生物正交活化探针用于精确荧光成像
摘要
在过去的二十年中，生物正交化学经历了非凡的发展，挑战了生物学和医学中的传统假设。为生物正交应用量身定制的探针设计方面的最新进展满足了对精确成像日益增长的需求，促进了复杂生物系统探索。这些最先进的探针可以在活生物体内实现对生物物种和事件的高度灵敏、低背景、原位成像，实现与所研究生物分子大小相当的分辨率。这篇综述对各种类别的生物正交活化原位荧光标签进行了全面考察。它重点介绍了生物正交化学在精确原位成像方面的复杂设计和优点，同时还讨论了这一快速发展领域未来的前景。
引言
分子生物影像学利用先进的成像技术，如荧光成像、拉曼成像、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）、光声成像和单光子发射计算机断层扫描（SPECT），深刻影响着生物医学研究、疾病诊断和治疗监测以及临床诊断。在这些方法中，荧光成像是特别令人感兴趣的，因为它使我们能够定量地可视化和理解从细胞器官到整个生物的高时空分辨率的活体系统中的分子过程。荧光探针的发展是荧光成像的关键工具，在推进荧光成像技术方面发挥着关键作用，使我们能够更深入地理解生物过程。在最近的几十年里，研究人员已经成功开发出许多荧光探针，用于检测和追踪细胞动力学、分子相互作用和组织结构。
传统的荧光探针涉及直接使用发光染料以及染料偶联生物分子（例如抗体），已被广泛用于为细胞和组织染色以进行荧光成像。虽然这些探针有效， 但通常会遇到与细胞和组织环境内的非特异性结合相关的挑战，从而导致荧光分析和成像中准确性和特异性的降低。区分真信号和非特异性噪声的能力对于在荧光成像中获取可靠且有意义的信息至关重要，尤其是在生物系统的复杂背景下。荧光团的光漂白是传统荧光成像中的另一个主要问题。长时间暴露于光激发会导致荧光团不可逆降解，限制成像实验的持续时间以监测生物标志物的演变。此外，来自细胞和组织内源性荧光分子的自发荧光给荧光分析和成像带来了另一项挑战。诸如黄素和脂褐素之类的固有荧光团的存在会产生强烈的背景信号，与荧光探针发出的信号重叠。因此，将特异性探针信号与固有背景自发荧光区分开来对于实现可靠的成像结果至关重要。
人们越来越重视开发具有增强特异性、最小化非特异性相互作用和改善光稳定性的先进荧光探针。为设计新一代探针而探索的创新策略包括将响应元件纳入探针，以及设计具有优异光物理性质的替代荧光团，例如响应性金属配合物、聚集激发发射 (AIE) 探针、和近红外 (NIR) II 荧光染料。简而言之，虽然荧光探针为生物成像领域做出了重大贡献，但认识和减轻传统探针的局限性对于开发和验证新的探针至关重要，这些新的探针可以检测和成像活细胞和生物中的生物分子。
生物正交化学是指在不中断生物分子合成或生化过程的情况下，在生物环境中发生的反应。该术语由Carolyn Bertozzi小组于2003年率先提出，可能源于数学概念 “正交”（orthogonality），表示独立变化。在过去的二十年里，生物正交化学已经发展成为生物研究的关键工具。生物正交反应的主要标准包括：在生理条件下操作、选择性和高产产品的形成、对生物制剂的适应性、低浓度下产物的快速形成以及产物的稳定生成。此外，生物正交化学涉及在生物系统中天然不存在的功能基团，确保在复杂环境中的兼容性。这种方法既能精确研究细胞过程，又能保持生物的完整性，极大地推动了生物研究的发展。值得注意的是，以铜催化的叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）、Staudinger连接反应、逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应、和1,2-氨基硫醇-2-氰基苯并噻唑（CBT）点击反应为代表的生物正交化学，近年来在选择性生物分子标记、靶向成像、和体内药物递送等方面引起了广泛关注。
信号单元（化学报告器）和生物正交点击反应柄是生物正交激活探针的两个关键组成部分。已报道的生物正交探针大多是通过将点击反应柄直接与荧光染料结合而设计的，在生物正交反应之后，严格洗涤以去除任何未反应的生物正交探针对于减少背景荧光至关重要。随后开发了生物正交活化探针以增强成像精度并简化样品预处理程序。这些响应探针最初表现出微弱的荧光，并且可以通过生物正交反应激活，这种选择性激活使探针仅在发生生物正交反应的区域发出荧光。因此，对于用生物正交活化探针染色的细胞、组织和活生物体的分子荧光成像，无需额外的洗涤步骤。这种生物正交活化探针在无法对样品进行大量洗涤的情况下特别有用。
在本综述中，我们对过去十年间生物正交活化荧光探针技术的发展提供了一个全面的概述，特别是关注于精确、免洗和原位生物成像中的应用。我们根据生物正交反应的类型对活化探针进行了总结，在每个小节中对每种反应进行了简洁的介绍。随后，我们概述了近期的研究进展，确定每种生物正交反应的局限性，并讨论了未来的主要方向。接下来是一个全面的总结，强调了生物正交活化探针在实现精确的原位生物成像中面临的挑战和机遇。
通过不同活化机制产生的生物正交活化探针
