Fluorescence Photobleaching Techniques#

One Principle, Several Modes#

光漂白技术依赖于显微镜技术与荧光技术的紧密结合。我们将首先探讨荧光的相关性，随后再讨论其在这一结合中的显微镜应用。

荧光具有高度的灵敏性和特异性，同时也是光化学操作（如光漂白）的重要手段。光漂白，也称为荧光衰减，是荧光团早已为人所知的一种特性，在荧光漂白恢复（FRAP）技术出现之前，它一直被视为一种纯粹的负面现象。当荧光团受到光照时，它们会吸收并重新发射光子，在基态和较高的单重态之间循环。在这个过程中，总存在一小部分概率，荧光团会进入一个长寿命状态，发生如氧化等化学反应，从而失去荧光性。光漂白的量子效率，定义为每个吸收光子导致光漂白的概率，在不同荧光团之间差异很大。对于经过光稳定性优化的有机染料，这一效率约为10^-6，而对于荧光蛋白，则仅为10^-5。因此，在光漂白发生前，一个给定荧光团平均能发射的最大光子数，即荧光量子产率与光漂白量子效率的比值，大致在50,000到500,000之间变化。

图11.1给出了一个通过FRAP进行侧向扩散测量的例子。稍后（在第11.3节和第11.5节中），我们将讨论如何通过这类实验定量评估动力学参数，如侧向扩散系数、结合常数和膜传输速率。图11.1所示的实验是使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行的。然而，在FRAP技术构想提出时，CLSM还未问世。相反，当时使用的是荧光显微镜，其中单一固定光束用于照明和光漂白，而光电倍增管则用于测量照明斑点的总荧光。使用此类仪器进行的FRAP测量如图11.2a和c所示意。在这个假设实验中，样品是培养细胞的一个周边部分，图顶部的示意图展示了其极高的复杂性。因此，薄的细胞质层中含有许多自由扩散的荧光分子（绿点），同时也含有携带荧光分子结合位点的细丝（红点）以及许多对荧光分子可透的膜结合囊泡（图11.2a，b）。荧光分子根据其扩散、结合和渗透性质在整个系统中分布。样品的一个小区域，以下称为光解区域（ROP），被聚焦光束照明，并且来自ROP的总荧光由光电倍增管测量。

在FRAP实验（图11.2a，c）中，照明强度I随时间变化，如图11.2c底部所示。最初，照明强度很小，产生信号F(-)。然后，强度突然增加三个到四个数量级，持续短时间，导致ROP“瞬间”光漂白和荧光耗尽。从漂白后立即开始（t=0），通过以初始小光强记录ROP的总荧光来监测局部荧光不均匀性的消散。这产生了一条荧光恢复曲线，该曲线从F(0)水平开始，并在长时间后接近F(∞)水平。如果一些荧光分子在实验时间尺度上是不动的，F(∞)会小于F(-)，并且不动分数为[计算公式]。

图11.2还表明，光漂白实验可以以另一种模式进行，称为连续荧光光漂白或连续荧光显微光解（CFM）（图11.2b，d）。在这种情况下，ROP以恒定强度照明，同时记录发射的荧光。照明强度调整为中间水平，以诱导相当快的光漂白速率，从而使得ROP与周围环境之间的荧光梯度被来自周围的新鲜荧光分子的扩散所抵消。这两个相互竞争的过程共同产生了荧光衰减，开始时衰减陡峭，随时间变得越来越平缓。不动的分子在照明开始时就被漂白，因此不动分数可以从初始斜率确定。

在比较FRAP和CFM时，显然CFM是光漂白方法的一般模式，而FRAP是一个特殊情况，其特点是在光解步骤期间“瞬间”光漂白，而在荧光测量期间“可忽略”光漂白。事实上，FRAP只是几种特殊光漂白模式之一，如后文所示（参见第11.4.3节）。FRAP和CFM的比较还表明，CFM仪器更简单，因为不需要产生高强度激光脉冲。最后，使用相同样品时，CFM模式下的测量信号会强得多，因为允许使用更高的激发强度。

为了理解为什么光漂白技术必然是显微方法，可以考虑分子通过扩散穿过ROP所需的时间。这个时间基本上决定了FRAP实验中荧光恢复和CFM实验中荧光衰减的速度。通过扩散穿过距离l的平均时间为：

