Light Sheet Microscopy#

Principle of Light Sheet Microscopy#

在光片显微镜中，样本通过一束薄激光光片进行照明以获取光学切片。显微镜通常包含两个正交的光学轴：一个用于生成照明光片，另一个用于检测发射的荧光。这两个轴被对齐，使得照明光片位于检测单元的焦平面上（见图7.1）。

当样本被激光光片照亮时，检测臂的整个焦平面都被照亮，从而实现即时的光学切片，这与共聚焦显微镜（第5章）中使用的缓慢逐点扫描形成对比。

光片的高度和厚度可以根据所需的光学切片程度以及照亮整个视场（FOV）的需要进行调整。由光片激发产生的荧光被非常高效地收集，因为相机的所有像素在整个曝光时间内同时收集光子。通过使用快速且灵敏的相机，样本可以在低光照条件下快速成像。因此，光片显微镜是一种理想的成像技术，能够在不产生有害光毒性的情况下捕捉动态发育过程，并快速高效地对大型、透明化的器官进行成像。

理论上，光片显微镜的横向分辨率等同于具有相同物镜的落射荧光显微镜，由物镜的数值孔径（NA）和荧光团的发射波长𝜆em决定（第2章，2.3.4节）。然而，在实际应用中，由于光学切片的作用，光片显微镜的对比度通常更好。光学切片的深度由光片的厚度决定。因此，即使使用低NA、低倍率的检测镜头（通常具有适合大型样本成像的大工作距离），也能获得高轴向分辨率。

Light Sheet Microscopy: Key Advantages#

光片显微镜相较于传统成像方式具有诸多优势。光片显微镜在生物科学领域取得成功的主要原因无疑是其显著降低的光毒性。传统的复合显微镜和共聚焦显微镜在成像时会照亮样本的整个体积，即使仅成像一个平面也是如此。更糟糕的是，当记录一个包含N张图像的Z轴堆叠时，整个样本会被激发光照射N次。相比之下，光片显微镜每次仅照亮一个图像平面。因此，在对整个样本进行堆叠成像时，每个平面仅被曝光一次，从而最小化光漂白和光毒性的风险。

在逐点扫描显微镜中，每个点依次曝光和检测，需要更高的激光功率，通常需要数秒的曝光时间才能获得一张图像。而在光片显微镜中，整个平面同时被照亮，整个视场内的光子在几毫秒的曝光时间内被并行收集。这一曝光时间比逐点扫描系统中每个像素的停留时间（通常为几微秒）长约千倍。利用快速且灵敏的电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）和科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机，可以在短时间内获取具有出色动态范围和信噪比的图像。与共聚焦逐点扫描显微镜不同，光片显微镜中荧光团饱和问题的影响较小。成像速度仅受限于相机技术和可用的荧光信号，可以在多种方式中加以利用。最重要的是，可以研究非常快速的三维现象，这些现象对于传统宽场显微镜来说过于复杂，无法重建，而对于共聚焦显微镜来说则太快 [15, 18]。

光片显微镜的快速记录能力也是成像大型散射物体的另一个关键优势。能够在几秒钟内记录整个Z轴堆叠，为从其他方向获取样本的额外视图提供了可能。物镜的经典水平布局特别适合这种多视图成像：由于样本垂直悬挂在两个光学轴的交点处，可以旋转而不会发生变形。其他成像方式通常速度太慢，而光片显微镜可以在几秒钟内获得多个视图，并将它们融合以重建整个样本，而不会产生伪影 [19]。通过合并两个正交或更多的视图，可以提高轴向分辨率，例如通过多视图反卷积，或者在成像无法从单侧光学穿透的大型样本时，增加体积信息的整体含量 [20–22]。

