总述#

分子生理学，即对介导复杂细胞反应的分子机器工作原理的理解，需要高光学分辨率来确定事件和反应的位置，高时间分辨率来描绘其动态行为，以及最重要的是，需要一种方法来识别事件或反应本身。现代成像设备和最近的位点特异性染色技术，结合遗传和合成染料，满足了这些时空需求。通过选择研究对象所携带的荧光标记，可以编码其身份。然而，仅从探针的身份难以轻易推断出这些组分在特定反应中的参与方式，即它们的作用。为了获取这一信息，标记荧光必须根据作用于探针的反应改变其特性。所有荧光特性都可用于编码传感功能，并且已经使用了许多基于荧光发射产量、波长或偏振变化的“功能性”染料。另一个可用于感知染料直接分子环境变化（即感知正在发生的反应）的荧光指标是荧光寿命。荧光寿命描述的是激发态的持续时间，即激发与光子发射之间的延迟。下文将描述其优势和特性。测量和映射荧光寿命的成像技术称为荧光寿命成像显微镜（FLIM）。荧光寿命最有用的特性之一是它能够提供荧光探针衰减动力学的视角。这一特性可用于检测和量化生命科学家们极为关注且广泛应用的一种光物理现象：弗斯特共振能量转移（FRET），即能量从一种荧光团的激发态转移到第二种合适的受体荧光团。这种能量转移可以通过观察耦合系统中荧光团激发态跃迁速率的变化，以及耦合荧光团之间荧光产量的重新分布来观测。本章将概述FRET在生命科学中的起源、结果、测量方法及意义。

FRET的物理基础#

当吸收到能量足够的光子时，吸收该光子的化合物的电子可以被激发到更高的电子态。当电子弛豫回到能量基态时，会通过发射光子释放能量，此时该化合物被称为荧光团。可以将激发态的荧光团理解为一种发射（赫兹偶极子）天线。吸收的能量以荧光团周围振荡的电磁场形式表现（在被称为近场的距离范围内），这会导致电磁辐射（此处为光）的产生，并从发射体逃逸到远场。荧光（以及一般意义上的发射天线）的大多数应用都基于逃逸辐射的特性，因为它允许信息在长距离上传输。在荧光显微镜中，具有衍射极限分辨率（约200纳米）的信息被传输到大约长一百万倍的距离（显微镜中的光路长度）。在荧光团的近场范围内，通常认为该范围延伸到发射光波长的1∕2π倍，此处存在的能量不以光的形式辐射。FRET作用于近场中的这种能量。这一相互作用可以在远场中读出，即从可以用显微镜成像的辐射变化中读出，这使得该方法非常强大。近场能够进行电磁感应，非常类似于变压器中的耦合电路。通过与近场中的分子共振耦合吸收能量，会消耗荧光团激发态的能量。因此，这种耦合的一个直接后果是供体荧光团的荧光产量减少，这一效应被许多FRET显微镜方法所利用。发射体与吸收体之间相互作用中的这一反应组分是FRET的基础。在FRET中，发射体被称为供体，而吸收体则是任何能够在供体周围场域中吸收能量的化合物（因此，也与发射波长有关）。吸收体被称为受体。当受体是荧光团时，通过FRET吸收的能量会再次以光的形式发射出来。一些FRET方法利用这种由FRET耦合激发的受体发射。第13.3节和第13.4节将讨论检测FRET的不同方法。

