生物正交分子激活型光学成像与治疗#

摘要#

在过去二十余年中，生物正交化学在分子激活型光学成像与治疗这一背景下得到了蓬勃发展。该领域的一项关键创新成果是生物正交激活型光学探针（BioTOPs）的研发。这类探针通过将生物正交手柄与成像剂相结合，借助高选择性的生物正交反应原位激活光学信号，从而实现活体系统中生物分子的高对比度、实时可视化。此外，通过对信号激活进行精确的时空控制，BioTOPs 能有效最小化脱靶治疗效应。

本综述系统总结了生物正交激活型光学探针在设计与应用方面的最新进展：首先，探讨了生物正交激活型光学成像的核心——“两步预靶向策略”；其次，对用于信号激活的生物正交反应进行分类（包括施陶丁格连接、应变促进环加成、金属催化、酮/醛缩合、硼化合物介导以及硫醇选择性生物偶联等），并阐述了相关的激活机制（如点击释放、能量/电子去淬灭、空间位阻去淬灭、手柄脱笼、荧光手柄偶联及荧光自组装）。这些反应与机制的结合，赋予了探针可调的动力学特性与极高的信号激活倍数。最后，总结了该类探针在诊断与治疗领域的应用场景（从生物分子谱分析、图谱绘制，到癌症诊断、疾病特异性干预），并对其在分子诊断领域的未来变革潜力进行了展望。

1. 引言#

分子成像技术能够在细胞与分子水平上对生物过程实现无创可视化观察，在疾病早期诊断、疗效监测以及药物研发领域发挥着至关重要的作用。与磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）及计算机断层扫描（CT）相比，光学成像凭借成本低、灵敏度高且具备多重检测能力的优势，展现出独特的应用魅力，在临床前研究及部分临床场景中极具吸引力。随着探针设计技术的进步，可激活光学探针（Activatable optical probes）得到了快速发展。这类探针在受到特定刺激（如光、超声波、pH值、离子或酶）并被选择性激活之前，通常处于发光“关闭”状态（不发光或信号极低）。与在体内持续发光的“常开型”探针不同，可激活探针在体内循环过程中保持“静默”，仅在到达靶标部位后才会触发信号。这种特性不仅能将背景干扰降至最低，实现高信噪比，还能实现对信号激活空间与时间的精准控制。

然而，传统的可激活探针往往仅对一两种刺激产生响应，这种局限性使其在复杂生物环境中易受非特异性相互作用或生理波动的影响，从而产生脱靶激活，影响信号的准确性。

生物正交化学的出现为这一问题提供了新的解决方案。这类反应在生命系统内发生时具有反应快速、选择性极高的特点，且对天然分子或生物过程的干扰微乎其微。通过生物正交激活模式，成像信号仅能由特定的生物正交反应触发激活。

该技术通常采用“两步预靶向”策略：第一步，施用生物正交靶向剂（BioTA）。BioTA 由生物正交手柄（如叠氮化物、叔膦、四嗪或亲双烯体）与靶向模块（如核苷酸、单糖、氨基酸、抑制剂或抗体）构成，能专门针对目标生物分子（如 DNA、RNA、脂质、糖类或蛋白质）进行结合。第二步，施用生物正交激活型光学探针（BioTOPs），使其与预先结合在靶点的 BioTA 发生反应，进而触发原位信号激活。

BioTOP 通常由可激活成像剂（如生物发光团、荧光团、过渡金属配合物等）以及能产生淬灭作用的互补生物正交手柄组成。在与 BioTA 发生特定的生物正交反应之前，BioTOP 保持无信号或弱信号状态；而在反应发生后，淬灭效应被消除，从而产生强光学信号。

预靶向成像策略极大地优化了药代动力学特性，并提升了信号激活的特异性。在施用 BioTOP 之前，未结合的 BioTA 有充足的时间被代谢清除，从而最大限度地减少了脱靶相互作用和非预期信号。此外，生物正交反应的高选择性确保了信号仅在预设靶点产生，有效提高了成像的特异性与分辨率（见图 1a）。

