Super-Resolution Microscopy: Interference and Pattern Techniques#

Review: The Resolution Limit#

在成像系统方面，显而易见的是，系统的成像能力（即传递结构信息的能力）总是受到一定程度的限制。为了描述成像系统的成像能力，我们使用了“分辨率”这一术语。然而，这一术语的使用存在模糊性，且对于系统的分辨能力有不同的科学定义。

一个常用的分辨率衡量标准是瑞利勋爵（Lord Rayleigh）提供的定义，相关内容在第2章中有所描述。瑞利的定义基于光学系统的点扩散函数（PSF）（第2章2.3.3节）。

PSF类似于一个理想点状物体的成像。瑞利定义的分辨率是PSF的最大值与其最近零点之间的横向距离。其计算公式为：

当PSF在物平面上的每个位置都相同时，物的每个点都会被相同的PSF扩展。在许多显微镜应用中，这是一个合理的近似。可以想象显微镜就像一位艺术家，用画笔绘制物体的图像；只有当艺术家使用细小的画笔（即PSF较小时），物体的细节才会显现出来。从数学上讲，利用PSF作为“画笔”从物体A(x, y)绘制图像A’(x, y)的成像过程可以通过卷积来表示：

在第2章中，我们引入了光学传递函数（OTF）。OTF是PSF的傅里叶变换（FT）：

卷积定理表明，位置空间中的卷积对应于频率空间中的乘法，反之亦然。在这里及后续内容中，“频率”指空间频率，即沿空间坐标的调制。因此，通过对图像A’(x, y)和物体A(x, y)应用傅里叶变换，我们可以将成像过程（公式（9.2））描述为一种乘法：

PSF是带限的，这意味着OTF在截止频率k_cutoff之外的高频部分为零：

所有超出这一截止频率的物体信息都会在与OTF相乘的过程中被滤除，因此在图像中缺失。这种高频信息的缺失限制了成像系统的分辨率。

截止频率可以用作光学系统分辨率的衡量标准，作为瑞利标准的替代。

另一种基于物体频率的分辨率定义是阿贝（Abbe）[8]提出的。阿贝考虑了一个放置在显微镜下的精细光栅。能够被解析的最细的光栅图案（光栅间距为d_Abbe）定义了显微镜的分辨率。计算结果为：

对应的最高可传递频率（即截止频率）为k_cutoff = 2𝜋/d_Abbe。

在我们的案例中，瑞利标准（d_Rayleigh）和阿贝标准（d_Abbe）是相似的，并且给出了相近的数值。在接下来的段落中，我们将讨论如何通过操纵照明条件来突破这一分辨率限制的方法。

Image Generation in Structured Illumination Microscopy#

在本节中，我们将对结构化照明显微镜（SIM）中图像生成过程进行数学描述。

正如第9.1.1节和第2章所述，宽场显微镜的成像过程可以表示为：

其中，A’ 是图像，A 是物体。物体 A 是物体平面中发射荧光光的分布，而点扩散函数（PSF）则是冲激响应，使图像变得模糊。

当荧光饱和效应可以忽略不计（在常规荧光显微镜条件下），物体分布与照明强度 I_ill(x, y) 和荧光团分布 ρ(x, y) 成正比：

在传统宽场显微镜中，照明强度是恒定的，物体本质上是荧光团的密度。

然而，在SIM中，照明是空间变化的，并且这种变化会传递到图像中。对于双光束照明的情况（见图9.2a），照明分布可以表示为：

或者用位置向量 r 表示为：

调制强度 m 是一个介于0和1之间的标量值。当 m = 1 时，分布的最小值为零，最大值为 2I₀。强度调制发生在 x-y 平面内。为了在二维空间中表示这种调制，我们使用光栅的波矢 k_G，其中 |k_G| = 2𝜋/G_SIM，G_SIM 是调制的空间周期。k_G 指向调制的方向，即与图案的条纹垂直，并沿着物体平面。照明图案的横向位置由相位 φ 决定。