其中D是扩散系数，n等于2、4或6，取决于涉及一个、两个还是三个空间维度。膜中脂质的有效扩散系数通常为~1 μm² s⁻¹，而细胞中水相蛋白质的扩散系数则因紧密结合不动结构而为零，或在细胞水相中自由扩散时高达20 μm² s⁻¹。使用2 μm的显微ROP，对于脂质扩散，𝜏diff约为1秒；对于自由蛋白质扩散，𝜏diff约为30毫秒。然而，如果ROP具有宏观尺寸（例如1毫米半径），𝜏diff将大得不切实际，对于脂质约为2.5×10⁵秒，对于快速蛋白质约为10⁴秒。

Setting up an Instrument#

利用商用组件，可以轻松搭建一台基本的FRAP（荧光漂白恢复）/CFM（共聚焦荧光显微镜）仪器。它（见图11.3）以一台配备相位衬度或差分干涉衬度光学元件以及用于在不同光谱区域进行荧光可视观察的组件的普通荧光显微镜为基础。这些组件包括一个具有宽光谱输出的强光源和一个带有可更换二色镜组和发射滤光片的垂直照明器。通过相位或干涉衬度和荧光的可视观察，对于使样品聚焦、识别其特征以及选择测量位点至关重要。

荧光显微镜配备有可在不同波长下提供发射线的激光器。每条激光线应具有高达50~100毫瓦的功率，这对于使光漂白在FRAP实验中足够快来说是必要且充分的。激光束同轴对齐并通过声光调制器（AOM）。借助AOM，激光束的强度可以在微秒内改变至多约2000倍，从而可以产生FRAP实验中典型的漂白闪光。在图11.3所示的方案中，离开AOM的激光束用于照亮一个场光阑，该场光阑由物镜成像到物体上，从而定义了光漂白区域（ROP）。ROP通常为圆形，但条带等其他几何形状也被广泛使用。在研究如整个细胞或大型人工膜等扩展物体时，还采用了平行条带阵列和其他周期性图案，并且这些图案具有优势。

创建ROP的另一种方法不涉及场光阑。相反，在激光束进入显微镜之前先对其进行聚焦，然后由物镜将激光束腰成像到物体上。通过场光阑或预聚焦方法创建的ROP在一个重要方面存在差异。场光阑方法在原则上产生均匀的轮廓，而预聚焦方法则产生高斯轮廓。第11.3节将讨论这种差异对数据评估的影响。FRAP仪器的另一个关键组件是灵敏的光电探测器。这可以是工作在单光子计数模式下的光电倍增管或雪崩光电二极管。为了安装光电探测器，显微镜必须有一个合适的端口，该端口包括第二个场光阑（见图11.3）。探测器侧的场光阑应与照明侧的场光阑相匹配，以使它们在物体中的图像在位置和大小上重合。这提供了共聚焦效果，部分地抑制了背景荧光。最后，需要一台计算机来协调激光快门、为AOM计时、在漂白步骤期间对光电探测器进行下门控、存储光电探测器生成的信号、绘制测量曲线以及通过适当的模型函数对其进行拟合。

Approaching Complexity from Bottom up#

如图11.2所示，生物系统极具异质性和复杂性。以细胞质为例，它由水相组成，其中充斥着各种大小和形状的分子，此外还包含大量的大型结构，如大分子复合物、细胞骨架纤维、膜结合囊泡和细胞器。荧光探针在这种介质中的扩散受到空间位阻参数的限制，并受到与其他分子的反应和跨膜运输的影响。所有这些参数共同决定了通过FRAP（荧光漂白恢复技术）或CFM（共聚焦荧光显微镜）获得的荧光恢复和衰减曲线，并且原则上可以通过将这些实验数据与适当的理论模型进行拟合来从中提取这些信息。在处理这种复杂性时，采用历史上的研究路径是很有用的：即先分析极限情况，然后再从极限情况推广到更一般的情况（见图11.4）。

在进行活细胞测量时，至少涉及以下参数：扩散系数、结合和解离速率以及膜运输系数。当扩散、结合或膜运输成为限速步骤时，可以分别对这些参数进行分析。有时可以安排极限情况，因为运输参数对基本系统参数（如温度）或实验条件（如ROP（光漂白区域）的大小）的依赖程度不同。例如，扩散时间取决于ROP大小的平方，而纯结合的动力学与ROP大小无关。另一方面，膜运输动力学取决于膜结合囊泡的体积。然而，由于生物系统具有复杂的亚显微地形以及众多不同的结合和膜运输过程，因此对其侧向运输进行全面分析仍然是一项巨大的挑战。