图 1 双正交激活式光学成像。 a) 展示两步预靶向成像策略、生物正交靶向剂（BioTA）-生物正交激活式光学探针（BioTOP）对的设计方案，以及生物正交激活式光学成像的核心优势。b) 呈现具有关键特征的信号激活机制。c) 介绍生物正交激活式光学成像在体外实验与体内研究中的具体应用场景。

在生物正交激活成像中，信号激活主要通过以下六种机制实现，其中前三种尤为核心：

点击释放机制：生物正交反应直接触发 BioTOP 分子内部化学键（成像剂与手柄间的连接键）断裂，解除对成像剂的笼蔽效应，从而开启成像信号。
能量/电子去淬灭机制：BioTOP 与 BioTA 反应形成稳定的共价连接，通过能量转移或电子转移的变化消除手柄对成像剂的淬灭作用，实现信号自然恢复。
空间位阻去淬灭机制：反应引入特定的空间限制，抑制成像剂的自由旋转或非特异性聚集（这通常会导致非辐射衰变），从而激活信号。

此外，生物正交手柄脱笼机制通过外部刺激（如光、酶）控制手柄的反应活性，进一步提升成像精度。荧光手柄缀合机制无需额外成像剂，而是由两个非荧光手柄反应直接生成荧光产物。荧光自组装机制则在缀合过程中形成荧光纳米颗粒，适用于深层组织成像（图 1b）。

该技术在诊断与治疗领域展现出巨大应用潜力，涵盖代谢与基因分析、蛋白质图谱绘制、靶向细胞标记、癌症诊断以及疾病特异性干预等（图 1c）。

2. 用于激活型光学成像的生物正交化学#

2.1. 施陶丁格连接反应（Staudinger Ligation）#

2.1.1. 施陶丁格连接概述#

施陶丁格连接反应是三苯基膦与有机叠氮化物之间的反应。2000 年，Bertozzi 团队利用邻甲基酯基作为亲电陷阱，促使亚胺膦中间体发生环化，通过酰胺键将两部分连接起来（图 2a）。虽然初始速率较低（ $k_2=0.002\ M^{-1}s^{-1}$ ），但通过引入缺电子叠氮化物（如全氟芳基叠氮化物），速率可提升至 $139\ M^{-1}s^{-1}$ 。

图 2 基于施陶丁格连接的生物正交激活成像。 a) 施陶丁格连接的机制以及三苯基膦与各种叠氮化物之间的反应动力学。b) 基于施陶丁格连接诱导的生物发光团、ESIPT/ICT 荧光团或 FRET 荧光团/淬灭剂的点击释放的 BioTOP 设计。c) 基于施陶丁格连接诱导的 PET/ICT 荧光团的键非断裂电子去淬灭的 BioTOP 设计。d) 分别用于原始/无痕施陶丁格连接的光激活三苯基膦/硫代磷酸酯脱笼。

2.1.2. 施陶丁格连接诱导的点击释放#

此类应用多利用三苯基膦笼蔽成像剂（如荧光素底物或荧光团），阻断其信号输出。Cohen 等报道了三苯基膦笼蔽的荧光素，反应解笼后信号背景比高达 10 倍。该策略同样适用于 ESIPT 或 ICT 荧光团。对于 ICT 荧光团，解除笼蔽可恢复电子供受体平衡，在近红外区（740 nm）开启荧光。此外，三苯基膦也可作为连接体用于 FRET 系统（如罗丹明-BHQ 对），反应使二者分离并开启信号。

2.1.3. 施陶丁格连接诱导的电子去淬灭#

键非断裂激活策略通过改变 BioTOP 的电子构型激活信号。三苯基膦作为强给电子体，常通过光诱导电子转移（PET）淬灭相邻荧光团。反应氧化膦原子后，PET 效应消失，荧光激活。例如，膦-香豆素探针在反应后量子产率可增加 60 倍。