将公式（9.8）代入公式（9.7），得到：

现在，频率空间中的图像信息 Ã’ 可以表示为：

根据卷积定理，ρ 和 I_ill 的乘积在傅里叶变换后变为卷积：

这种傅里叶变换后的卷积（ρ̃ 与 Ĩ_ill）会导致空间频率的混合，最终可能实现光学分辨率的提升，接下来我们将以双光束干涉为例进行说明。照明图案的傅里叶变换（公式（9.10））为：

利用恒等式：

傅里叶变换后的照明图案 FT(I_ill) 可以表示为：

展开这个方程，得到：

使用狄拉克δ函数的指数形式：

照明图案的傅里叶变换可以表示为一系列带有复数系数的δ函数，这些系数取决于 φ：

其中一个δ函数位于原点（对应于传统荧光成像的情况），另外两个位于照明图案的倒易周期位置。

在傅里叶变换后的图像 Ã’(k) 中，这些δ函数与傅里叶变换后的物体分布 ρ̃(k) 的卷积会导致物体信息的多个副本在频率空间中发生位移，每个副本都乘以其对应的复数系数：

这些额外副本在频率空间中的位移距离由入射角 α 和入射光波的波矢 k 决定。

需要注意的是，光学传递函数（OTF）具有低通滤波特性（在成像过程中，OTF 与 FT[ρ × I_ill] 相乘）。由于这些图像副本的频率发生了位移，原本在截止频率 k_cutoff 之外的不可解析频率区域被移入了OTF的通带。这些频率信息与其它副本的信息叠加，并位于显微镜成像的频率区域内。因此，在图像采集后，需要将这些信息分离并移回到其适当的位置。分离和重建过程将在第9.2.2节中讨论。

如果能够在采集到的图像中分离出叠加的频率信息副本，那么这些额外副本可以被移回到它们原来的空间高频位置。显然，与原始图像相比，图像的频率区域在照明图案调制方向上得到了扩展。因此，通过这一过程，分辨率得到了提升，因为更高频率的信息被传递到了图像中。分辨率提升的倍数由图像频率区域扩展的倍数决定。

最终的频率区域大小取决于照明图案的周期。为了计算SIM可能实现的最大分辨率提升，应考虑最小可能的光栅间距。对于通过物镜照明的情况，当两束相干激发光（真空波长为 λ_0ex）在物镜接受锥的最大角度处相交时，达到最小光栅间距，即沿物镜的最大开口角照明。因此，最小光栅间距为：

这是阿贝定义的在透射光显微镜下物体平面中可解析光栅的最小光栅间距。

在荧光显微镜中，发射光的波长接近激发光的波长（λ_em ≈ λ_ex）。因此，最小可能照明图案的倒易光栅周期接近截止频率 k_cutoff。傅里叶变换后的照明图案的δ函数位于 -2𝜋/G_SIM 和 +2𝜋/G_SIM 的位置。因此，傅里叶变换后信息副本的起始位置被移至截止频率的极限（见图9.3b）。当这些副本被分离并移回时，频率空间中可访问的信息区域是传统显微镜情况下的两倍。因此，线性SIM的分辨率提升倍数可以达到2。

这里使用“线性”一词，是因为在这种情况下，荧光发射强度被认为与激发强度呈线性正比关系。

在常规显微镜条件下，饱和和光漂白效应通常可以忽略不计，荧光响应与激发强度的线性关系假设是成立的。饱和和光漂白效应会导致发射响应梯度随着激发强度的增加而减小。研究表明[9, 10]，这种非线性效应可以通过应用适当的装置条件（例如，特殊的荧光团和匹配的激发强度）来最大化，从而将SIM的分辨率提升倍数提高到超过2。在这种情况下，从荧光团分布获得的有效荧光发射图案不仅包含周期性照明强度图案（见图9.3），还包含基本图案的更高谐波（未显示）。在频率空间中，更高谐波将图像信息沿基本图案的位移方向移动了两倍、三倍或更多。