生物正交激活探针的发展在很大程度上依赖于生物正交激活的基本机制。自 2003 年以来，已发现并成功采用了八类不同的生物正交活化机制来开发用于精准生物成像的活化探针（方案 1）。这些生物正交活化机制包括施陶丁格连接、Cu(i) 催化的叠氮化物-炔烃环加成反应 (CuAAC)、逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应 (IEDDA)、1,2-氨基硫醇-2-氰基苯并噻唑 (CBT) 点击反应、应力促进的叠氮炔环加成反应 (SPSAC)、腈亚胺-炔烃环加成反应、光点击反应和生物正交纳米酶催化的反应。在本节中，我们将提供对基于八种生物正交活化机制的生物正交活化探针开发的进展以及用于精确荧光成像的特定探针的见解。
方案 1 基于八个活化反应的生物正交活化探针的开发时间表。
Staudinger 缩合反应
Staudinger 缩合反应是一种已建立的生物正交反应，衍生自经典的 Staudinger 还原反应。该生物正交反应涉及使用有机叠氮化物和三苯基膦官能团作为关键组分。该生物正交反应的基本机理如图 1A 所示。与传统的 Staudinger 还原反应途径不同，中间产物氮杂叶立德与相邻的酯发生反应，生成胂，胂随后分解，生成稳定的酰胺键和氧化膦。该反应的二级速率常数 (k2) 在乙腈中约为 10-3 M-1 s-1。在反应过程中，膦被氧化，形成氧化膦，同时酯被裂解，释放甲醇。这些并发过程已被用于开发先进的膦探针，这些探针通过 Staudinger 缩合反应激活。
图1. Fluorescent probes based on Staudinger ligation. (A) Proposed mechanism of Staudinger ligation, (B) chemical structure and cell imaging of Glu-HT-Me; (C) chemical structure and cell imaging of Se-NR; (D) chemical structure and cell imaging of DCX-TPP.
Staudinger 连接反应以生物惰性和生物相容性著称，因为两个反应物都是完全非生物的，这样就能在所有生物区室中进行选择性连接，使其有别于醛或酮缩合反应。这一反应在Bertozzi 的研究中得到推广，现已发展成为开发生物正交探针和调节生物过程的标准方法。在此，我们将探讨使用基Staudinger 连接反应的生物正交探针对生物体进行精确原位成像的最新进展。
可在特定细胞环境中发生的化学反应有助于研究生物过程和细胞功能工程。2000 年，Bertozzi研究小组在这一领域取得了里程碑式的成就，他们提出了一种化学转化方法，可以在细胞基质内的复杂功能化生物聚合物之间精确地形成共价加合物。这种转化连接受Staudinger反应的启发，通过叠氮分子与定制的三芳基膦的偶联，促进酰胺键的形成。叠氮和三芳基膦这两个反应单元都是合成的，在化学上与内源性细胞成分正交。通过利用新陈代谢途径，叠氮化物可通过合成的叠氮糖结合到细胞表面的糖共轭物中。然后，叠氮化物选择性地与生物素化的三芳基膦反应，产生稳定的细胞表面加合物。这项研究为利用生物正交反应进行简单的细胞表面工程提供了一条新途径。
图2. Metabolic delivery of chemically orthogonal functional groups, ketones and azides, to cell surfaces by unnatural sialic acid biosynthesis. 图片来源
除用于细胞表面修饰的糖共轭物外，细胞葡萄糖摄取在能量生成中也起着至关重要的作用，并与各种代谢紊乱有关。为了了解细胞葡萄糖摄取过程的细节，Liang及其同事开发了一种生物正交荧光探针，由Glu-HT-Me和叠氮化葡萄糖两部分组成，用于观测活细胞中的葡萄糖摄取（图1B）。由于光诱导电子转移（PeT），Glu-HT-Me的荧光被猝灭，而在25分钟内被内化的叠氮化葡萄糖激活后，荧光显着增加（20倍增强）。荧光“关闭”到“打开”响应允许无洗涤方式监测葡萄糖摄取动态。更有趣的是，由于抗癌药物治疗、糖酵解和转运中的不同葡萄糖通量，这种生物正交点亮荧光探针能够区分癌细胞和正常细胞。证实了该探针在追踪多西环素诱导的K-rasG12V癌基因细胞系统中葡萄糖摄取波动的潜在应用。
图3. 用于观测活细胞中的葡萄糖摄取的正交反应探针图片来源
除了在细胞环境中的生物正交反应之外，生物正交部分已被用于活化光敏剂的开发以及用于反应性生物分子检测的荧光探针。2019 年，Liu 小组合成了一种 π 延伸的硒罗丹明 (Se-NR，图 1C)，它在经过红光照射之后能有效产生单线态氧（ΦΔ = 0.35）。利用对 Se-NR 螺环化的精确控制，他们通过将胺基掩盖为叠氮化物，开发出了一种生物正交活化光敏剂（Se-NR-Az）。即使在红光照射下，这种 Se-NR-Az 也会表现出低细胞毒性。然而，Se-NR-Az 与膦的生物正交反应导致形成光细胞毒性化合物，即 Se-NR。这种生物正交活化光敏剂随后被用于通过生成活性氧物质 (ROS) 来控制性地抑制 HeLa 细胞的生长。
图4. Design strategy and chemical structures of bio-orthogonally activatable photosensitizer图片来源