FRET的历史发展#

尽管有许多人参与了推导FRET有效理论的最后步骤（参见优秀综述[1-3]），但为简化起见，这里仅考虑让·佩兰和弗朗西斯·佩兰（父子）以及西奥多·弗斯特的贡献。弗斯特成功地将所有拼图碎片整合在一起，因此他在FRET方面的开创性工作值得被认可。追溯其历史发展过程是很有启发意义的。在20世纪20年代和30年代，人们发现光学激发的分子和原子不仅可以通过物理碰撞过程中的电子转移来传递激发态能量，而且还可以在“不与任何物质结合”的情况下传递能量（引自西奥多·弗斯特的开创性论文，该论文为理解FRET过程提供了理论和数学框架）[4]。这项研究的动机是观察到在光合作用过程中，大约1000个叶绿素分子参与将一个二氧化碳分子同化为葡萄糖。因此，单个分子吸收的能量必须找到途径到达一个单一的“还原位点”，在那里发生同化的化学反应。高粘度荧光分子溶液为观察光学激发分子间通过测量偏振光激发下的荧光（去）偏振来传递能量提供了便利的实验条件。在稀释的荧光团溶液中，荧光保持了激发源的偏振方向，因为在粘性溶剂中几乎不发生旋转。偏振激发光选择了一组或有利取向的“初级”荧光团，它们将发射同样偏振的光。然而，观察到随着荧光团浓度的增加，偏振度显著降低。由于在这些浓度范围内，分子取向的弛豫时间预计不会依赖于浓度，且没有理由认为激发态的持续时间会增加，因此只能得出结论，除了初级激发分子外，其他分子也参与了荧光辐射。可以观察到，在相距约50埃的分子之间，激发能量通过“惰性溶剂”发生了转移。一种微不足道的可能性是初级荧光辐射的再吸收，随后产生次级荧光。这可以排除，因为只能再吸收非常小部分的初级荧光，并产生去偏振的次级荧光。这是由于同一荧光团的荧光发射和激发之间存在较大的斯托克斯位移。佩兰父子首先提出，除了光子的发射和再吸收外，能量还可以通过初级激发分子与其邻近分子之间的直接电动偶极-偶极相互作用（激活转移）在无碰撞的情况下传递，距离超过分子直径。弗朗西斯·佩兰推导出了一个方程，描述了临界分子间距R0。在这个距离上，FRET的速率等于辐射的速率：即FRET的效率为50%。他假设两个相同的荧光团表现为两个相同的电子振荡器，以固定频率振荡，但考虑到溶剂相互作用会使频率变宽[5]。

其中，𝜆是振荡器的辐射波长，t是溶剂分子与荧光团碰撞的平均时间，这导致发射频率变宽（假设在10−14至10−13秒之间），𝜏是激发态的持续时间（荧光寿命）。六次方依赖关系源于这样一个事实：受体的激发概率与局部电场振幅的平方成正比，而电场振幅随与偶极子距离的三次方成反比衰减。对于荧光素溶液（𝜆=500纳米），临界分子距离将为15-25纳米，对应于2×10−5至1×10−4摩尔/升的浓度。然而，实验表明，这些浓度比实际发生去偏振的浓度低了三倍。因此，佩兰的FRET方程低估了能量传递对分离距离的依赖。佩兰将系统视为相互作用的纯振荡器，其中相同分子的基本振荡频率相同。他的方程仅假设了一个（变宽的）发射线谱，并没有考虑由于斯托克斯位移引起的分子吸收和荧光频率的差异。由于吸收和荧光光谱被溶剂相互作用等因素广泛分散，因此可用能量也分布在广泛的光谱上，两个分子同时具有相同频率的概率很小。弗斯特在他的著名的“重叠积分”中考虑了光谱的真实分散和相互作用概率。因此，FRET的极端距离依赖性不仅由于它在近场作用，还因为即使在近场内，共振的概率也不是很高。像绿色荧光蛋白（GFP）或荧光素这样的典型绿色发射荧光团的近场仍然约为80纳米，这一分辨率很容易通过近年来开发的新的超分辨率显微镜技术达到，这些技术为莫纳、贝齐格和赫尔赢得了2014年诺贝尔化学奖，因为它仅为衍射极限的一半左右！弗斯特意识到，描述偶极耦合强度与振荡频率关系的式子应乘以共振概率。染料之间的完美共振意味着，对于每个频率，以该频率振荡的供体分子数量恰好与能够以该频率振荡的受体分子数量相匹配。对于弗斯特的荧光素实验，斯托克斯位移阻止了这种完美匹配。

尽管后来的手稿更加详细，但西奥多·弗斯特关于能量转移的第一篇论文[6]发表在非专业期刊《自然科学》（Naturwissenschaften，施普林格出版社出版）上，清楚地阐明了重叠积分在由临界距离描述的能量转移共振条件中的基本作用（在10页手稿的1页多一点内容中！）。弗斯特自己称他的早期估计为“Überschlagsrechnung”，最好翻译为通俗术语“粗略计算”。本文相关部分的翻译见方框13.3。尽管这篇论文主要是定性的，但其推导策略（与他后来更严谨的工作[7]不同）可以被遵循以得到现代FRET方程（见方框13.1，弗斯特方程）。在这篇论文中，弗斯特将相互作用的荧光团的电子系统视为J.佩兰原始理论意义上的经典力学振荡器。后来的量子力学处理得出了相同的结果。