Evaluation of Diffusion Measurements#

荧光漂白恢复技术（FRAP）测量的理论描述包括四个部分：首先，计算光漂白后荧光团的相对浓度；其次，建立荧光团浓度与测量荧光之间的关系；然后，在适当的初始和边界条件下求解扩散方程；最后，通过将理论模型拟合到实验数据中来提取扩散系数。在FRAP测量中，会快速光漂白荧光掺杂或标记膜上的一个小圆形斑点，并通过重复测量跟踪漂白斑点中荧光的恢复。

实验研究表明，光漂白反应可以近似为不可逆的一级反应。荧光团浓度C(r, t)的时间依赖性为：

其中，𝛼是一个常数，I(r)是漂白强度。如果漂白间隔T远小于扩散的特征时间，则漂白间隔结束时（t = 0）的荧光团浓度为：

其中，C0是初始均匀的荧光团浓度。漂白结束时漂白区域中心（ROP）的归一化浓度称为漂白量，由下式给出：

如第11.2.2节所述，可以通过两种方式创建光漂白光束。一种方法是将TEM00模式激光束直接聚焦到样品中，得到一个具有高斯强度分布的光斑。另一种方法是，如果将一个照亮的圆形孔径成像到样品中，则图像的强度分布理想上是均匀的，即盒状。因此，考虑这两种情况是有用的。对于高斯强度分布，I(r)由下式给出：

其中，w是e−2高度处的半宽，P0是总激光功率。对于均匀圆形光束，强度分布为：

这里，w对应于圆的半径。方程（11.4）至（11.7）一起可以用于计算初始浓度分布C(r,0)。不同K值下的强度分布示例如图11.5a，b所示。可以看出，对于高斯光束，随着K的增加，ROP的直径增大，而浓度相对缓慢降低。相比之下，对于均匀光束，随着K的增加，ROP的大小保持不变，而浓度降低得更快。

漂白后观察到的随时间变化的荧光F(t)由下式给出：

其中，q是光吸收、发射和检测的所有量子效率的乘积；A是测量过程中的衰减因子；C(r, t)是荧光团浓度。

对于轴对称的二维（2D）系统，扩散方程可以写为：

其中，∇2是拉普拉斯算子，D是扩散系数。在高斯光束分布的初始条件下求解方程（11.9）得到：

其中，𝜏D = w2/4D是特征扩散时间，漂白参数K可以通过方程确定：

对于均匀强度分布，求解方程（11.9）得到：

然而，方程（11.12）在较小时间内不能得到稳定结果。因此，推导出了另一种在整个时间范围内都稳定的解决方案[7]：

在这个公式中，f(t)是定义为(F(t) - F(0)) / (F(∞) - F(0))的分数恢复，I0(t)和I1(t)是修正的贝塞尔函数。方程（11.10）和（11.12）的图如图11.5c，d所示。它们再次强调了由高斯和均匀漂白分布获得的恢复曲线之间的差异。均匀分布的优点是恢复动力学与漂白参数无关。为了根据扩散系数评估实验数据，可以将方程（11.10）、（11.12）或（11.13）拟合到实验数据。然而，经常采用一种简化的分析方法，其中从实验数据中确定荧光恢复半衰期𝜏1/2（f = 1/2时的时间），并从下式中获得扩散系数：

对于均匀光束，𝛾D的值为0.88。对于高斯光束，𝛾D取决于K；有关𝛾D对K值的依赖性的表格，请参见Axelrod等人的文章[6]。当部分荧光团是固定的时，其分数由方程（11.1）给出。

Binding#

现在，我们将分析扩展到存在扩散时的结合反应。这里，最简单的情况和起点是自由荧光配体S与其结合位点L之间的一阶可逆结合-解离反应，反应式如下：

H表示L-S复合物，kon和koff分别是结合速率和解离速率。为了考虑这一条件，扩散方程需要被一组耦合的扩散-反应方程所替代[8]：

其中，l、s和h分别是L、S和H的浓度。方程（11.16）已经针对结合位点L（从而L-S复合物）固定不动的情况进行了求解。然而，该解涉及数值方法的模拟，这在评价荧光漂白恢复（FRAP）实验（第11.4.1节）时有所讨论。因此，需要针对特定的初始条件和边界条件推导出理论曲线，并与实验数据进行比较。