线性SIM的两倍分辨率提升可实现约100纳米的横向分辨率[11]，而宽场显微镜和共聚焦显微镜分别可实现约230纳米和180纳米的横向分辨率[12]。

然而，当使用仅在光学平面（即焦平面）的一个方向上调制的照明图案时，分辨率提升是各向异性的，仅在调制方向上达到最大值（见图9.3c）。为了实现更各向同性的分辨率，需要在光学平面内沿多个方向应用调制方向（见图9.3d）。

理解SIM提供的分辨率提升效果的另一种方法是考虑莫尔效应，如图9.4所示。当两个细光栅叠加时，会产生一个具有更大空间周期（或光栅间距）G₃的第三粗光栅。如果已知其中一个细光栅的空间周期 G₁ 以及最终图案，而第二个细光栅 G₂ 是未知的，那么可以通过数学方法重建未知图案。

已知的细光栅和未知的细光栅分别代表SIM的激发图案和高频物体信息，而粗光栅则代表检测到的图像。

Extracting the High-Resolution Information#

当应用结构化照明时，通过物镜传输的总空间频率信息会增加。然而，如第9.2.1节所述，这些额外的信息会与原始图像信息叠加。

因此，需要将这些额外的信息分离出来，并将其移至频率空间中的正确位置。为了分离这些成分，需要获取几张照明图案处于不同位置（相位φ，见公式（9.10））的图像。通过这种方法，可以根据不同光栅位置依次计算出图像副本的复数系数（1，(m/2)e^iφ 和 (m/2)e^-iφ，见公式（9.20））。随后，可以通过相应的系数将属于各个副本的图像信息分离出来。在双光束干涉的情况下，只需要三张光栅位置不同的图像即可解方程；而在三光束干涉的情况下，则需要五张图像。

分离后，可以通过照明光栅的倒易矢量将图像信息的副本移至正确的位置。当将不同副本的正确处理后的信息相加时，得到的图像相比原始图像具有更高的分辨率。

如前所述，如果照明图案的调制仅在横向方向上是一维的，那么焦平面内的分辨率提升将是各向异性的。

然而，为了实现近乎各向同性的分辨率提升，在这种情况下，需要拍摄一系列不同角度的周期性照明图案的图像，通常为0°、60°和120°（见图9.3d），或者为0°、45°、90°和135°。

从数学上讲，也可以使用产生六边形图案的二维（2D）光栅来生成激发光的衍射级次。

Optical Sectioning by SIM#

在结构化照明显微镜（SIM）中，不仅如前一段中二维示例所示的横向分辨率相比传统宽场显微镜有所提升，而且共聚焦特性也可以得到改善，从而实现光学切片，减少焦外区域的信号。

当考虑宽场显微镜的光学传递函数（OTF，见图9.1）时，这种效果就变得清晰了。对于空间频率k_x、k_y = 0且k_z ≠ 0的情况，OTF始终为零。在OTF中，围绕光轴频率k_z的锥形频率区域是缺失的。相应的信息无法通过显微镜传输。这种“缺失锥”问题导致传统显微镜的z轴分辨率无法很好地定义。

如图9.5所示，SIM提供的额外物体信息副本能够覆盖原始OTF的缺失锥区域，因此相比传统荧光显微镜，SIM的光学切片能力得到了提升。然而，在双光束照明的情况下（见图9.2a、c和图9.5a、c），只有当照明图案的频率（略）小于截止频率时，共聚焦特性才会得到改善。在截止频率处，缺失的锥体会重叠，因此仍然无法被覆盖。

与横向分辨率一样，量化显微镜的轴向分辨率也较为困难，因此找到一个合适的模型来计算或测量不同显微镜方法的可比定量值至关重要。例如，可以使用三维点扩散函数（PSF）在轴向维度上的半高全宽（FWHM）作为衡量标准。然而，这个z方向的FWHM取决于x和y的位置（见图2.12和图9.12）。

在Karadagić和Wilson[13]的研究中，通过一个位于焦平面的薄荧光片模型，比较了两种不同SIM装置和共聚焦显微镜的光学切片能力。研究比较了这些显微镜确定薄片z位置的能力。