在这篇论文中，他给出了对R0（他称之为d0）的第一个修正估计：

其中，Ω′/Ω²表示重叠积分，Ω是吸收和发射光谱的宽度，Ω′是两者光谱之间的重叠。Ω′/Ω²表示的相对面积重叠是供体和受体分子以相同频率振荡，从而能够传递能量的概率。这种方法也在[4]中得到了遵循。在不知道发射光谱确切形式的情况下，弗斯特不得不通过将吸收光谱围绕最大吸收和发射频率（𝜈0）的算术平均值进行镜像来近似发射光谱：

因此，分数重叠由真实重叠（Abs·Em，Ω′）与佩兰假设的完全重叠（Abs=Em；Abs·Abs，Ω²）的比率给出，并表示具有相似能量含量的对的概率分布。因此，弗斯特通过这个分数缩放了佩兰对临界分子距离的估计。使用由刚性类固醇间隔基连接的FRET对，可以演示能量转移速率kT对光谱重叠的依赖性。通过改变溶剂来调制光谱重叠的程度，从而改变染料的光谱特性[8]。西奥多·弗斯特的主要贡献是提供了对无辐射能量转移的定量解释，该解释将分子尺度上通过电子库仑耦合的能量转移效率与简单的物理术语和常数联系起来。考虑到荧光素发射中的斯托克斯位移，弗斯特计算出临界分子距离（他表示为R0）为5纳米，这一值他通过实验进行了验证[4]。弗斯特后来在他的著作《有机化合物的荧光》（1951年出版）[7]中推导出了他现在著名的转移速率nA,B的公式（原书中的排版错误显示了𝜋6）：

其中，N′是阿伏伽德罗常数（6.02×10²⁰分子/毫摩尔），𝜏e是平均辐射寿命，R是分离距离（r），F(A)Q是“量子光谱”，描述了落在单位区间d𝜆内的供体（此处表示为“分子A”）荧光产量的比例。这是归一化为1的供体发射光谱。𝜖(B)是受体（“分子B”）的吸收光谱。光谱使用基频（𝜈），可以通过𝜆=c/𝜈轻松转换为波长，其中c是光速。辐射寿命𝜏e表示在没有非辐射损失的情况下，激发态将持续的时间。因为总是存在损失，所以这是一个理论常数。其倒数给出了辐射速率Γ。辐射寿命𝜏e可以用供体量子产量QD和供体寿命𝜏D来表示。供体寿命𝜏D是包括非辐射过程在内的供体激发态的持续时间，即实际测量的寿命：

使用这个转换，我们得到了熟悉的现代FRET转移速率kT的表示法：

其中，FqD(𝜆)（供体量子光谱）描述了落在单位区间d𝜆内的荧光产量的比例，即光谱归一化为1。NA是阿伏伽德罗常数，为6.02×10²³分子/摩尔。范德梅尔在他精彩的章节[3]中指出，弗斯特使用N′表示阿伏伽德罗常数（6.02×10²⁰毫摩尔⁻¹）是引用弗斯特方程时常见错误的基础。尽管它们实际上是相同的，因为分子数量是成比例的，但每毫摩尔或每摩尔表达式中的差异导致许多人通过乘以1000的因子来“修正”公式。因此，一个常见但错误的表示法是9000 ln 10而不是9 ln 10。这个公式可以通过将常数因子分组到临界距离R0（式（13.2）中的d0）来简化。当r=R0时，则kT=Σ(kr+kn)，即转移等于所有其他辐射（kr）和非辐射（kn）去布居速率。请注意，这个条件与原始处理略有不同，在原始处理中忽略了非辐射衰减速率，并且临界距离定义为kT=kr（见方框13.3）。

重叠积分（即积分项）通常简写为J(𝜆)。然而，应当注意的是，具有M−1cm−1nm4单位的J(𝜆)并不等同于最初在文献[6]中引入并在方程(13.2)和(13.3)（见框13.1）中使用的真正的重叠积分，即无量纲的振荡概率。Jares-Erijman和Jovin指出，在现代常用符号中，将1∕𝜏e展开为量子产额QD和𝜏D的比值（方程(13.5)）并非严格必要[9]。进行此展开是为了得到一个包含可实验验证参数的方程（方程(13.6)），而非包含未知参数𝜏e。若不进行此展开，则临界距离的原始定义将保持为转移速率kt等于辐射速率1∕𝜏e时的距离。

