧光发射峰在近红外二区逐步红移，覆盖了 1044 到 1102 纳米 的范围。

在这一系列分子中，IFPy 展现出了极其优异的综合光学性能。在保持 1054 纳米 近红外二区发射的前提下，IFPy 的量子效率相比 IFQ 提升了 49 倍（从 0.01% 提升到了 0.49%），摩尔消光系数达到 92,070 M⁻¹cm⁻¹（为 IFQ 的 1.34 倍），整体发光亮度达到了 451.14 M⁻¹cm⁻¹，比 IFQ 提高了 66 倍。与作者团队先前研发的硅杂氧杂蒽染料相比，IFPy 的量子效率也提升了 4.2 倍，亮度提升了 6.6 倍。在 808 纳米 激光（功率 0.6 W）的持续照射下，IF 系列染料的耐光照稳定性显著优于临床常用的 ICG 染料。

Scheme.1 Molecular design strategy and applications of the bioorthogonal NIR-II imaging.

Fig.1 (a) Molecular structure of IF dyes. (b)The normalized absorption and fluorescence intensity of IF dyes. (c) The relationship between absorbance and relative fluorescence intensity of IF dyes and IR26. (d) The quantum yield of other molecules relative to the enhancement factor of IFQ. (e) The photostability of IF dyes compared to ICG.

超快光谱揭秘：发光变亮不是因为能量散得慢，而是辐射跃迁变快了#

分子变亮了是事实，但作者需要回答一个更深层的物理问题：量子效率的提升，究竟是因为抑制了非辐射耗散（把能量留住），还是因为加快了辐射跃迁（把光发出来）？

为了查明机制，作者借助飞秒瞬态吸收光谱对这四个分子的激发态动力学进行了测量。测试结果表明，这四个分子的激发态寿命都很短，全部集中在 16 到 17 皮秒（例如 IFPy 为 16.44 皮秒，IFQ 为 17.06 皮秒）。结合寿命与量子效率的换算公式，作者算出了各自的速率常数。

数据显示，四个分子的非辐射跃迁速率常数几乎处于同一个数量级，均在 $6 \times 10^{10}\text{ s}^{-1}$ 左右；但辐射跃迁速率常数却相差悬殊。IFQ 的辐射跃迁速率常数低至 $5.86 \times 10^6\text{ s}^{-1}$，而 IFPy 的辐射跃迁速率常数达到了 $2.98 \times 10^8\text{ s}^{-1}$，整整高出了两个数量级。这一证据清晰地表明，改变取代基并没有改变分子振动松弛或内部转化等非辐射耗散通道，量子效率剧烈翻倍的根本原因，在于立体阻碍与分子内电荷转移效应的调控成功拉高了辐射跃迁的概率。

Fig.2 (a) 2D mapping of fs-TA spectra of IFM (a1), IFPy (a2), IFPi (a3), and IFQ (a4). (b) Detailed TA spectra at the 1–100 ps time range of IFM (b1), IFPy (b2), IFPi (b3), and IFQ (b4). (c) Corresponding TA kinetic fit result of IFM (c1), IFPy (c2), IFPi (c3), and IFQ (c4).

生物正交“接头”：怎样把发光分子无感挂到细菌壁上#

有了高亮度的分子，下一步是如何用它在体内标记细菌。作者采用了代谢标记与环炔烃-叠氮无铜点击化学结合的策略。

具体做法是，先将带有叠氮基团的 $D$-型氨基酸（$D$-Ala-$\text{N}_3$）提供给细菌。由于细菌在合成细胞壁肽聚糖时需要摄入 $D$-型氨基酸，叠氮基团就被顺理成章地嵌入到了细菌的细胞壁外层。随后，作者将 IFPy 分子衍生化，挂上二苯基环辛炔（DBCO）官能团，制成 IFPy-DBCO 探针。当探针遇到带有叠氮标记的细菌时，DBCO 与叠氮基团会在生理条件下自发发生生物正交点击反应，把荧光团牢牢锁在细菌表面。

为了验证这一标记策略的专一性，作者在体外用金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）和大肠杆菌（革兰氏阴性菌）进行了对比。革兰氏阳性菌能够直接被有效标记，而革兰氏阴性菌由于拥有双层膜结构，阻止了 $D$-Ala-$\text{N}_3$ 深入肽聚糖层。在使用氨苄西林钠预处理破坏其外膜后，流式细胞术检测显示，大肠杆菌的阳性标记比例恢复到了 64.2%。这直接证明了荧光的产生高度依赖于细胞壁肽聚糖合成过程中的代谢掺入，而不是分子的无差别非特异性吸附。

Fig.3 (a) Concentration-dependent imaging under different long-pass filters. (b) The fluorescence images in capillary tube after covering 1% fat emulsion of different thickness. Imaging of the (c, d) hindlimb vasculature, (e–g) abdominal vessels, and (h, i) lymphaden. Fig.4 (a) The schematic diagram of bacterial pretreatment for confocal imaging and flow cytometry. The confocal imaging (b) and flow cytometry analysis (c) of different groups with or without Cy5.5-DBCO (20 µM) in PBS buffer. (i) (−), N3 (−), probe (−); (ii) (−), N3 (−), probe (+); (iii) (−), N3 (+), probe (−); (iv) (−), N3 (+), probe (+); (v) (+), N3 (+), probe (+).