结果显示，无论是双光束干涉（条纹投影）还是三光束干涉（网格投影）的SIM，其光学切片能力都与共聚焦显微镜相当。然而，三光束干涉相比双光束干涉提供了更好的光学切片能力。尽管如此，双光束干涉只需要在三个不同的相位位置采集单张图像，而三光束干涉需要在五个不同的相位位置采集图像。由于使用的物体信息副本较少，双光束干涉对原始数据中的噪声也更不敏感。

究竟双光束照明还是三光束照明更优，最终取决于被分析的样品。双光束干涉常用于通过其他方式实现切片的场景，例如通过全内反射荧光照明，或者当样品较薄时。

How the Illumination Pattern is Generated?#

为了实现结构化照明，需要产生如图9.2所示的照明条件，这需要多个相干光束。为此，目前已经开发出两种基本技术：一种是应用衍射光栅（见图9.6a），另一种是使用干涉仪（见图9.6b）。在第9.2.6节中，展示了这两种方法的示例。

这两种技术在照明图案的周期与激发光波长之间的关系上有所不同（见图9.6）。

在采用衍射光栅的装置中，光栅的像被投影到物体平面上。因此，照明图案的空间周期与照明光的波长无关。这意味着照明光不需要是相干的，可以使用非相干光源（例如气体放电灯或发光二极管（LED））来代替激光。

相比之下，在干涉仪装置中，照明图案的周期与光的波长成正比。波长越长，图案越稀疏。在这种情况下，为了产生周期性的强度图案，光源必须是相干的（见图9.6b）。对于干涉仪装置，激发光束的角度仅取决于干涉仪的角度。如果根据物镜的数值孔径（NA）将这一角度设置为合适的值，那么对于不同的激发波长，无需调整干涉角度。而对于衍射光栅装置，如果激发波长发生变化，可能需要更换光栅。如图9.6a所示，红色光束击中物镜的最外边缘，而蓝色光束则更靠近物镜的中心。

Mathematical Derivation of the Interference Pattern#

在照明图案的公式（公式（9.9））以及由此推导出的陈述中，使用了一个变量调制强度 m。为了探究调制强度的大小，接下来将计算双光束干涉SIM装置中的干涉图案。假设两束初始光具有相同的强度，并且具有相同的线性偏振 p₀。右侧光束相对于左侧光束有一个相位偏移 φ。

在以下计算中，使用复指数形式代替三角函数形式来表示叠加的波。两束光在通过物镜之前沿z方向传播，且传播方式相同。在此过程中，左侧光束围绕y轴倾斜角度 α，右侧光束倾斜角度为 -α（见图9.7），这会影响光束的偏振。

在通过物镜之前，左束和右束的电场分别为：

偏振矢量是一个单位矢量（|p₀| = 1），指向电场振荡的方向。

原始波矢 k₀ 指向z方向：

在物镜之后，光束的旋转偏振由下式给出：

通过应用围绕y轴的旋转矩阵 R_y。

同样的旋转也适用于波矢，得到：

在物体平面上，两束光的叠加为：

强度与电场的绝对平方成正比：

其中 a 是比例常数。将公式（9.31）代入公式（9.32）中，强度变为：

经过一些重新排列后，代入波矢 k_l 和 k_r（公式（9.27）和（9.28）），得到：

显然，当 p_lp_r = m 和 2aE₀² = I₀ 时，该表达式与双光束干涉SIM显微镜的照明图案（公式（9.9））一致。

当双光束干涉SIM装置中的两束干涉光强度相等时，调制强度取决于光束的初始偏振以及物镜对光束的偏转角度 α。为了研究这些效应，我们比较了两种极端的线性偏振情况：与干涉仪平面垂直（s）的偏振和与干涉仪平面平行（p）的偏振（见图9.7）。干涉仪平面是由两束光所张成的平面。

如果入射光束的偏振方向垂直（s）于干涉仪平面，那么光束（p_l、p_r）的偏振在通过物镜时（应用 R_y(α) 和 R_y(-α)）不会改变，调制强度 m 为 1（见图9.8a）。对于与干涉仪平面平行（p）偏振的光束，由于光束角度的变化，左侧光束的偏振方向旋转了 α 角，右侧光束的偏振方向旋转了 -α 角。当 p 偏振且 α = 45° 时，两束光的偏振方向（因此电场方向）相互垂直。调制强度 m = p_lp_r 变为零，物体平面上的强度变为常数（见图9.8b）。