然而，Sprague等人[8]还提供了对极限情况的分析近似，这些近似具有重要意义。因此，在扩散为速率限制因素（扩散主导）的情况下，FRAP曲线形式上由纯扩散的解（方程（11.13））描述。然而，以这种方式确定的扩散系数是一个有效量，与自由扩散系数D的关系为：

当“真实”扩散系数D可以独立测量或估计时，可以从方程（11.26）确定kon/koff比率。相反，当配体紧密结合，使得解离时间（1/koff）远大于特征扩散时间𝜏D（结合主导）时，荧光恢复与漂白区域的大小无关，由以下公式给出：

方程（11.15）、（11.16b）和（11.16c）的闭式解析解也可获得[9]。该解允许复合物H移动，并可应用于使用高斯光束或均匀光束的实验。

Membrane Transport#

图11.6展示了利用荧光漂白恢复（FRAP）技术进行膜转运测量的一个实例，而图11.7则描绘了在此项及其他转运测量中所采用的实验配置。这些配置包括跨越人工微孔或纳孔的孤立膜、孤立的细胞影（cell ghosts）、附着于固体基底的细胞和人工囊泡、培养中的单个活细胞，以及体外培养的细胞密集单层或体内排列的上皮细胞。

图11.7A–D所示的配置均可描述为由两个隔室组成的双隔室系统，如图11.7E所示，这两个隔室（体积分别为V1和V2）共享一个表面积为S的膜。荧光溶质在隔室1和隔室2中的浓度分别为c1和c2。在最简单的情况下，膜两侧的转运（即V1和V2之间的转运）是被动的，即与浓度差成正比。若进一步假设扩散速度远大于膜转运速度，则c1(t)和c2(t)仅随时间变化，而不依赖于它们在V1或V2内的具体位置。此时，跨膜通量（定义为单位时间、单位膜表面从一侧隔室净穿越到另一侧隔室的分子数）为：

P为渗透系数，它取决于转运体对底物的特异性渗透性和转运体的面积密度。浓度变化可由以下方程描述：

在FRAP实验中，我们假设在t=0时，隔室1中的荧光底物被部分漂白，因此初始浓度为c1(0) ≡ c10，c2(0) ≡ c20。则方程（11.20a）和（11.20b）的解为：

其中，k1和k2为转运速率常数，由下式给出：

假设记录的荧光信号与浓度直接成正比，则隔室1的荧光强度F1(t)为：

F2(t)亦满足类似关系。

通常，其中一个隔室的体积远大于另一个，例如V2 ≫ V1。此时，F2保持恒定，而F1则遵循：

为了推导出转运速率常数，实验数据可通过方程（11.23）或（11.24）进行拟合，这对于单指数函数而言是一项简单任务。图11.7F展示了一个示例。

迄今为止，我们一直假设转运是被动的，即与浓度差直接成正比。然而，许多生物膜转运过程显示出符合米氏方程（Michaelis–Menten equation）的饱和动力学。双隔室系统中米氏类型转运过程的动力学已得到广泛分析，并且已经获得了可直接应用于FRAP和CFM实验的解甚至模拟程序（http://www.physiome.org/）。

之前做出的另一个假设是扩散速度远大于膜转运速度。该条件在以下情况下成立：

其中，𝜏T为有效转运时间，d为隔室1的最小线性尺寸。该条件在细胞内测量中经常成立[12]。然而，在某些情况下，扩散时间不可忽略。此时，仍然有可能对膜转运和扩散进行去卷积，并恢复膜转运速率[13]。

Theoretical Background and Data Evaluation#

在共聚焦荧光显微镜（CFM）实验[14]中，以恒定功率照射感兴趣区域（ROP），同时记录ROP的荧光（参见第11.2.1节，图11.2b，d）。观察到的荧光衰减通常是光漂白、侧向扩散、结合和膜转运综合作用的结果。与荧光恢复后漂白（FRAP）实验一样，先考虑纯扩散情况，再考虑存在扩散时的结合情况，最后考虑膜转运。在纯扩散情况下，CFM曲线有三个时间阶段（图11.8a）。在照射开始时，光漂白是唯一相关的过程，尽管这个过程非常短暂。如果部分荧光分子是固定的，它们将在这个阶段被光漂白。在第二个时间阶段，ROP与其周围环境之间的荧光梯度会诱导新鲜荧光分子从周围环境扩散到ROP中，从而减缓荧光衰减。这个阶段的特征是漂白和扩散的时间尺度大致相等。在第三个时间阶段，荧光梯度从ROP扩展到其周围的远距离（图11.8b），最终接近扩散空间的边界。这些定性分析表明，第一个时间阶段最适合确定光漂白反应的级数和固定分数。第二个时间阶段最适合确定扩散系数，而第三个时间阶段可用于获取扩散空间大小的信息。