此外，正交几何结构提供了独立调整照明和检测臂的灵活性，以适应实验需求。因此，针对广泛的应用场景，开发了多种光片显微镜的技术实现方式，这些内容将在本章后面讨论。

Construction and Working of a Light Sheet Microscope#

生成光片通常有两种不同的方法：在选择性平面照明显微镜（SPIM）中，激光束通过圆柱透镜进行扩展和聚焦，形成光片（图7.2a）[4]。这种方法简单易行，广泛应用于快速、温和的低光照活体成像。另一种方法是数字扫描光片显微镜（DSLM）技术，通过扫描镜快速将光束扫过视场（FOV）来生成“虚拟”光片（图7.2b）[5]。这种方法提供了更大的灵活性，因为通过改变扫描幅度可以轻松调整光片的高度，通过改变入射激光束的直径可以调整其厚度。在这种情况下，由于是逐行照明，所以在任意给定时间点，只有最终图像的一部分被照亮，为了在相同时间内获得相同的荧光产量，样本暴露的局部光强比SPIM中高得多。虽然这可能导致荧光团饱和和更高的光漂白，但它适用于需要高激光功率的应用，例如双光子激发[23]、光束整形应用（如贝塞尔光束照明）[12, 24]以及结构化照明[25]。

在DSLM中，光片在其高度方向上具有均匀的强度分布，而在SPIM中，激光光束通过扩展和使用光阑裁剪来覆盖检测镜头的视场，导致强度分布不够均匀。然而，SPIM中获得的同时平面照明更适合高速成像应用，尤其是在使用电调谐透镜（ETL）和超快相机进行图像采集时，可以避免运动伪影。因此，在设计光片显微镜时，确定其应用场景以选择合适的光片生成方式至关重要。下一部分将详细介绍设计具有静态光片的光片显微镜设置。

Theory of Light Sheet Microscopy#

通过单个圆柱透镜可以轻松生成光片。其焦距和入射光束直径决定了光片的厚度和范围。虽然这种简单的设置可能足以在空气中生成单色光片，但它并不满足生物成像的要求。例如，理想情况下需要生成多个不同波长的重叠光片，并在水等浸没介质中工作。因此，建议使用针对所需浸没介质专门设计的、校正良好的物镜。因此，许多选择性平面照明显微镜（SPIM）装置不仅配备了水浸检测镜头，还配备了匹配的水浸照明镜头。光学系统需要设计成最后一个元件是物镜；圆柱透镜则放置在光束路径的更前端。此外，能够灵活调整光片的位置、方向和厚度也是很有必要的。因此，在光路中适当位置插入了反射镜和狭缝。接下来，我们将通过计算来选择合适的部件，设计一个包含圆柱透镜和物镜用于光片形成的SPIM装置。

照明臂的光路包括激光器和光束扩展器，可选地还包括光纤和准直器。准直后的光束被送入圆柱透镜（LCy），生成光片，然后被成像到照明物镜的后焦平面（BFP）。为了在样本处获得垂直光片，BFP中的光片需要是水平的。理想情况下，可以在BFP中放置一面镜子，以便精确调整光片的位置（使其位于检测平面的焦平面上）。由于照明物镜的BFP通常位于镜头外壳内部，无法直接接触，因此使用一对透镜组成的望远镜系统，将后焦平面成像到镜子上。这种布局不仅提供了对BFP的访问，还提供了对照明物镜焦平面的访问。通过反射镜和狭缝，可以轻松调整光束的尺寸和位置。以下几点对于获得薄且在整个视场（FOV）内均匀的光片非常重要。我们考虑一组四个透镜在样本室内形成光片：圆柱透镜（LCy）、两个透镜（LT1和LT2）以及照明物镜（OLi）。此外，假设直径为db的高斯光束照射到LCy上（见图7.2）。样本室中的光片形状如图7.3所示。光束在腰点处汇聚到2𝜔0，然后再次发散。一个方便衡量光片范围的指标是瑞利长度xR，它被定义为从腰点到光束扩展到√2𝜔0的平面之间的距离，即：

瑞利长度的计算公式为：

其中𝜔0是光片腰点处厚度的一半，𝜆是光束的波长，n是介质的折射率。我们还可以进一步近似（见图7.3）：

其中fIO是照明物镜的焦距，dBFP是物镜后焦平面中光束的宽度。高斯光束的总角扩散（以弧度计）与光束腰𝜔0的关系为：

从方程（7.2）和（7.3）可以得到：

将方程（7.1）中的𝜔0值代入，我们有：

从这个方程中，我们可以计算出在照明物镜的BFP处光束需要有多宽（dBFP），以获得长度为xR的光片。视场的宽度（沿x轴）应等于2xR，dBFP可以据此计算。换句话说，xR可以表示为：