通常，在SIM图像采集过程中，干涉仪平面会围绕光轴旋转到不同角度（通常为0°、60°和120°）。为了在所有角度下实现高调制强度，激发光的偏振方向需要随着图案旋转，以确保在每种情况下都能实现 s 偏振。这可以通过使用可旋转的半波片或电光调制器来实现。

Examples for SIM Setups#

在结构化照明显微镜（SIM）中，焦平面内的激发强度呈现周期性图案。为了实现这种照明分布，已经建立了多种装置。通常情况下，激发光通过用于检测荧光的同一物镜进行投影，以产生驻波场，尽管也可以使用其他照明技术，包括额外的光学设备甚至近场激发。

最常见的SIM显微镜使用物理光栅[6, 7]或由空间光调制器（SLM）[14, 15]在中间像平面生成的合成光栅，在物体平面中创建调制图案（见图9.9）。

基于光栅的SIM通常设置为只有±一阶衍射光束进入物镜。虽然可以使用更高阶的光束（五束或更多光束干涉），但这会导致傅里叶变换后的物体信息副本分离更加复杂，并且由于副本数量增加，信噪比会降低。可以选择性地阻挡零阶衍射光（未衍射光束），以实现双光束干涉；而使用零阶、正一阶和负一阶光束则对应于三光束干涉的情况。

通过在中间像平面中移动衍射光栅，可以改变物体平面中干涉图案的相位（即位置）。为了改变图案调制的方向，可以围绕光轴旋转光栅。

或者，如前一节所述，可以使用二维光栅在物体平面中沿多个轴生成调制图案。

当使用空间光调制器（SLM）时，可以通过在SLM上显示不同的光栅来移动和旋转图案。科学级SLM通常由液晶阵列组成，用于单独调节每个像素的偏振和/或相位（普通的液晶显示器（LCD）也是一种SLM）。

快速SLM在速度上优于物理光栅，并且更加灵活，因为光栅的晶格间距可以轻松调整以适应使用的波长。然而，物理光栅相比SLM也有一定的优势。光栅在通过时对激发光的强度损失更小，并且相位受空间变化相位误差的影响更小，从而在物体平面中产生更强的强度调制图案。

另一种方法是使用干涉仪装置来产生相干光束，并将其引导至物镜。一种特定的干涉仪装置[16]（见图9.10）基于特威曼-格林干涉仪，这是迈克尔逊干涉仪的一个特例，使用了准直且展宽的光束。所使用的干涉仪由一个分光立方体和两个相对的镜子组成。

这种装置基于一个反向应用且专门设计的显微镜。激发激光束被导向一个50%的分光立方体（见图9.10，立方体A），该立方体位于聚焦透镜的焦点处。光束的一半被反射90°，另一半则穿过立方体且方向不变。随后，这两束光通过镜子反射180°重新进入立方体。当光再次通过分光立方体时，会产生两束光，每束光的强度为原来的四分之一，其中两束光离开立方体并被引导至聚焦透镜。如果分光立方体围绕垂直于桌面的轴旋转一个角度θ，一束光将偏转2θ，另一束光将偏转-2θ。因此，通过旋转分光立方体可以调整干涉图案。光束通过聚焦透镜后，被二向色分光镜反射至物镜。经过聚焦透镜和物镜后，两束光在物体平面中的干涉会产生一个与物体平面平行调制的正弦图案。通过围绕地面平行且垂直于前一个旋转轴的轴旋转分光立方体，可以改变调制的方向。因此，可以生成具有任意周期和方向的正弦干涉图案，这使得可以根据特定任务和波长调整图案的周期。可以使用网络摄像头直接监测干涉图案。该显微镜还提供了使用第三束光的选项，这束光不偏转且位于两束外偏转光的中心，以产生三光束干涉图案。提取中心光束（C）的分光立方体位于其他分光立方体之前。通过改变各光束的相对相位可以改变图案的相位。为了准确且快速地实现这一点，压电执行器被安装在面对可旋转分光立方体（A）的镜子上。