在该定义中，量子产额QD并未出现——这具有一定的吸引力，因为在定义新的临界距离F0时，并没有令人信服的理由必须包含量子产额。为表彰他对荧光共振能量转移（FRET）定量理解的贡献，临界距离R0被称为Förster距离。为方便起见，结合所有常数，R0可表示为：

若波长以纳米为单位表示，则方程返回的R0以埃为单位。Förster在FRET方面的开创性工作是在相同荧光团的特殊实验条件下进行的，我们现在称之为同型FRET。如今，大多数FRET测量是在化学性质不同的染料之间进行的，即在不同的供体和受体荧光团之间（异型FRET）。在此情况下，受体还发生红移，以便分别测量供体和受体的发射。Jean Perrin对FRET理论的发展有助于我们理解Förster修正方程的推导。Förster首次优雅地引入了概率重叠积分Ω′∕Ω2[6]，采用了一种简化的方法，该方法似乎产生了与后来更严谨的推导[4, 7]不同的结果。一个明显的差异是对波长的依赖性。在较旧（类似Perrin）和较新的R0描述中，波长依赖性似乎有所不同；方程(13.2)描述了𝜆6的关系，而方程(13.8)中的J(𝜆)包含了一个𝜆4项。框13.1展示了它们为何是相同的。

荧光共振能量转移（FRET）的光谱和距离依赖性#

Förster还描述了给定分离距离r下FRET过程的速率kT(r)，它是分离距离r和不存在受体及FRET时供体衰减速率（由1∕𝜏D给出）的函数，如方程(13.7)所示：

因此，实现高FRET效率的首要条件是两个分子彼此靠近。对于给定的距离r，R0值越大，FRET效率越高。从该方程可以清楚地看出，R0描述的是转移速率等于无FRET时的衰减速率的距离（R0 = r），此时FRET效率为50%。R0的定义中给出了实现高效FRET的其他条件。如前一节所述，R0的主要决定因素之一是重叠积分J(𝜆)。如果两个偶极振荡器要发生共振，它们应包含相似的能量内容，因为共振的概率取决于在耦合可能发生的期间（即供体激发态持续时间𝜏D）匹配频率的出现。因此，应努力使供体发射光谱与受体激发光谱之间实现高度的光谱重叠。请注意，重叠积分包含了受体的消光系数𝜖A，且在R0的定义中（方程(13.8)），供体发射光谱按其量子产额QD进行了缩放。如方程(13.6)和(13.8)所示（框13.1对此进行了解释），重叠积分包含𝜆4项。因此，FRET效率高度依赖于波长。这就是为什么光谱之间看似重叠很小，但在较长波长范围内，仍能对FRET效率产生显著影响的原因。这有时被称为红尾效应。它也表明，与仅根据重叠预测的情况相比，红移的FRET对通常具有更高的FRET效率。一个简单的模拟展示了FRET效率如何随重叠和波长而变化。

图13.1c中的“超人斗篷”函数展示了使用较长波长荧光团和高光谱重叠对FRET的积极影响。应当指出，随着光谱污染的增加，对供体和受体之间光谱分离较小的FRET测量变得越来越困难，这将在第13.3节中讨论。

用与荧光相关的术语描述FRET对的跃迁偶极耦合强度时，可能会被误解为FRET是基于光子的发射和再吸收。Förster正是基于发射和吸收之间的斯托克斯位移，否定了这种平凡再吸收的可能性，从而纠正了Perrin对FRET效率的严重高估。FRET过程本质上是非辐射的。吸收和发射光谱、量子产额和消光系数的使用，同样适用于从能量管理的角度描述该过程。能量转移所通过的介质的折射率预计会影响FRET的效率。由于大多数生物组分的折射率非常相似——水为1.33，脂质膜为1.46，蛋白质为1.5——在生物极端情况下，预计影响最大为40%。然而，由于一些成像是在高折射率封装介质中进行的，并且一些化学测量可能是在高折射率聚合物溶剂中进行的，因此折射率可能成为一个混杂因素。取向因子𝜅2描述了相互作用的供体发射偶极和受体吸收偶极之间的空间关系，是决定耦合强度的重要因素（见图13.2）。共线排列允许最强的相互作用，其𝜅2值达到最大值4。平行取向则远非最优，其值仅为1。由于𝜅2的值与R0的六次方成正比，因此在这两种几何取向之间切换将导致Förster距离变化26%。然而，与折射率的影响相反，当偶极垂直取向时（且至少一个偶极垂直于连接线），𝜅2的值可以达到零。在这种取向下，无论距离多近、J(𝜆)多大，或QD和𝜖A多大，都不会发生FRET耦合。