其中Npx x是沿x轴的像素数，dpx是像素大小，MDO是检测物镜的放大倍数。

从图7.2中光路的俯视图来看，dBFP可以表示为：

其中db是入射圆形光束的直径，MT是放大倍数，fT1和fT2是照明物镜前望远镜的焦距。同时，从图7.2中光路的侧视图来看，光片的高度可以表示为：

其中fCy是圆柱透镜的焦距。我们引入了因子𝛼y，它描述了为了在光束高度方向上获得几乎均匀的强度分布而裁剪光束的程度。在仪器中，会引入一个光阑或狭缝来切断高斯光束的尾部。同样，也可以引入一个因子𝛼z来描述沿水平方向（沿z轴）裁剪光束以调整光片厚度的程度（水平裁剪光束会使光片变宽和变长）。𝛼的取值范围从1（完全打开）到0（完全关闭）。

从方程（7.6）和（7.7）可以得到：

dh是期望视场的高度，因此现在可以通过代入方程（7.4）中dBFP的值来确定望远镜的放大倍数MT。可以计算出入射光束的直径db，并选择合适的光束扩展器或准直器来获得所需的直径。

在数字扫描光片显微镜（DSLM）的情况下，光片的高度由扫描幅度调节，厚度由入射光束的直径决定。尽管光路中不包含圆柱透镜（见图7.2b），但SPIM和DSLM的其余计算是相同的。

Light Sheet Interaction with Tissue#

所有光学显微镜都会因光与样本之间的相互作用而产生伪影。激发光和发射光的散射与衰减是主要问题。当光通过密集的组织时，激发光会发生衰减和散射：在光片平面内的散射并不是问题，但沿Z轴的散射会导致光片厚度增加，从而失去Z轴方向的切片能力（见图7.4a）。选择合适的光片偏振方向对于减少这种效应至关重要：光片显微镜中的激光束是偏振的，而组织中的散射与偏振有关。这种效应可以通过使用半波片（𝜆/2片）旋转偏振方向来轻松观察。将偏振方向旋转并最大化平面内的散射，即面向从上方观察SPIM腔的观察者，可以获得正确的偏振方向。

激发光的衰减和发射荧光的减弱会导致图像出现条纹和斑驳的现象。尤其是在大型样本中，面向入射光片的样本部分具有更好的对比度和信噪比，因为信号在深入样本时会逐渐减弱（见图7.4a）。为了解决这一问题，可以从两个相对的方向对样本进行照明，从而在样本的两个半部分都获得良好的图像质量（见图7.4b）。需要注意的是，双侧照明最好以序列方式进行，每次照明记录一张图像。这两张图像可以直接合并，也可以在后期处理中合并。通过这种方式，面向照明的无像差部分得以保留，并对最终图像做出贡献。只有当样本足够透明，并且一侧的散射厚光片不会破坏另一侧的薄光片时，才建议同时从两侧进行照明。

激发光的吸收会产生伪影，例如在整个视场（FOV）中出现明亮和阴影条纹的区域（见图7.4c）。在光片显微镜中，由于是从侧面照明，这种效应尤为明显。为了解决这一问题，多方向SPIM（mSPIM）技术已被开发出来 [26]，它结合了双侧序列照明和光片旋转。通过使用共振镜在相机单次曝光期间以大约1 kHz的频率扫描光束约10度的角度，使光片旋转，从而实现视场的更均匀照明。通过这种方式，图像中的条纹和阴影大大减少，从而在整个样本中实现更均匀的图像质量（见图7.4c）。

3D Imaging#

到目前为止，我们已经讨论了如何使用光片显微镜获取样本的二维图像。然而，大多数生物应用需要三维成像。鉴于光片显微镜出色的光学切片能力、快速成像以及低光毒性，它非常适合用于快速三维成像。为了满足各种样本的需求，已经开发出不同的三维图像采集模式。

I. 通过沿检测轴移动样本获取Z轴堆叠
一种广泛使用的方法是通过沿检测轴移动样本，使其穿过静态光片，同时相机连续记录图像来获取Z轴堆叠（见图7.5a）。只有样本在移动，其他光学元件保持固定。这种方法确保光片在系统对齐后始终位于检测镜头的焦平面上，使其稳健且易于实现。连续移动样本而不是逐级移动，可以确保数据采集快速且平滑，伪影最少。需要保持样本的照明时间尽可能短，或者让电机移动得更慢，以减少在曝光过程中样本移动时光片的模糊和增厚。成像速度最终受限于电机的速度以及样本在不损害其生理特性的情况下可以被移动的速度。