在另一个例子中，Zhang 和同事利用三芳基膦生物正交分子开发了一种可活化探针 （DCX-TPP），用于检测硝基（HNO），这是一种通过还原和质子化从一氧化氮 （NO）中衍生出来的 ROS（图 1D） 。探针 DCX-TPP 是通过酯键将生物正交的 HNO 识别分子（二苯基膦苯甲酰基）与近红外荧光团结合在一起而开发的。该探针起初不发光，但在 HNO 催化下发生氧化，从而活化并发出红色荧光。探针 DCX-TPP 可在 10 分钟内检测到 2-80 μM 的 HNO，检测限（LoD）为 0.05 μM，并能在活细胞中观察到内源性 HNO。
图5. Sensing mechanism of DCX-TPP for HNO detection.图片来源
总之，经典的Staudinger连接使用叠氮化物（一种小型的、生物相容性的官能团，无缝集成到生物分子中）与膦进行选择性反应。然而，其反应动力学缓慢，通常导致标记效率低下。虽然富含电子的膦可以加速生物正交反应，但膦在生理条件下的快速氧化给连接过程带来了重大挑战。因此，通常需要高浓度的膦试剂来确保有效的生物正交反应。然而，过量的膦试剂会导致荧光成像过程中背景信号增加，从而导致假阳性结果。尽管Staudinger连接仍然是生物正交探针开发中最重要的活化机制之一，但最近的研究集中在探索各种场景下的更快速的连接技术。
铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应
叠氮化物和末端炔基官能团体积小，主要参与微弱偶极相互作用，对所连接分子的功能特性影响最小。叠氮化物和炔烃在生物系统中均表现出低反应性，这使得它们在被特定条件或催化剂触发之前能够完整地穿过细胞。有机叠氮化物和炔烃的 Huisgen 1,3-偶极环加成反应生成 1,2,3-三唑，该反应通常对于生物应用而言太慢（方案 2A）。然而，Meldal 和 Sharpless 率先引入了 Cu(i) 催化剂（方案 2B），大幅将三唑的形成加速了 1 亿倍。Cu(i) 催化的叠氮化物-炔烃环加成反应 (CuAAC) 促进仅形成 1,4-二取代三唑，在大小和几何形状上模拟天然肽基连接体，并对热裂解和化学裂解具有卓越的稳定性。
Scheme 2 Illustration of the (A) Huisgen reaction and (B) CuAAC reaction.
CuAAC 具有模块化、与水性条件兼容、基本无副产物等特点，促进了点击反应的成功进行。通过使用各种催化剂，包括简单的 Cu(i) 盐、小分子 Cu 结合配体和各种材料，CuAAC 在有机合成、聚合物功能化 、药物发现和化学生物学中的应用已得到证实。虽然天然存在的叠氮化物很少见，但是通过良性的化学转化或标记的代谢产物的代谢掺入，可用叠氮化物或炔烃标记蛋白质、脂质、寡核苷酸以及细胞表面部分，进而实现其与正交标记的配偶体的偶联。
近年来，水溶性 Cu(i)结合配体的开发极大地推动了 CuAAC 在生物正交生物共轭中的应用，通过与内源性 H2O2 的芬顿反应减缓了由 Cu(i) 介导的 ROS 形成的限制。这些配体能稳定 Cu(i) 的氧化态，加速 CuAAC 反应，同时最大限度地减少通过 Fenton 反应产生的 ROS。具有附加特征（如清除 ROS）的配体将 CuAAC 的用途扩展到了要求更高的生物应用中，包括对活细胞表面的原位标记、标记复杂细胞混合物中的酶或生物分子、细胞区室内的快速点击反应，以及为超分辨显微镜标记各种细胞结构的多功能荧光染料。在此，我们对过去十年中 CuAAC 反应在原位精密成像领域的应用提供了一个全面的概述，该概述按所开发探针的类型进行分类。
香豆素
Zhang 及其同事设计了一种炔烃功能化的香豆素荧光糖蛋白质组探针，以在活细胞内对唾液酸糖缀合物进行可视化（图 2B）。利用香豆素成熟的 CuAAC 荧光特性，在香豆素的 7 位引入炔基，将其转化为荧光前体。4 位上的三氟乙基酯保护末端羧基用于增强水溶性，并提供了在生物正交标记之前进行额外修饰的机会。该设计使得炔烃-叠氮化物环加成反应能够在水溶液和 HeLa 细胞中与含有叠氮化物官能团的甘露糖类似物发生反应。鉴于点击反应后的荧光“关-开”响应，在细胞成像前无需额外洗涤。
图. 6 Coumarin fluorophore-based bioorthogonal probes using copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. (A) Illustration of the CuAAC activated coumarin probes; (B) the structure and cell imaging of the alkynyl modified coumarin; (C) the structures of bis-azide coumarin and biscyclooctynylated peptides; (D) the structures of the profluorescent coumarin derivative (C1) and azido-naphthalimide and bioimaging in different cell lines.