对于给定的FRET对，R0的值通常是在假设𝜅2的值为2/3的情况下计算得出的，因为这是所有可能取向的统计平均值。在假设偶极确实能在供体寿命期间采样所有可能取向的情况下，这允许从FRET效率E（方程(13.32)）估计r。FRET效率可以根据速率来定义：转移速率kT、荧光（或辐射）速率kf和非辐射衰减速率kn（有关更多详细信息，请参见框13.2）：

将此与方程(13.7)结合，我们得到FRET效率、R0和分离距离r之间的关系：

该方程显示了FRET的极端距离依赖性，这在图13.3中以图形方式表示。在距离r小于R0时，E迅速增加至1。相反，在距离大于R0时，E迅速降至零。在R0 = r时，50%的分子参与FRET，而不是遵循荧光发射路径，因此转移效率E为50%。正是这种极端距离依赖性行为使得FRET成为细胞生物学家如此有吸引力的工具。在仅为R0一小部分的范围内，FRET从易于检测到几乎无法检测。在R0处，距离敏感性最高。假设一个典型的荧光团FRET对，其R0值等于5 nm，并假设FRET效率的测量分辨率为5%，则在FRET分离敏感性为10%时，R0周围的距离变化的空间分辨率约为1.6 Å，而在FRET分离敏感性较低时，该分辨率仍为约3.3 Å。

Stryer和Haugland使用已知尺寸的刚性螺旋聚-L-脯氨酸低聚物，实验验证了Förster关于kT与距离六次方倒数依赖性的预测[10]。

FRET作为分子标尺的局限性

考虑到前述所有影响FRET（荧光共振能量转移）效率的因素，不难理解为何FRET被视为一种分子标尺。当除分离距离外的所有因素都能得到精确控制时，FRET效率的测定就包含了分子尺度上的空间信息。此外，对于大多数具有生物相关性的荧光团而言，空间分辨率最高的距离尺度（约为R0，见图13.3）与蛋白质的典型尺寸相对应。因此，FRET显微镜是空间分辨能力最高的光学成像技术，甚至超过了近期开发的超分辨光学技术[11, 12]，如受激发射损耗（STED）显微镜，以及光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）等定位成像技术家族[13–15]（这些技术在本书前面的章节中有所概述）。当然，问题在于FRET图像受到衍射极限的限制，因为它们是用于此目的显微镜的光学分辨率产生的。图像的额外信息层中包含了超高的空间信息。显然，分子尺度的距离对细胞生物学而言是重要的信息。特别是，涉及蛋白质-蛋白质相互作用或构象状态的“是/否”问题的生物学应用，可以直接通过FRET显微镜来解决。

人们很想将FRET显微镜的用途扩展到定量绘制距离，例如在蛋白质复合物中。鉴于FRET的空间分辨率，可以在距离尺度上获得结构生物学信息，而这种距离尺度通常只能通过NMR（核磁共振）或晶体学技术来研究。尽管这一想法很诱人，但𝜅²取向因子的不确定性严重限制了这一本具前景的应用可能性。上述认为统计平均值2/3可以作为默认值的论点，仅在一种条件下成立：即偶极子在给体寿命内可以取样所有可能的取向。这一条件对于溶液中的小荧光团可能满足，但对于标记的较大细胞组分（如蛋白质）和较大荧光团（如荧光蛋白）则不太可能。特别是对于后者，不能假设埋在荧光蛋白桶状结构深处的发色团可以自由旋转。同样的论点也适用于与感兴趣蛋白融合的整体结构，因为它相对较大，且荧光蛋白很可能以某种方式与宿主蛋白相互作用。即使它享有较高的旋转自由度，旋转的时间尺度也会长于荧光寿命，因此基本上仍然是不动的（在细胞中，绿色荧光蛋白（GFP）本身的荧光寿命为2.5纳秒，其旋转扩散相关时间约为20纳秒）[16]。