糖尿病小鼠体内：肠道菌群的迁移速度明显加快#

在明确了标记机制后，作者将 IFPy-DBCO 标记的菌株通过灌胃方式引入正常小鼠与糖尿病小鼠体内，利用近红外二区成像系统动态观察菌群在肠道中的移动规律。

成像结果展现出了非常显著的生理差异。在正常小鼠体内，标记的细菌在灌胃后 3 小时 内大部分停留在小肠区域，直到约 5 小时 才逐渐到达盲肠。而在糖尿病小鼠体内，菌群在极短时间内就快速推进到了盲肠，盲肠部位的轮廓在早期成像中就已清晰可见。离体器官分析进一步证实，在 5 到 7 小时 的观察窗口期内，糖尿病小鼠回肠和盲肠部位的荧光信号持续保持在较高水平，这揭示了糖尿病导致的肠道屏障功能障碍和高血糖环境确实显著改变了肠道菌群的物理定植与迁移动力学。

此外，作者还将 IFPy 制备成纳米颗粒（IFPy NPs），用于小鼠血管与淋巴结的近红外二区成像。在 980 纳米 激光激发和 1100 纳米长通滤光片 条件下，后肢血管成像取得了高达 4.92 的信噪比，淋巴结成像的信噪比更是达到了 8.01，展现了该分子在深部组织成像中的高分辨率优势。

Fig.5 (a) Schematic diagram of metabolic labeling. (b) The synthesis route of metabolic labeling probe. (c)The HPLC data of metabolic labeling probe with (750 nm) or without (550 nm) D-Ala-N3. (d) Mechanism of the NIR-II-based fluorescence imaging of gut microbiota. Fig.6 (a) Scheme of the NIR-II fluorescence probe imaging of gut microbiota. (b) Imaging of labeled bacteria in mice at different time points after gavage. Intestinal imaging (c) and fluorescence intensity statistics of organs at 1 h (d), 3 h (e), and 5 h (f). Fig.7 (a) Schematic diagram NIR-II fluorescence imaging after continuous gavage in mice. (b) Imaging of intestinal at different time points after gavage. (i) AS (−), N3 (−), probe (+), (ii) AS (−), N3 (+), probe (+), (iii) AS (+), N3 (+), probe (+), (iv) AS (+), N3 (+), probe (+). (c–f) Fluorescence intensity statistics at different time points. Fluorescence intensity statistics of ileum (g) and cecum (h, i) from different groups of mice. (j) Plate images of intestinal bacterial colonies with different dilution ratios.

成果的边界在哪里：理性看待这项研究的局限#

客观来看，这项研究通过分子骨架调控成功将近红外二区荧光染料的亮度推上了新台阶，并在肠道菌群追踪中展现了极高的应用价值，但其中依然存在几个需要理性看待的边界和局限。

其一，虽然 IFPy 的量子效率相比 IFQ 提升了 49 倍，但其绝对量子效率仅为 0.49%。在近红外二区这个长波长区间，受限于能量间隔律，小于 1% 的量子效率在同类分子中已属优异，但从绝对数值来看，绝大多数吸收的激发光能量依然是以热能形式无辐射散失掉了。如何跨越绝对量子效率 1% 的门槛，依然是化学界需要面对的硬难题。

其二，代谢标记策略对革兰氏阴性菌的天然屏障较为敏感。实验中革兰氏阴性菌需要提前使用抗生素破坏外膜才能实现高效标记，这意味着如果在不干扰菌群生理状态的前提下对复杂且包含大量革兰氏阴性菌的内源性肠道菌群进行原位标记，该探针的标记效率可能会受到限制。

其三，在纳米制剂的应用中，通过动态光散射测得的 IFPy NPs 粒径为 140.97 ± 17.17 纳米，因样品准备过程中的干燥收缩，这一数值明显大于透射电镜下的测定值。作为纳米级成像试剂，其在体内的长期清除代谢路径以及在复杂组织中的积聚效应，仍需要更长时间跨度的安全性数据来支撑。

整体而言，这项研究并没有凭空创造一个完美无瑕的成像工具，而是通过严密的超快光谱学证据和创新的刚性骨架设计，为近红外二区荧光染料的开发提供了一条切实可行的路线。它让我们看到了用高亮度光强无创观察深部肠道菌群动态变化的可能性，同时也把“如何进一步提升近红外二区绝对量子效率”这一难题，更清晰地摆在了后续研究者的面前。