Overview#

SMI（空间调制成像）是一种可用于沿光轴方向对小荧光物体进行精确尺寸测量的显微镜技术。

在SIM（结构化照明显微镜）中，激发光来自一个物镜，干涉图案分布在焦平面（例如，x-y平面）内。而在SMI显微镜中，使用来自两个相对物镜的两束反向传播的光波（见图9.11）。样品位于两个物镜之间，两束光在此处形成驻波图案。在这种情况下，干涉图案仅沿光轴方向（z方向）出现。

由于两束光是反向传播的，干涉图案的条纹间距 d 非常小（即频率很高）。与SIM类似，图案越精细，分辨率越高。当考虑得到的OTF（光学传递函数，见图9.12b）时，与SIM的图9.3和图9.5类似，在SMI的情况下，OTF的副本在空间频率的z方向上发生了较大的位移。这些OTF副本与中心的宽场OTF没有重叠，这意味着得到的OTF所支持的频率区域并不是连续相连的。尽管显微镜能够传输轴向上非常高分辨率频率的信息（图9.12b中的虚线结构），但中间的大片频率区域的信息是无法获取的。

因此，与SIM不同，这种方法无法生成无伪影的高分辨率图像，因为大量中等分辨率的信息丢失了。

因此，使用SMI显微镜时需要对分析的样品有一定的先验知识[17]。然而，这种方法可以对小物体沿光轴方向的尺寸和位置进行测量，其精度远超衍射极限——通常可达40纳米。

SMI Setup#

典型的SMI（空间调制显微镜）装置如图9.13所示。为了产生两束相干且平行的光束，一束准直的激光束通过分光棱镜被分成两束。每束光分别通过一个与物镜配合的额外透镜，其中透镜的焦平面位于物镜的后焦平面。这种配置将物镜和聚焦透镜转变为准直器。通过这种光学装置，可以在物镜之间沿光轴方向产生正弦波形的干涉图案。样品放置在两个物镜之间，并可以通过干涉图案沿光轴方向移动。检测方式类似于传统的宽场荧光检测，由一个物镜完成，并通过一个二向色镜将激发光与荧光信号分离。在图像采集过程中，样品以精确的轴向步进（例如，每次移动20纳米或30纳米）通过驻波场。在每个步进位置，都会记录一张荧光图像。

Excitation Light Distribution#

位于物体平面的驻波条纹周期取决于激发光波长 λ、样品和载玻片的折射率 n，以及光束相对于光轴的可能倾斜角 θ（见图9.11）。

接下来，我们将推导强度分布的数学表达式。

两束反向传播的相干电磁波 El 和 Er 在焦区内发生干涉。假设这两束光具有相同的振幅 A，并且它们可能围绕y轴旋转角度 θ。通过右侧物镜的光束（见图9.13）相对于左侧光束有一个相位延迟 φ。结果产生了一个周期性的驻波场 Es，其强度分布为 Is。

SMI干涉图案的强度分布可以通过双光束干涉SIM的图案公式（公式（9.33））推导得出：

在SMI的情况下（见图9.11），两束光的波矢分别为：

其中 k 是波矢 k 的绝对值。

偏振方向被认为与y轴平行（s偏振）：

强度分布为：

通过改变干涉仪的光程差 φ，可以实现照明图案的相位移动。波矢 k 的模 k 通过介质的折射率 n 进行扩展，因为光的波长与 n 成反比：

通过公式（9.35），可以推导出图案在z方向上的光栅间距 GSMI：

这意味着，对于厚度大于 GSMI 的样品，多个干涉条纹会位于该体积内，因此可能无法区分唯一的相位位置。无论图案的实际相位如何，照明图案的多个最大值可能同时位于样品的深度内。