因此，在大多数生物测量中，我们必须处理一个偏好的狭窄取向范围。不幸的是，当考虑所有可能取向的分布时，获得不利取向的概率远高于获得有利取向的概率。从统计平均值位于2/3而不是更接近0和4这两个极端值的算术平均值（即2）这一事实就可以看出这一点。因此，在应用式（13.29）时应谨慎，因为R0可能会变化。事实上，大多数FRET用户已经习惯于将R0视为一个常数，它描述了FRET对的“强度”，以至于常常忘记其对𝜅²的依赖性。同样的问题，在大多数情况下，由于固定的𝜅²低于2/3，会降低测量中的有效FRET；但也可能产生相反的效果；例如，青色荧光蛋白（CFP）/金星-黄色荧光蛋白（YFP）融合蛋白Cy5.11[17]表现出约98%的FRET效率。在这种结构中，CFP的C端缩短了五个氨基酸，直接与缩短了11个氨基酸的金星N端融合（因此得名Cy5.11，即青色5黄色11）。由于这种极高的FRET效率和青色给体的高pH敏感性，我们使用Cy5.11作为基于FRET的细胞内pH传感器[18]。鉴于桶状结构的直径为24埃（因此这是最小分离距离）和该对的R0为54埃，这意味着两个荧光蛋白必须并排对齐，距离小于1纳米；然而，它们是头尾相连的，因此最小分离距离为4.2纳米（桶的长度），这将仅对应“80%”的效率。然而，融合显然固定了荧光蛋白，因此也固定了偶极子在高度有利的取向上。因此，预计R0更接近8纳米，即𝜅²的值可能更接近4（根据式（13.8）至（13.32））。这一论点引出了基于FRET的测定中最难的实际问题之一。在没有简单方法控制两个标记蛋白之间或单个多肽结构上的两个标记之间的𝜅²的情况下，没有简单的方法来优化测量的动态范围。这在目前流行的生物传感器设计策略中尤其令人头疼，该策略是在单个多肽链中将多肽感应域夹在供体和受体荧光蛋白部分之间[19]。这种传感器基于感应域在反应/修饰发生时发生构象变化，但原生（非活性）和改变后（活性）构象之间的FRET效率结果是不可预测的。从实验观察中也清楚地看出，在这些分子内单链生物传感器中，两个状态之间的FRET任何显著变化都必须主要由𝜅²而非r主导。

对于两个单独相互作用的蛋白质而言，情况则没有那么受限。在这里，FRET效率的大小可能仍然很好地由𝜅²主导，但结合与未结合分子之间的差异显然是距离问题。这并不意味着FRET永远不能作为分子标尺使用；它只是当𝜅²允许变化时，给分离距离的确定增加了不确定性。𝜅²的变化程度可以通过各向异性测量（在无FRET的情况下）来估计，这提供了有关荧光分子在激发态期间的取向自由度的信息[20]。

关于𝜅²值的统计分布和旋转移动性的影响，我们推荐参考范德梅尔（van der Meer）的出版物[21]。相对偶极取向对FRET效率的影响，以及由此对距离计算的影响，是一个复杂的问题，高度依赖于取向平均制度。如果所有分子都是静态但随机取向的，或者所有分子都是动态的并且可以随机取样所有取向，则误差相对较小。对于静态随机和（部分）动态制度，最可能的距离仍然接近在假设𝜅²=2/3时获得的值。在动态情况下，𝜅²被平均，并且最终将达到确切值2/3。

特殊的荧光共振能量转移（FRET）条件#

如前所述，FRET的距离依赖性是指供体分子在其寿命期间与同一受体分子相互作用的情况。此外，这两个荧光团可以在三维空间中无障碍地相互接近。然而，有三种条件会影响FRET的效率：供体寿命期间的扩散、供体与多个受体的相互作用，以及限制供体-受体相互作用方向自由度的几何结构。