2.1.4. 三苯基膦/硫代磷酸酯解笼#

为解决三苯基膦易被氧化及背景干扰的问题，研究者开发了光激活的三苯基膦（利用 DMNB 保护）。照射后释放活性三苯基膦，实现对生物过程的动态、时空精准研究（图 2d）。

2.2. 狄尔斯-阿尔德（DA）反应#

2.2.1. 四嗪连接概述#

四嗪连接（IEDDA 反应）动力学极快（ $k_2$ 最高可达 $10^6\ M^{-1}s^{-1}$ ）。在该反应中，1,2,4,5-四嗪与亲二烯体发生 [4+2] 环加成并释放氮气（图 3a）。

图 3 基于点击释放机制的四嗪连接生物正交激活成像。 a) 四嗪连接的机制。b) 基于四嗪连接诱导的荧光团点击释放的 BioTOP 设计。四嗪连接反应包括四嗪-TCO 反应、四嗪-异腈反应和四嗪-乙烯基醚反应，反应动力学总结如图。c) 示例荧光团的化学结构，包括发射波长和荧光激活倍数。

2.2.2. 四嗪连接诱导的点击释放#

四嗪与反式环辛烯（TCO）的反应是目前最快的生物正交开启反应。通过轴向 TCO 衍生物笼蔽荧光团，利用反应后的自消除过程释放游离成像剂。近期研究通过结构优化，已将释放产率提升至 99% 以上。此外，四嗪-异腈反应及四嗪-乙烯基醚反应也提供了极佳的信号开启方案，前者激活倍数显著（如达 1210 倍），后者稳定性优异。

2.2.3. 四嗪连接诱导的能量/电子去淬灭#

四嗪基团通过 FRET、PET 或 DET 机制强效淬灭相邻荧光团。反应后四嗪结构破坏，猝灭作用解除（图 4a）。许多荧光团（如香豆素、BODIPY、金属配合物等）已基于此机制构建了高性能 BioTOP。

图 4 基于四嗪连接的通过键非断裂机制实现的生物正交激活成像。 a) 四嗪连接诱导的能量/电子去猝灭机制，包括吸收光谱重叠说明及能级示意图。b) 基于荧光四嗪-亲二烯体共轭且不掺入成像试剂的生物正交激活探针设计。c) 基于四嗪连接诱导的荧光团空间位阻去猝灭的生物正交激活探针设计。

2.2.4-2.2.6. 其他机制与脱笼策略#

四嗪连接还能诱导产生具有大斯托克斯位移的荧光共轭物，或通过扭转诱导解聚集（TIDA）机制开启信号。此外，通过物理笼蔽（如大环包封）或化学笼蔽（如光敏/酶敏二氢四嗪）可实现对反应活性的精确控制（图 5）。

图 5 基于四嗪连接的生物正交激活成像，通过四嗪/亲双烯体脱笼实现时空控制。 a) 四嗪/亲双烯体脱笼的机制，包括大分子主-客体识别、电化学、催化氧化、光或酶激活。b) 四嗪/亲双烯体的光响应性和酶响应性笼状化合物示例。

2.2.7. 其他杂狄尔斯-阿尔德（HDA）反应#

包括三嗪连接、吡喃酮-DA、亚硝基-DA 及醌-DA 等（图 6）。这些反应在特定场景下极具优势，如醌类反应（SPOCQ）动力学极快，或利用光烯醇化产生的高反应性二烯（o-QDMs）原位构建荧光加合物。

图 6 基于异狄尔斯-阿尔德（HDA）反应的生物正交激活成像。 a) HDA 反应机理以及异二烯和亲二烯体的实例。b-d) 基于三嗪/三嗪鎓连接、吡喃酮狄尔斯-阿尔德（PDA）反应以及亚硝基狄尔斯-阿尔德（NDA）诱导的荧光团或金属配合物的能量/电子去淬灭的 BioTOP 设计。e) 基于醌-狄尔斯-阿尔德（QDA）反应诱导的来自醌或醌甲烷的荧光共轭的 BioTOP 设计。