Kele 等人开发了一种用于两点生物正交标记的双叠氮化物荧光探针 66，用于标记双环辛炔化肽（图 6C）。该探针对含有两个环辛炔基序的极性六肽表现出强烈的荧光增强。理论计算揭示了荧光“关-开”响应取决于探针芳香核之间的二面角。在筛选的双环辛炔化肽中，极性六肽表现出接近最大的荧光性。这些双叠氮化物为开发生物正交探针提供了一种新方法，用于对含有两个基因编码的环辛炔基序的蛋白质进行特异性、荧光两点标记。
类似地，刘及其同事开发了一种双笼杂双功能连接体，一种具有正交双“点击”基序的荧光香豆素衍生物 (C1)，用于蛋白质/抗体生物偶联物的功能化（图 D）。核心分子 C1 在一个香豆素骨架上同时含有 CuAAC 和 Michael 加成位点，用于分别与叠氮化物和硫醇官能化的前体进行“点击”式反应。在 Cu(i) 催化的作用下，C1 的乙炔基与萘酰亚胺 QNAM-N3 发生点击反应，C1 的烯基酰胺/酯单元与硫醇官能化的抗癌胚胎抗原 (ACEA) 反应生成 QNAM-C1-ACEA，并开启香豆素在 435 nm 处的发射。醌笼萘酰亚胺表现出微弱的荧光，而在醌氧化还原酶 (NQO1) 触发的醌笼裂解后，发射可以开启（λem = 530 nm）。此外，香豆素的发射与萘酰亚胺的吸收重叠，允许在 365 nm 激发时发生 FRET，促进了 QNAM-C1-ACEA 的比率荧光响应，用于 NQO1 的分析和成像。这种双笼策略和模块化/荧光化制备功能性蛋白质/抗体偶联物提供了多功能性，有可能与其他生物正交反应性方法相结合。
铜是人体必需的元素，与神经退行性疾病有关，尤其是阿尔茨海默病，其特征是 Aβ 聚集和铜积累。除了外源 Cu 催化剂外，Qu 小组还发现 Aβ 斑块中的 Cu 积累能有效催化叠氮-炔烃生物正交环加成反应，从而实现香豆素的荧光活化，并在活细胞、转基因 AD 模型秀丽隐杆线虫 CL2006 和三重转基因 AD 小鼠的脑片中合成药物（图 3A）。合成的药物破坏了 Aβ-Cu 聚集体，缓解了瘫痪和运动缺陷。这种原位方法是一种用于AD治疗的自触发药物合成方法，开创了在生理环境中利用原位Cu进行点击反应的先河。
Aβ40–Cu-catalyzed fluorogenic click reaction.图片来源
Coumarin fluorescent probes based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. (A) The structure, flow cytometry detection and worm in situ imaging of the coumarin-Aβ-Cu system; (B) the structure, flow cytometry detection and in situ cell imaging of the coumarin–MCNs–Cu system; (C) the structure and in situ cell imaging of the coumarin–DNAzyme–Cu system; and (D) the structure and in situ cell imaging and plumule imaging of the coumarin–MCNs/GSH–Cu(ii) system.