光谱变化#

衰减动力学#

频域荧光寿命成像显微技术（FLIM）#

时域荧光寿命成像显微技术（FLIM）#

在时域FLIM中，时间编码的激发模式是一个（或一串）超短脉冲。这些脉冲的指数式“弥散”与荧光寿命之间建立了直接且可能更直观的联系（图13.9b）。在激发脉冲作用时，荧光分子被激发到激发态，并通过发射返回基态。需要注意的是，激光的重复频率应与荧光寿命相匹配，以确保荧光分子在下一个激发脉冲到达之前能够完全耗尽其激发态。由于大多数现代光源，例如锁模激光器和双光子激光器，都以约80 MHz的重复频率运行，这意味着荧光寿命不应超过几纳秒。在实际应用中，这一限制非常适合于常见荧光团的寿命分布，因为它们的寿命都在10纳秒以下。事实上，如果不转向慢100倍的微秒级磷光衰减过程，很难找到寿命更高的合适荧光团。衰减非常慢的荧光团会导致光子大量积累，并溢出到下一个计数周期，而这些光子与原始脉冲已无关联。

平均寿命，多寿命拟合#

具有相似发射光谱但不同寿命的发射体混合物会产生复杂的荧光衰减，其平均寿命由单个发射体的相对贡献（浓度、量子产率）加权得出。相对寿命差异（RLD）的主要缺点是它只能提供平均寿命，而无法提取潜在的寿命差异。此外，即使采用多个时间门控，时间门控的时域测量通常也缺乏分解复杂信号的分辨率。在单一调制频率下进行的频域测量同样如此，尽管在这种情况下，用户可以通过相位移（𝜏𝜙）确定的寿命与解调（𝜏m）确定的寿命之间的差异来感知潜在的异质性，这种差异会随着异质性的增加而增大。此外，即使激发是在单一谐波频率下驱动的，探测器也会引入更高频率，从而允许在混合物中解析出两个独立的寿命。这些方法由多个研究小组开发，统称为全局拟合方法。唯一能够直接获取多种寿命物种的方法是时间相关单光子计数（TCSPC）；然而，包含多种寿命物种的代价是每种额外物种的光子需求急剧增加（一个寿命需要约1000个光子，两个寿命则需要10倍于此）。特别是在光子数较低的情况下，拟合程序可能不会返回正确结果，即使标准拟合质量评估指标表明拟合成功。有关优化荧光寿命成像显微（FLIM）测量时需要考虑的方面概述，请参阅[52]。荧光共振能量转移（FRET）是一种产生内在异质样本的条件，因为在实际情况中，只有一部分供体分子预计会发生FRET。在大多数情况下，从平均寿命估计的FRET效率将为所报告的过程调查提供足够且有用的对比度。用户通常会观察到仅表达供体荧光团的细胞具有均匀且已知的寿命。该值随后用于从观察到的较短寿命（当供体和受体都表达时）估计表观FRET效率，这指示了例如供体和受体标记蛋白质的结合或包含两种荧光团的单分子FRET生物传感器构象的变化。

从FRET/寿命到物种#

许多生物学应用不仅限于对比度；它们旨在获取有关参与分子的比例的知识。因此，目标是提取复合物的FRET效率和复合物的相对比例。此外，绝对FRET效率很少具有信息性，因为它更多地取决于FRET测定的设计方式，而不是相互作用蛋白质的配置。难以预测、确定或操控的偶极取向影响FRET效率，这增加了这一难度。

频域中的全局分析[53]或时域中的寿命拟合的一个困难在于，它依赖于可能不会产生正确答案的拟合程序。另一个困难是，这些拟合程序是在一系列可能不成立的假设下进行的。通常，由于细胞自身荧光污染的异质性，还会出现进一步的困难。系统很快变得非常复杂，并且从生物系统中明确无误地解决问题所需的光子数量可能变得高不可攀。因此，最近开发了一种用于FLIM分析的方法，该方法避免了拟合（即，立即可解释），并提供了与荧光图像中包含的定位信息的反馈耦合。开发了一种称为相量图的图形表示方法，它是寿命数据的正弦和余弦变换的极坐标表示，允许对寿命异质性进行定量解释，并从中得出FRET效率和分数贡献[54]。我们推荐阅读一篇关于相量方法背景和历史的简短综述[55]。该方法对生物医学用户最有用的方面可能是，它能够将从极坐标表示中获得的信息与荧光图像中的空间位置联系起来。用户可以在极坐标图中选择一个数据云，并查看这些相干行为的像素在图像中的位置，反之亦然。这种直观的图像驱动分析对于荧光寿命调查在现代细胞生物学和其他生物医学应用中的广泛应用具有巨大潜力。