II. 保持样本静止，扫描光片穿过样本
一种更近期的方法是保持样本静止，同时扫描光片穿过样本。这种系统的一个主要优势是与样本无关，即使是脆弱的样本也可以进行无接触成像。这种系统特别适用于那些无法嵌入琼脂糖等固体介质中，且需要在类似水的介质中进行正常生长和运动的样本。然而，当连续移动光片时，检测系统的焦平面需要与光片的移动同步，以保持荧光聚焦。或者，也可以扩展焦深以覆盖整个扫描范围，但这通常需要反卷积或牺牲横向分辨率。两种主要的远程聚焦方法如下：

a) 使用电动物镜
在这种系统中，使用快速且精确的短程移动台或压电驱动的移动台，快速来回移动物镜。当与用于扫描光片的振镜同步时，可以在不移动样本的情况下快速获取Z轴堆叠（见图7.5b）。尽管许多光片显微镜使用水浸物镜，但空气物镜更适合这种设置，以防止样本室泄漏并避免介质中的压力波。然而，使用电动水浸物镜进行果蝇幼虫的大脑和全动物成像已被证明是可行的 [27]。早期还开发了一种用于成像神经元的替代方法，其中产生光片的光纤与移动的检测物镜机械耦合，以确保光片与检测物镜的同步运动 [28]。

b) 使用电调谐透镜（ETL）
ETL是一种充满液体的可变形透镜，其曲率会根据电信号的变化而改变，从而改变其焦距并移动焦平面（见图7.6）。通过移动光片并调节ETL中的电流来远程重新聚焦检测光学元件，可以快速获取Z轴堆叠 [29]。在这种情况下，堆叠的深度与ETL的聚焦范围成正比。可以实现中等速度的大体积扫描。最终，这种系统的速度受限于荧光产量；目前已有每秒10,000帧的相机，原则上可用于实现每秒数百个体积的成像。对于成像高度动态过程（如斑马鱼心脏跳动和血流）所需的较小体积的高速扫描，已通过快速CMOS相机实现 [15]。

Multiview Imaging#

光学显微镜的成像深度受到激发光和发射光的衰减与散射的限制。因此，与照明和检测物镜相对的区域所记录的图像，其对比度和信噪比通常优于样本深处所获取的图像。如果能够调整样本相对于照明和检测轴的布局，将是一个显著的优势。在光片显微镜中，通过旋转样本可以从不同的视角获取Z轴堆叠图像。需要注意的是，这并非光片显微镜独有的特性。然而，成功对活体样本进行多视角成像的前提是高速采集。为了防止样本在发育过程中发生变化导致数据集不兼容，需要快速连续获取多个视角的图像。随后，将这些多视角的图像融合，以在三维空间中重建整个样本（图7.7a）。这种方法具有两大优势：一是对整个样本进行多方向照明和检测，从而在整个样本中提高图像质量和信息含量；二是可以将同一区域的不同视角图像融合，以提高数据的轴向分辨率。例如，理想情况下，一个数据集较差的轴向分辨率可以通过与之垂直的另一个数据集的良好横向分辨率来替代。

为了将从多个视角记录的Z轴堆叠图像进行合并，已经开发了多种计算方法。数据集的精确配准对于成功融合至关重要。理想情况下，用于定位和调整样本的微电机和旋转电机应具备高精度和可重复性，使得初始校准足以对后续数据集进行配准。否则，需要添加荧光珠作为标记点，或者利用样本内的核标记作为地标，以将不同视角的图像相互配准。通过匹配不同视角中的这些参考点，确定相邻视角之间的转换关系。随后，根据这些关系将不同视角的图像融合，以获得整个样本的三维重建（图7.7a）。基于多视角记录的点扩散函数的反卷积也可用于提高图像的轴向分辨率和对比度 [21]。通过在图形处理单元（GPU）上对采集到的数据进行重切片，并单独处理每个横截面，已成功实现了实时反卷积，这使得多视角采集在长时间延时实验中也能高效应用 [22]。另一种高效的方法是从每个视角中选择性地获取分辨率良好的部分（即照明和检测良好的象限），并将这些“良好”的部分拼接在一起，以重建整个胚胎，从而获得高信噪比的图像 [6]。通常，在延时记录开始时，不清楚哪个视角可能产生最佳数据。此时，可以进行多视角采集，将决策推迟，并在采集后删除质量较差的数据。