在定量层面上，第11.3.1节中关于FRAP测量理论框架的论述在很大程度上也适用于CFM。然而，为了考虑光漂白对荧光分子的去除，需要补充扩散的微分方程。在最简单的情况下，光漂白反应可以描述为：

其中C*是荧光分子的激发单线态，它可以发射光子返回基态或经历不可逆反应，生成非荧光产物P。然后，扩散-反应方程采用以下形式：

方程（11.27）的解析解尚不可得。因此，CFM[14]的开发依赖于数值方法的使用。数值方法随后得到了扩展[15-17]，并用于评估涉及扩散、光漂白、结合和/或膜转运的CFM和FRAP实验。尽管之前对扩散-反应系统的数值模拟要求较高，但计算能力的进步以及MATLAB等软件包的可用性使其成为首选方法。

反应-扩散系统数值模拟的本质是时空离散化：将扩散-反应空间细分为有限数量的空间元素。同样，时间也被细分为若干个区间。根据初始条件，用探针分子填充这些空间元素。一个常用的初始条件是探针分子的随机分布。然而，初始分布经常是不均匀的。在这些情况下，可能可以根据漂白前的共聚焦扫描估计分布，并将该信息作为初始条件[17]。然后，为分子赋予相关属性，例如，每个时间间隔内移动到相邻单元的概率、通过光漂白变成非荧光的概率、与结合位点临时结合的概率、通过膜转位的概率等。通过计算每个时间间隔内每个探针分子的空间位置，模拟过程的时间依赖性。结果当然取决于离散化的程度。如果空间元素和/或时间区间选择得过大，过程可能会失真。如果选择得过小，计算时间可能会变得过长。因此，选择合适的离散化程度是一个重要的考虑因素。

图11.8a展示了CFM曲线模拟及其与实验曲线拟合的一个示例。

在存在结合的情况下的扩散，需要以类似的方式在相应的微分方程中补充漂白项：

为了求解这些方程，数值模拟这一耦合微分方程系统再次成为首选方法。然而，也有一些分析近似方法可用。因此，对于有效扩散和结合占主导地位的情况，推导出了涉及简单指数函数的近似[15]。对于球形囊泡CFM测量的长时间阶段，Delon等人[18]得到了：

其中𝜏1是通过数据的单指数拟合获得的衰减时间，𝜎B是光漂白截面，P是照射光束的功率，R是囊泡半径。

在膜转运的情况下，通量方程也通过光漂白项进行补充[19]：

求解方程（11.30）是直接的，并得出：

其中速率常数k由下式给出：

图11.9展示了CFM通量测量的一个示例。

Combination of CFM with Other Techniques#

由于其技术上的简洁性，荧光相关光谱（CFM）可以轻松地与其他技术相结合。例如，CFM和荧光相关光谱学（FCS）的显微设置几乎完全相同，因此可以使用同一仪器，甚至在同一样本的同一区域同时进行这两种类型的实验[15, 20, 21]。此外，CFM和FCS互为理想补充。CFM最易于确定0–10 μm² s⁻¹范围内的扩散系数，而FCS则更适合于0.1至100 μm² s⁻¹范围的扩散系数；CFM可以轻松量化固定部分，而FCS则无法检测到这些部分。CFM还可以与4Pi显微镜结合使用[21]。在4Pi显微镜中，两束相对的聚焦激光在共同的焦平面上产生干涉。这产生了一个具有复杂三维（3D）形状的点扩散函数（PSF），包括一个主峰和两个侧瓣。结合双光子激发技术，主峰在z轴方向上的宽度约为100纳米。将4Pi显微镜（以及其他超分辨率方法，如受激发射损耗（STED）显微镜）与CFM结合，为将扩散和结合测量扩展到纳米尺度领域提供了新的可能。全内反射荧光（TIRF）是一种选择性照亮玻璃/流体界面薄层的方法（框12.2）。将TIRF与CFM结合[22]，可以以约100纳米的轴向分辨率测量分子移动性和结合情况。例如，这一技术被用于测量单个细菌中的蛋白质移动性。