2.3. 过渡金属催化反应#

过渡金属催化由于金属种类丰富、激活机制多样（去淬灭、点击释放、原位环化等）而备受关注（图 7）。

CuAAC 反应：利用三唑环的形成消除 PET 效应。典型案例中 8-氨基喹啉探针可实现 1352 倍的信号开启。
钯/锇催化：涉及硼酸脱保护或铃木偶联。钯催化的交叉偶联能精准替换碘笼蔽基团，开启倍数高达 5277 倍。
自环化与点击释放：钌、钯或金催化的反应可产生游离成像剂或原位构建发光缀合物。

图 7 过渡金属催化的生物正交激活成像。 a) 基于过渡金属催化的能量/电子去淬灭的 BioTOP 设计及示例成像剂（如铜催化的 CuAAC 以及锇/钯催化的硼酸反应）。b) 基于钌、钯或铱催化的点击释放的 BioTOP 设计。c) 基于钌和金催化的通过二炔/炔烃自环化实现的荧光共轭的 BioTOP 设计。

2.4. 应变促进的 [3+2] 环加成#

利用高张力环（如 BCN、DIBO、TCO）在无催化条件下实现高效反应（图 8）。

荧光生成：Sydnone 与 DIBO 反应生成的吡唑衍生物量子产率达 0.45。
点击释放：叠氮-香豆素系统通过 TCO 反应触发级联消除释放荧光团。
去淬灭：硝酮或 sydnone 本身作为电子受体猝灭荧光，反应后转化为异恶唑或吡唑环，恢复 ICT 过程。

图 8 基于应变促进 [3+2] 环加成反应的生物正交激活成像。 a) 1,3-偶极子与应变偶极亲和体之间的应变促进 [3+2] 环加成反应机理。b) 基于荧光 1,3-偶极子与炔烃或富马酸酯缀合的 BioTOP 设计。c) 基于应变促进 [3+2] 环加成诱导点击释放的 BioTOP 设计。d) 基于应变促进 [3+2] 环加成诱导能量/电子去猝灭的 BioTOP 设计，示例成像剂包括活化荧光团和猝灭金属配合物。

2.5. 光诱导 1,3-偶极脱笼#

在紫外光照射下，二芳基四唑释放氮气生成腈亚胺，随后与烯烃发生环加成反应。

光激活去淬灭：四唑对荧光团（如 BODIPY）具有强 PET 淬灭作用，光激活后反应开启信号。
分子内环化：光激发后单分子内发生环化生成荧光加合物（图 9）。

图 9 基于应变促进 [3 + 2] 环加成的生物正交激活成像，通过光诱导 1,3-偶极脱笼实现时空控制。 a) 光诱导四唑发生 1,3-偶极脱笼并随后与烯烃发生环加成反应的反应机理。b) 基于光激活能量/电子去猝灭的 BioTOP 设计。c) 基于光激活荧光分子内环加成的 BioTOP 设计。

2.6. 酮/醛与胺亲核试剂的缩合反应#

利用具有 $\alpha$ -效应的胺类（如肼或酰肼）与羰基化合物缩合形成腙。

点击释放：肼与乙酰基笼蔽的荧光团反应触发解笼。
去淬灭：酰肼与醛缩合形成腙，消除 PET 效应激活信号（图 10）。

图 10 基于酮/醛缩合的生物正交激活成像。 a) 酮/醛与胺亲核试剂的缩合反应机理。b) 基于肼诱导点击释放的 BioTOP 设计。c) 基于腙介导的电子转移去猝灭的 BioTOP 设计。

2.7. 硼化合物驱动的反应#

硼化合物（如硼酸）具有空的 p 轨道，可作为路易斯酸捕获亲核试剂（图 11）。

还原解笼：硼试剂诱导硝基或 N-氧化物还原为胺，开启信号。
去淬灭与环化：硼酸与 1,2-二醇或酰肼缩合，消除淬灭效应或原位构建荧光二氮杂硼杂环。

图 11 基于硼化合物驱动反应的生物正交激活成像。 a) 硼化合物驱动反应的机制。b) 基于硼化合物驱动的点击释放的生物正交探针设计。c) 基于硼酸反应驱动的能量/电子去淬灭的生物正交探针设计。d) 基于荧光二氮杂硼烷形成的生物正交探针设计。