Different Lens Configurations#

一个典型的选择性平面照明显微镜（SPIM）装置由照明臂和检测臂组成，两者交叉处是一个充满水的样本室（见图7.8a）。水浸镜头是首选，因为它们减少了照明和检测过程中的界面数量；然而，照明和检测物镜的正交排列限制了镜头的选择。通常，高数值孔径（NA）的检测物镜体积较大，难以与正交放置的水浸照明物镜结合使用。因此，在许多情况下，需要使用空气照明物镜。幸运的是，低NA照明物镜（例如10×/0.3镜头）足以生成厚度仅为几微米的光片。

光片显微镜的一个显著优点是其设计的灵活性以及能够轻松定制以满足特定应用需求。近年来，光片显微镜已经实现了从单细胞到多细胞脊椎动物胚胎的成像，涵盖了从植物数天的生长到斑马鱼心脏每秒跳动数次的发育过程。照明和检测路径的正交光学布局通常被设置为水平方向，以成像大多数样本（见图7.8a）。在三镜头SPIM中，第二个相同的照明臂从样本的另一侧进行照明（见图7.8b）[26]。光片显微镜的设计启发了多视角成像的概念。同时，对大型生物样本进行多视角成像的需求也推动了光片显微镜更先进的实现方式。增加第二个检测镜头，使两个光片都与两个检测镜头的共享焦平面对齐，可以同时获得样本的两个相反视角（见图7.7b和图7.8c）[6–8]。

对于大脑成像[30]以及透明化组织的成像，当样本水平放置时，如在超显微镜（见图7.8d）[14]或单分子跟踪[31]中，垂直配置可能是更优的选择。对于培养细胞或需要安装在盖玻片上的任何样本，倒置配置（如diSPIM，见图7.8e）[9]或反射光片显微镜更为合适，反射光片显微镜通过扫描镜反射光束，通过同一个或相对放置的检测镜头进行成像（见图7.8f）[32]。

Sample Mounting#

与其他光学显微镜领域一样，光片显微镜的样本装载需要完成两大主要任务。第一个任务是在记录过程中保持样本的稳定，以避免图像模糊和畸变。第二个任务是尽量减少光的衰减和散射，通过使用折射率匹配且光学透明的装载材料来最大化分辨率和对比度。如果研究的是活体样本，样本装载的另一个任务是确保在实验过程中样本能够在最佳条件下不受影响地生存和保持良好状态。

由于光片显微镜成像的样本种类繁多，以及光片显微镜设计的多样性，需要采用完全不同的样本装载策略。至关重要的是，样本是活体还是固定（并可能经过光学透明化）决定了如何将其嵌入。对于活体样本，如果蝇或斑马鱼胚胎、培养组织或细胞，装载材料通常与水的折射率（1.33）相匹配。常用的策略是将样本嵌入固体或粘性凝胶中，如琼脂糖、植物凝胶或甲基纤维素。如果样本是固定的，使用折射率更高的装载材料（1.4-1.5）更为理想。可选的透明化溶液可以增加较厚固定样本的透明度，但也会对折射率产生影响 [33, 34]。其中一些溶液是有害的，不能与光学元件（或用户）接触，这需要使用封闭的样本室和空气物镜。

光片显微镜的样本装载与其具体技术实现密切相关。所有设计的一个共同要求是从至少两个正交方向（照明轴和检测轴）接近样本。一些光片显微镜类似于传统复合显微镜，使用通用显微镜主体（iSPIM）[9]，甚至有些使用同一个物镜进行照明和检测（反射光片显微镜、扫场共聚焦对齐平面激发显微镜）[32, 35]。这使得可以使用既有的装载协议，例如将样本装载在培养皿中。然而，许多光片显微镜的设计灵感来源于早期的水平布局，这与传统复合显微镜的设计大相径庭 [4]。样本悬挂在充满介质的腔室中，需要重新思考，并推动了新型装载策略的开发，以适应各种样本。广泛使用的有琼脂糖或植物凝胶制成的凝胶柱 [17, 36]，或充满介质的聚合物管或袋 [37]。许多这些协议不仅仅是复制现有的技术，而是能够实现新的实验类型。当嵌入琼脂糖柱或聚合物管中时，可以从最佳角度对样本进行成像 [15]，或者从多个角度重建样本 [6]。专门的装载协议还使得光片显微镜能够用于细胞培养、类器官和有机体 [38]，以及发育中的植物 [17]。