CFM变体

到目前为止，所描述的是CFM技术的基本版本。然而，这一概念可以进一步细化以满足特殊需求。图11.10展示了一系列照明方案和由此产生的荧光信号。这些方案包括在连续照明期间添加多个短脉冲、使用两种强度水平的连续照明、在连续照明期间施加一个高强度脉冲、根据双曲线函数在连续照射期间降低强度，以及使用精心设计的时间方案的脉冲照射。这些方法的优点已经得到了证明，例如，在膜传输测量中，通过阶梯式强度可以消除背景效应[19]；在小细胞中的扩散测量中，脉冲照射能够表征扩散屏障[20]。

Implementation#

如本书第5章所述，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）利用聚焦激光束以有序的方式（即逐点、逐行）快速扫描样本。扫描过程中产生的荧光由物镜收集，经过去扫描处理，通过共聚焦光圈，最后由灵敏的光电探测器记录。图像由大量的顺序点测量数据重建而成。重建图像的空间分辨率取决于照明点扩散函数（PSF）和成像PSF，在最佳条件下，焦平面（x轴和y轴）的分辨率约为220纳米，光轴（z轴）方向的分辨率约为600纳米。时间分辨率由扫描速度决定，通常为每像素约2微秒。这意味着，对于512像素的一行，时间约为1毫秒；对于512×512像素的一帧，时间约为0.5秒。扫描时间可以通过降低扫描速度或对行或帧进行平均来增加。也可以通过减少每帧的像素数或提高扫描速度来在一定程度上减少扫描时间。

CLSM在荧光恢复后漂白（FRAP）和荧光相关光谱（CFM）实验中的应用，是通过为商用CLSM配备高功率激光器和一种称为“scamper”的设备而大大拓展的[5]。Scamper本质上是一种算法，它监控扫描过程，并根据可自由编程的图像掩模在扫描期间调制激光束功率。如今，基于这一原理的FRAP模块几乎已集成到所有商用CLSM中。CLSM辅助的FRAP实验包括以下步骤：采集图像；选择一个或多个感兴趣区域（ROP）；启动一个或多个漂白扫描，其中激光束设置为高功率水平，但仅在处于ROP内时才开启；以及以低、非漂白功率获取一系列成像扫描。有关CLSM辅助FRAP实验的理论基础和蛋白质扩散与转运测量中数据采集的逐步协议的详细讨论，请参阅[4]。CLSM辅助的CFM实验可以以不同的方式进行。在最简单的情况下，获取一张图像，选择一个图像点，并在不扫描的情况下随时间监测该点的荧光。这相当于传统的CFM测量，但利用了CLSM的高分辨率和光学切片能力。在另一种方案中，获取一张图像并选择ROP，然后连续扫描样本。然而，激光束仅在处于ROP内时才开启。这使得能够空间上解析ROP内的荧光衰减。还有一种模式，是连续扫描样本，当处于ROP内时，将激光束功率设置为漂白水平；当处于ROP外时，设置为低、非漂白水平。这使得能够监测ROP相邻区域的荧光损失。

New Opportunities#

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）在光漂白实验中的应用，为分析生物系统中的分子运输提供了许多新机遇。其中，创建多个和/或任意形状的感兴趣区域（ROP）、解析ROP内随时间和空间变化的荧光强度、实现高时间分辨率，以及从二维空间向三维空间的拓展尤为突出，以下将对此进行讨论。

两种常见伪影及其校正#

在荧光恢复后漂白（FRAP）实验中使用商用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）时，激光功率经常成为限制参数。为了获得足够程度的光漂白，可能需要进行多次漂白扫描，耗时数秒。因此，在漂白过程中会发生扩散。这违反了常见数据分析方案中的瞬时漂白条件。魏斯[34]通过数值模拟表明，这会导致严重低估扩散系数。已经推导出了扩散方程的一个近似解析解[35]，该解考虑了FRAP实验中漂白过程中的扩散。该理论适用于圆形感兴趣区域（ROP），并除了ROP的名义半径外，还纳入了一个有效半径。文献[36]提供了一个用于评估FRAP实验的解析解，该解在形式上与阿克塞尔罗德等人的解相似[6]。通常，生物样品中荧光团的浓度非常低。此外，激光扫描显微镜（LSM）具有复杂的光路，降低了其检测效率。因此，在成像过程中可能需要将激光束功率提高到不能忽视光漂白的程度。幸运的是，成像过程中漂白的校正很简单。根据文献[37]，荧光团浓度C(r,t)的时间依赖性仅仅是漂白项和扩散项的乘积。漂白项可以轻易测量，并用于校正FRAP数据[38]。