2.8. 巯基选择性生物偶联#

利用巯基的高亲核性在活体系统中实现快速标记（图 12）。

去淬灭机制：巯基-马来酰亚胺反应消除 PET 效应。
原位共轭：通过 NAT 或 CA-AT 反应诱导纳米颗粒自组装或构建高荧光半花青染料，实现极高的信号开启（可达 2088 倍）。

图 12 基于硫醇选择性生物偶联的生物正交激活成像。 a) 基于硫醇-马来酰亚胺反应诱导电子去淬灭的 BioTOP 设计。b) 基于荧光二硫醇偶联的 BioTOP 设计。c) 基于荧光腈-氨基硫醇（NAT）纳米偶联的 BioTOP 设计。d) 基于氯丙烯醛-氨基硫酚（CA-AT）偶联的 BioTOP 设计。

3. 生物正交激活型光学成像的应用#

3.1. 代谢聚糖成像#

通过向系统中引入含生物正交手柄的非天然单糖类似物，这些分子能通过内源代谢途径整合入细胞膜表面的糖缀合物中。互补的 BioTOP 与之反应，实现了无需洗涤条件下对细菌、斑马鱼胚胎及癌细胞中聚糖动态的实时观察（图 13a）。

图 13 不同生物分子的生物正交激活式光学成像应用。 a) 用于细胞表面聚糖检测的代谢聚糖成像。b) 用于 DNA/RNA 检测的非模板/模板核酸成像。c) 通过遗传密码扩展和基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）实现的蛋白质成像。

3.2-3.3. 核酸与蛋白质成像#

核酸成像：涉及模板化杂交策略，激活速率极高，有助于监测核酸定位。
蛋白质成像：涉及遗传密码扩展（定点整合 UAA）和 ABPP 活性分析。ABPP 利用基于活性的 BioTA，不仅反映蛋白质丰度，更能直接揭示酶活性信息（图 13c）。

3.4. 活全细胞与体内成像#

利用抗体（如西妥昔单抗）或趋化因子修饰的手柄，实现了活细胞表面及亚细胞结构（线粒体）的高灵敏度成像。此外，生物正交光学尿液检测（BOUTs）可用于监测肿瘤微环境或药物诱导的肾损伤（图 14c）。

图 14 生物正交激活型光学成像在活体系统中的应用。 a) 利用抗体偶联的 BioTA 靶向癌细胞表面 EGFR 或线粒体 COX IV 进行成像。b) 靶向 CT26 肿瘤 PD-L1 进行活体小鼠成像。c) 用于癌症治疗评估和肾损伤监测的 BOUTs 尿液检测示意图。

3.5-3.6. 诊疗一体化应用#

生物正交反应不仅能原位激活药物（如 TCO-DOX），还能作为光/声敏剂应用于 PDT/SDT 疗法。最近更被应用于提高 PROTAC 疗法的精准性，确保蛋白在局部的精准降解并减少全身毒性（图 15）。

图 15 生物正交激活反应在治疗和疗效评估中的应用。 a) 用于药物递送和激活的反应示意图。b) 用于 PDT/SDT 产生 ROS 的反应示意图。c) 用于 PROTAC 疗法的生物正交激活反应。

4. 总结与展望#

生物正交激活型光学成像综合利用了多种化学原理与信号激活机制。其核心优势在于极高的信噪比以及对生物靶点的实时、高特异性监测能力。探针设计涵盖了从可见光到近红外区的宽光谱范围。

尽管挑战尚存（如化学稳定性、药代动力学优化、高性能近红外探针设计等），但该技术栈已极大地丰富。未来的研究重点将聚焦于稳健反应的开发、靶向效率的提升以及全面的转化应用探索，以充分释放其在基础研究和精准医疗中的潜力。