Recent Advances in Light Sheet Microscopy#

尽管SPIM具备快速多视角成像的能力，但对毫米级胚胎进行快速且高效的成像仍然是一个挑战。例如，在斑马鱼中，像胰腺、肝脏和肠道等内部器官很难以令人满意的分辨率被解析。现在需要定制的显微镜装置，以满足特定实验的需求，提供更好的穿透能力，同时不增加额外的光毒性。

为了抑制DSLM中的散射光，已经开发了多种方法。虽然这些方法使图像更加清晰，但同时也去除了部分（尽管是模糊的）信息。其中最受欢迎的解决方案是利用sCMOS相机的滚动快门 [39]。在这种模式下，光束在芯片上的位置与相机的滚动快门同步。通过选择合适的“狭缝”宽度，可以消除散射光。

近年来，人们已经尝试了多种方法来增加DSLM的穿透能力。双光子激发在共聚焦扫描显微镜中成功应用于增加穿透深度。激发的非线性特性允许去除小孔——这是共聚焦显微镜中深度组织成像的主要瓶颈。此外，更长的激发波长散射更少，能够更深入地穿透光学密集的组织。因此，在DSLM系统中实现双光子光片显微镜是直接的 [23]。尽管双光子激发提高了穿透能力，但激发效率低下以及光片散射和变宽时激发的突然损失等问题仍然存在，这使得定量分析变得困难。此外，潜在的光毒性增加需要仔细评估。

DSLM还提供了修改光束模式并探索替代光束轮廓（如贝塞尔光束或艾里光束）的机会。贝塞尔光束具有细长的核心，非常适合用于生成薄且长的光片。此外，这种光束对散射相对具有鲁棒性 [24, 40]。不幸的是，贝塞尔光束的细核心伴随着一系列环状结构，这些环状结构会导致大量不必要的焦外激发。通过共聚焦狭缝检测和双光子激发已经证明可以抑制这些环状结构。通过生成贝塞尔光束的线性阵列并使其相互干涉，可以消除这些环状结构并生成光学晶格（晶格光片显微镜 [41]）。这种超薄光片特别适合用于单细胞成像。

荧光是光片显微镜的先决条件，它能够选择性地标记特定组织。在许多尚未建立完善模型的生物中，缺乏转基因工具常常限制了活体成像研究，只能使用少数几种穿透能力较差的活体染料。荧光显微镜的另一个限制是它只能显示被荧光标记的结构；其他结构则（字面意义上）处于黑暗中。无法标记的结构就无法被可视化。因此，将其他成像模式纳入光片显微镜是可取的。通过利用光片显微镜中通常存在的明场照明，已经展示了如光学投影层析成像（OPT）等其他显微镜技术 [42]。这些互补的数据为了解样本的状态和阶段提供了宝贵的见解。

理想情况下，我们希望能够观察单个胚胎的发育过程，并能够接触到所有单独的组织、细胞器等。不幸的是，由于发射光谱的强烈重叠，我们目前还无法在单个样本中同时成像超过三到四种荧光颜色。纳米级精度的光谱检测已被用于分离全光谱中的多个组分，并区分多种颜色 [43]。在未来，我们可以期待能够提供多种模式的标记和成像技术，以尽可能多地从单个样本中提取信息。

Outlook#

Summary#

光片显微镜是一种出人意料地简单但又极具潜力的技术。其众多的实现方式展示了它的强大、多功能性和简洁性。低光毒性和高速成像的主要优势使得许多应用超出了传统荧光显微镜技术的范围。从长远来看，光片技术将受益于其经济性和易于定制的特点：显微镜可以“围绕样本”构建，从而为许多新颖且具有挑战性的应用提供最佳的成像条件和性能。然而，在某些情况下，实现照明和检测光学的双向访问可能较为困难。在这种情况下，单镜头解决方案可能会更胜一筹，尤其是对于传统的样本制备方式。

在未来，我们将看到许多新的应用，甚至在新的模型生物中也是如此。有一件事是确定的：我们已经更接近于对脆弱生物样本的非侵入性成像，而这可能已经是新发现的关键所在。