对于倾斜角小于10°（cos θ ≈ 1）且校准良好的系统，公式（9.44）中的余弦项可以忽略不计。得到的条纹周期与真空波长 λ₀ 除以2倍折射率成正比。如果使用高折射率的浸没介质，n 大约为1.5。在这种情况下，条纹间距为 λ/3。因此，488 nm的激发波长将产生约163 nm的条纹间距。这意味着激发图案的强度分布每163 nm有一个最大值。当将这个值与焦深（对于数值孔径为1.4的物镜，焦深约为600 nm）进行比较时，可以看出焦深内有多个强度最大值（见图9.12a）。因此，可以从经典分辨率极限之外的高分辨率区域获取信息。接下来的章节将对此方法进行描述。

Object Size Estimation with SMI Microscopy#

当样品通过检测物镜的焦点移动时，会产生两种主要效应。一方面，由于激发图案的干涉，检测到的强度会被调制，而调制对比度取决于物体的尺寸。另一方面，焦点内和焦点外的物体之间存在强度变化。

SMI（空间调制成像）数据分析主要基于这两种效应。宽场显微镜沿光轴的轴向点扩散函数（PSF）由sinc²函数给出（见第2章）。由于双光束干涉，激发强度分布由cos²函数给出（公式9.10）。

当照明图案固定在物体平面，且一个点状物体沿z方向移动时，两种效应会叠加。由于照明图案的存在，照明强度会呈现正弦变化，同时物体的图像会穿过焦点。因此，激发图案和宽场PSF相乘，形成了最终的空间调制成像点扩散函数（SMI-PSF）（见图9.14）。图9.12展示了三维SMI-PSF及其对应的光学传递函数（OTF）。

轴向SMI-PSF以sinc²函数为包络线，并被cos²干涉图案调制。在这个无限小点状物体的例子中，调制对比度 R = 1。调制对比度 R 的定义如下：

其中，I_max 和 I_min 分别代表SMI-PSF内外包络线的最大和最小强度值。换句话说，检测到的轴向强度分布（AID）是激发光调制的小条纹与物镜轴向检测的包络函数的重叠[19]（见图9.14）：

在这个公式中，k₁ 表示包络函数的半高全宽（FWHM），k₂ 是驻波场的波矢，a₁ 表示调制强度，a₂ 定义调制对比度。为了简化，公式中忽略了额外的相位偏移值和非调制参数。

当成像对象不是微小的点状物体，而是更大的物体时，调制对比度会小于1，并且会随着物体的尺寸和几何形状而变化[20-22]。在分析生物纳米结构时，通常假设物体为球形几何形状较为方便。图9.15展示了调制对比度 R 与球形物体直径的关系。显然，调制对比度曲线并非一一对应。对于给定的调制对比度，可能存在多个物体尺寸的解。对于某些特定尺寸的球形物体（例如，在488纳米激发波长下，物体尺寸为240纳米和415纳米时），调制对比度 R 为0。这意味着对于这些尺寸的物体，当照明图案穿过样品时，发射强度不会发生变化。

如果将SMI的应用限制在调制对比度大于0.18的情况，这对应于大约200纳米的物体尺寸，那么这种关系是一一对应的，因此可以用于尺寸测量。超过这个尺寸限制，可以使用传统显微镜来确定物体的尺寸。最小可测量直径受到调制对比度曲线形状和检测到的光子数量的限制。通常，SMI甚至可以高精度地测量大约40纳米的尺寸。

图9.15中的曲线是基于具有均匀荧光团密度分布的球形物体计算得出的[23]。如果物体相对于干涉图案较小，则检测到的荧光信号类似于图9.16a。当物体直径增加时（见图9.16b），调制深度会减小，但条纹间距保持不变，包络函数也大致保持不变。在极端情况下，当物体直径远大于条纹间距时，调制对比度 R 将消失。通过使用模拟的调制对比度曲线（见图9.15），可以从测量的调制对比度中提取出一个衍射受限物体的直径值。需要注意的是，这个值是在一些假设下计算得出的——特别是物体的几何形状需要预先定义——如果假设不正确，这个值可能与物体的“真实”尺寸有所不同。