异质铜纳米颗粒（CuNPs）具有稳定性和生物安全性更强的优势，是促进 CuAAC 反应的有前途的竞争者。Qu 等人的研究利用一种生物兼容的异质铜纳米催化剂促进了近红外光下的 CuAAC 反应，该催化剂是为研究体内外光动力效应和光热效应而开发的（图 3B）。具体来说，近红外光照射后，铜纳米粒子附着在介孔碳纳米球（MCNs-Cu）上，通过光动力和光热（η = 50.6%）效应分别在局部微环境中产生活性氧 (ROS) 和加热，从而促进惰性 Cu(0) 转化为 Cu(i)，加速催化 CuAAC 过程。正如在近红外照射下的细胞和小鼠模型中观察到的那样，这种协同效应增强了对一种前荧光团（3-叠氮-7-羟基香豆素）的活化。除了使用 CuNP 作为 CuAAC 反应的催化剂外，来自同一研究小组的进一步研究还使用 DNA 酶增强生物正交催化进行靶向协同癌症治疗。DNA 酶的结构设计利用了 DNA 结构和底物相互作用，实现了体内精确定位成像和癌症细胞中的高效前药激活，用于协同癌症治疗（图 3C）。
Scheme 1. Illustration of the Construction of Heterogeneous Copper Nanocatalyst and NIR-Dual-Promoted CuAAC Reaction
此外，CuAAC 反应活化的 3-叠氮化物-7-羟基香豆素已经被探索用于检测谷胱甘肽 (GSH)、抗菌抗药细菌和食源性病原体的荧光探针的开发。2021 年，Song 及其同事设计了一种由 GSH 触发的 MSN（介孔二氧化硅纳米颗粒）纳米反应器，其特点是具有 Cu(ii)-BTC 外壳，其中通过 GSH 原位还原生成的 Cu(i) 可用作催化剂（图 3D）。这种催化活性加速了炔烃和叠氮化物之间的生物正交反应，从而增强了负载在 MSN 内的 7-羟基香豆素和 4-乙炔苯甲醚的荧光。针对 GSH 检测对这些纳米反应器进行的评估，涵盖了从细胞到小麦胚芽的水平，证明了它们的稳健的生物相容性和检测植物中金属离子的潜力。因此，细胞内生物正交反应的监测可以推进精细化学在设计用于生物标记物检测的智能平台以及用于精准医疗的靶向药物合成的作用。
Fig. 1. (a) Construction of MPMs. (b) Principle for generating in situ fluorescence of the nanoreactor activated by GSH in cells. (1: 3-azido-7-hydroxycoumarin, 2: 4-ethynylanisole; in the stick model of molecules, red, blue, gray, and white balls represent oxygen, nitrogen, carbon, and hydrogen atoms, respectively.) (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
由于持续过度使用抗生素，抗生素耐药性对人类和动物的健康、环境稳定性、粮食和营养安全、经济发展以及社会公平与安全构成了全球性的威胁。检测病原体，尤其是抗生素耐药细菌，有助于应对这一威胁。基于香豆素衍生物的 CuAAC 活化探针已被用于食源性病原体的检测。例如，Gan 等人报道了一种简单、灵敏的现场生物测定法，用于检测食源性病原体，采用噬菌体 @DNAzyme 探针（3-叠氮化物-7-羟基香豆素，图 4A）。该探针对细菌菌株（以大肠杆菌为模型）显示出特异性，对荧光 CuAAC 点击反应具有催化效率。使用金纳米粒子修饰载玻片和噬菌体 @DNAzyme 催化的协同信号放大，使细菌快速、灵敏地现场测量成为可能，检测限 (LOD) 为 50 CFU mL−1，30 分钟内，可以用智能手机检测到。利用 CuAAC 反应，Yu 等人开发了一种快速生物正交非规范氨基酸 （BONCAT）标记方法，用于检测水生环境中的抗菌剂耐药细菌细胞（图 4B）。使用此系统，在 l-炔丙基甘氨酸孵育的大肠杆菌与 3-叠氮代-7-羟基香豆素进行 CuAAC 反应后，3-叠氮代-7-羟基香豆素的荧光开启。在抗生素（例如氯霉素）存在下，抗生素耐药性大肠杆菌可以在与 3-叠氮化物-7-羟基香豆素共培养 20 分钟内轻松识别。
Coumarin fluorophore-based bioorthogonal probes obtained using the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. (A) The structure and E. coli imaging of the Phage@DNAzyme probe, adapted with permission from ref. 71. Copyright 2023, American Chemical Society; (B) the structure and selective E. coli labeling of the azido-coumarin system, adapted with permission from ref. 72. Copyright 2022, American Chemical Society.
萘酰亚胺
萘酰亚胺及其具有炔基或叠氮化物功能化的衍生物也被用于开发生物正交激活的荧光探针（图 5A）。例如，利用炔烃与叠氮化物之间的特定反应，Yao等人引入了一种基于炔烃的萘酰亚胺荧光探针，该探针可以通过生物正交反应被激活用于检测叠氮化氢 (HN3)。该探针的发射因内部电荷转移（ICT）而被淬灭，与 HN3 点击后即被激活，对其他 ROS 和活性氮物种（RNS）具有高选择性。该探针用于活体 HeLa 细胞和斑马鱼幼体中 HN3 的荧光检测和成像（图 5B）。
Bioorthogonal fluorescent probes based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with a naphthalimide fluorophore. (A) Illustration and (B) chemical structure of the CuAAC activated naphthalimide probe for cell imaging. Adapted with permission from ref. 73. Copyright 2013, The Royal Society of Chemistry.
罗丹明衍生物
罗丹明衍生物已被广泛用于开发生物检测和成像的荧光探针，如 Bertozzi 及其合作者开发的用于细菌肽聚糖成像的生物正交探针（图 6A 和 B）。对于该探针，叠氮化物的作用是：（1）通过 PeT 对 Si- 罗丹明的发射进行淬灭；（2）用于生物正交化学的点击反应部分。值得注意的是，当探针与末端或应变炔烃发生点击反应形成三唑时，荧光增加了高达 48 倍。通过乙二醇取代进一步修饰产生的探针（图 6B）具有高水溶性，可在活细胞和细菌中进行 “免清洗 “标记。此外，还观察到叠氮-PEG3-羧基罗丹明 110 与环辛炔 d-丙氨酸类似物之间的无铜单击反应，从而实现了高灵敏度的肽聚糖（PG）成像，而单击反应则无需使用具有细胞毒性的铜催化剂。
Bioorthogonal fluorescent probes based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with rhodamine derivatives. (A) Illustration of the CuAAC activated rhodamine probe; (B) the structure and the wash-free mammalian cell surface labeling of the Si-rhodamine, adapted with permission from ref. 74. Copyright 2014, National Academy of Sciences; (C) structures of CalFluors 488, 555, 580, and 647 and their ability to enable the no-wash labeling of cell-surface glycoproteins on HEK 293T cells, adapted with permission from ref. 75. Copyright 2015, American Chemical Society.
在生物环境中，跨越可见光谱的生物正交荧光探针可精确显示代谢标记分子。为此，Bertozzi 等人报道了基于 PeT 荧光响应机制开发的高荧光叠氮探针（图 6B）。这些探针通过点击化学激活形成三唑类化合物，荧光增强效果显著，高达 283 倍，ΦF 为 0.74。利用类似的 PeT 机制，作者开发出了生物正交探针，使用不同的荧光团（包括 bodipy、花青和吡唑啉），这些探针被称为 CalFluors，发射波长从绿色到远红外，无需清洗步骤即可灵敏地检测生物分子。通过生物正交反应，实现了各种细胞环境（包括斑马鱼和小鼠脑组织切片）中炔烃标记的生物分子（聚糖、DNA、RNA 和蛋白质）的可视化。通过对罗丹明衍生物的进一步修饰，Zhang 等人利用荧光点击反应对细胞外的炔烃标记代谢物进行定量，从而开发出评估蛋白质工程成果的平台。这种方法有助于筛选和优化基于炔烃的生物合成工具。例如，膜结合双功能去饱和酶/乙炔酶 JamB 的探针在大肠杆菌中的活性提高了约 20 倍。
Detection of the alkyne in E. coli cultures using a fluorogenic probe. (a) Schematic of the biosynthetic pathway of 1 in XZ1 and the fluorogenic reaction with 4. (b) Azido fluorogenic probes (3–6) tested in this study. (c) Fluorescence of the culture supernatants upon reaction with 4. Heterologous proteins expressed in each strain are shown under the corresponding strain names. One-fold fluorescence enhancement corresponds to the signal obtained from the reaction with pure medium (∼500–1000 RFU). Error bars represent standard deviations from three measurements. 图片来源
BODIPY
BODIPY染料具有独特的发射特性，例如小的斯托克斯位移、窄的吸收带、尖锐的发射、高荧光量子产率以及优异的化学和光稳定性。以生物相容的BODIPY作为荧光团，Shie 等人开发了一种生物正交激活探针，用于监测代谢聚糖的细胞内位置，并通过多色标记研究活细胞糖基化模式（图 7）。携带叠氮化物部分的BODIPY探针可以通过 CuAAC 反应标记包含炔基团的多种糖缀合物。荧光标记表现出很高的信噪比，从而可以有效跟踪唾液酸化和 GlcNAcylation。该探针可用于标记细胞表面和细胞内唾液酸化的糖缀合物，并对 HeLa 和 PC9 癌细胞表现出位点特异性的双通道荧光成像。此外，BODIPY生物正交探针对糖基化糖蛋白和聚糖的荧光标记已通过基于 MS 的蛋白质组学分析进行了验证，证实该探针是细胞系统聚糖成像和糖蛋白组学分析的可靠工具。
Bioorthogonal fluorescent probes based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with bodipy derivatives. (A) Illustration of the CuAAC activated Bodipy probe for cell imaging; chemical structure (B) and cell imaging (C) of azido-Bodipy and Me-Tz-Bodipy. Adapted with permission from ref. 78. Copyright 2023, Wiley-VCH GmbH.
聚集诱导发光探针
聚集诱导发光 (AIE)是一个新兴的概念，由Tang小组率先提出，其中像四苯乙烯这样的非发光荧光团在聚集和固态时会发出强烈的荧光。生物正交激活的探针通常使用带有叠氮化物或四嗪 (Tz) 官能团的蓝色或绿色发射荧光团设计。为了提高生物正交探针的可用性，Liu等人在 2016 年引入了红光发射 AIE 荧光团 (AIEgens)，用于开发用于癌细胞成像和消融的生物正交激活探针（图 8）。由于分子的自由运动，探针最初在水中不发光，但与癌细胞表面叠氮功能化的聚糖发生反应后，探针就开始发光（图 8B 和 C）。此外，在可见光（λ = 400-700 纳米）照射下，AIEgens 可作为光敏剂产生具有细胞毒性的 ROS，从而实现对癌细胞的光动力消融。
Bioorthogonal probes for fluorescence imaging based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with AIEgens. (A) Illustration of the CuAAC activated AIEgen probe for cell imaging; chemical structure (B) and (C) co-stain of TPETSAI labeled HeLa cells with membrane tracker CellMask Green. Adapted with permission from ref. 80. Copyright 2016, Wiley-VCH GmbH.
将生物正交化学基团整合到合成聚糖中，然后与荧光探针进行点击反应，对于监测活系统中非天然聚糖的代谢糖工程生物过程至关重要。继之前的成功研究之后，Liu 小组设计了一种双靶向代谢前体 cRGD-S-Ac3ManNAz，选择性地靶向αvβ3 整合素过表达的 MDA-MB-231 癌细胞，通过受体介导的内吞作用将其内化，随后在 GSH 介导的 cRGD-S-Ac3ManNAz 二硫键裂解后生成叠氮标记的聚糖（Ac3ManNAz）。此外，作者还开发了一种生物正交荧光探针 TPEBAI，用于特异性癌细胞标记（图 9A）。TPEBAI 最初在水介质中是无荧光的，但在叠氮点击反应后会显示出亮荧光，从而实现选择性癌细胞成像。TPEBAI 强大的 1O2 生成能力还允许在光照射下进行图像引导的癌细胞消融。正常细胞的αvβ3整合素表达和细胞内GSH水平较低，在光照射下TPEBAI的标记作用极小，毒性也可忽略不计，因此具有精确的癌细胞成像和消融能力。
AIE probes for bioorthogonal reaction based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. (A) The structure and confocal images of TPEBAI labeled MDA-MB-231/MCF-7/293T cells. Adapted with permission from ref. 81. Copyright 2018, American Chemical Society; (B) the structure, overlay images of 4T1 cells and in vivo imaging of BCN-TPET-TEG. Adapted with permission from ref. 82. Copyright 2018, Wiley-VCH GmbH; (C) the structure and TPEPA-selective metabolic labeling of Gram-negative (E. coli) and Gram-positive bacteria (S. aureus) with Kdo-N3 addition. Adapted with permission from ref. 83. Copyright 2020, American Chemical Society.
由于共价连接，使用活化探针进行生物正交标记通常在肿瘤的成像和药物递送方面表现出比主动靶向策略更好的性能。例如，Liu等人开发了一种用于体内生物正交荧光肿瘤标记的 AIEgen 激发荧光探针（BCN-TPET-TEG，BCN= 双环[6.1.0]壬-4-炔）（图 9B）。BCN-TPET-TEG 在水性介质中表现出低背景荧光，并与正常组织的非特异性相互作用极小。具有宽可见光吸收光谱（400-600 nm）和明亮的近红外发射（λem = 700 nm），BCN-TPET-TEG在与肿瘤细胞上存在的叠氮基团反应后迅速开启发射，促进了快速的肿瘤特异性成像。此外，光敏剂能力实现了有效的图像引导光动力肿瘤治疗。
除了通过光动力疗法进行肿瘤特异性标记和消融外，Liu 的研究小组还开发了基于 AIE 的生物正交探针，用于特异性细菌鉴别和生物膜根除。这种探针在水基环境中具有极佳的水溶性和最小的荧光。在与通过新陈代谢过程设计到细菌上的叠氮基团反应后，TPEPA 在 680 纳米波长处的发射被点亮，从而实现了荧光成像和细菌鉴别，即使用 Kdo-N3 的革兰氏阴性（G-）大肠杆菌和使用 d-Ala-N3 的革兰氏阳性（G+）金黄色葡萄球菌。在光照射下产生的 ROS 使生物正交活化探针 TPEPA 可用作光敏剂来精确消融细菌。利用病原菌的细胞表面成分对 G+ 和 G- 细菌进行特异性区分，Liu 等人利用生物正交荧光激活探针 TPPB 和 BPTZ 设计了一种基于荧光的革兰氏染色方法（图 10A）。通过菌株促进的炔吖环加成反应（SPAAC）和具有反向电子需求的 Diels-Alder 反应（DARinv），将 Kdo-N3 和 Ala-CP 代谢掺入细菌表面膜，从而实现选择性标记。TPPB 针对的是 G- 细菌的特征性 LPS，而 BPTZ 则同时标记 G+ 和 G- 细菌，从而以高选择性和高灵敏度明确区分两种细菌（图 10B）。
Bioorthogonal probes for bacterial imaging based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with an AIEgen. (A) The structures of TPPB, Kdo-N3, BPTZ and Ala-CP, (B) metabolic dual labeling of G− bacteria (E. coli) and G+ bacteria (S. aureus) after being co-cultured with solution and then treated with TPPB, Kdo-N3, BPTZ and Ala-CP. Adapted with permission from ref. 84. Copyright 2021, American Chemical Society.
其他荧光材料
除了上述讨论的体系，其他荧光分子（如甲基紫、苯并噻唑鎓和 8-氨基喹啉）也被用于开发 CuAAC 激活探针，以实现精确的原位成像。例如，Duan 等人使用甲基紫作为叠氮化荧光团，开发了一种基于叠氮化物-炔烃环加成的探针，用于活细胞的比率荧光标记和成像（图 11A）。最初，叠氮化甲基紫 (Acv) 在 566 nm 处发射，但点击反应后，由于三唑环中的电子密度降低，发射波长变为 620 纳米，实现比率荧光监测。该探针用于炔丙基胆碱标记的 MCF-7 细胞和二苯并环辛炔标记的 MCF-7 细胞的比率荧光成像。
Bioorthogonal probes based on the copper(i)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition with other fluorophores. (A) The structure of azido-cresyl violet and ratiometric fluorescence imaging before and after click reaction. Adapted with permission from ref. 85. Copyright 2015, American Chemical Society; (B) the structure of FI-DIBO/BSA-N2 and target protein labeling. Adapted with permission from ref. 86. Copyright 2015, Wiley-VCH GmbH; (C) the structure and cell imaging of azido-a/b. Adapted with permission from ref. 87. Copyright 2016, American Chemical Society; (D) the structure and two-photon cell imaging of AQ. Adapted with permission from ref. 88. Copyright 2020, Wiley-VCH GmbH; and (E) the structures and nucleus imaging of TOA and TOT, adapted from ref. 89, licensed under CC-BY 4.0.
2015 年，Boons 及其同事推出了一种与环丙烯酮分子融合的二苯并环辛炔衍生物 Fl-DIBO，它能够在不使用催化剂的情况下快速发生应变促进的环化反应（图 11B）。Fl-DIBO 能与叠氮化物、硝基、腈氧化物以及单取代和二取代重氮衍生物快速反应。虽然与某些化合物反应产生的产物量子产率较低，但与 Fl-DIBO 相比，单取代重氮试剂产生的 1H 吡唑衍生物的荧光增强了约 160 倍，亮度增加了 10 000 倍以上。然后，Fl-DIBO 被用于重氮标记蛋白质的精确无背景荧光标记，证明了重氮衍生物作为生物大分子标记的潜力。 Kele 等人还利用带有叠氮基团的红色发光荧光苯并噻唑鎓二甲基染料与炔烃目标进行生物正交连接87。弱荧光探针与炔烃修饰的寡核苷酸发生 CuAAC 反应后，相应的三唑类产物呈现可见光激发和近红外发射，并具有较大的斯托克斯位移和较高的量子产率（ΦF 高达 0.7）。对于炔烃官能化目标物，通过刚性（乙炔基）或柔性（乙基）连接体将 DNA 与苯并环辛炔基结合，可实现 DNA 链的无铜点击反应标记。利用转染了环辛炔化 DNA 的 HeLa 细胞进行的体外评估证实，细胞吸收环辛炔化 DNA 无毒性，可特异性标记目标 DNA，背景荧光可忽略不计，有利于荧光细胞成像（图 11C）。同样，Németh 小组89 开发了另两种生物正交探针，它们带有喹啉单元和 DNA 敏感框上的叠氮或 Tz 基序（分别为 TOA 和 TOT），用于检测 DNA 蛋白相互作用（图 11E）。 生物正交激活和体内精确成像对生物过程的研究非常重要，但由于激发光的组织穿透力有限，这仍然是一项挑战。在此背景下，Zhu 等人88 利用弱荧光 8-氨基喹啉（AQ）支架开发了一系列叠氮基发光生物正交探针，用于体内双光子荧光成像（图 11D）。这些探针与炔烃发生点击反应后，荧光增强效果显著（高达 1352 倍）。通过在 AQ 支架中引入各种苯乙烯基团，这些探针表现出卓越的双光子特性（δ = 542 GM，波长 780 nm）。广泛的生物成像实验验证了这些探针在活细胞/斑马鱼成像方面的多功能性，无需清洗步骤。值得注意的是，体内双光子成像实验展示了这些生物正交探针优于传统荧光团的性能，具有高信噪比和深层组织穿透力。