【Chem.Soc.Rev.】用于肿瘤浸润免疫细胞生物成像的光学探针#

表1 不同成像模式的参数对比#

鉴于这些能力，光学探针在多个维度上相较于传统临床生物成像具有显著优势。通过结合高分辨率、特异性、灵敏度以及实时成像能力，这些定制的光学探针能够在整个肿瘤发生过程中，对肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）内的复杂生物过程进行体内监测（见图 1）。这种能力对于推进癌症免疫治疗至关重要，因为它能够实现治疗效果的实时评估，以及免疫细胞亚群响应治疗的动态跟踪。上述属性通过高精度、实时生物监测以及增强的生物安全性，有效克服了临床生物成像的局限性。

此外，光学探针是提升基于 TIICs 的癌症诊断与治疗效果的有力工具。其利用 TIICs 代谢的特定生物标志物（如酶、反应物种、特殊结构、受体等），通过实时可读的光学信号呈现肿瘤微环境（TME）中 TIICs 的信息。该方法不仅能够描绘肿瘤形态，还能提供 TME 中 TIICs 的实时信息，为临床实践中优化肿瘤诊断与治疗策略、改善治疗结果，进而提升患者预后奠定基础。值得注意的是，光学探针的可编程性赋予其真正的设计灵活性，使其用途远远超出传统肿瘤成像范畴。如今，许多团队已开发出多功能探针，将实时诊断与治疗相结合，这是传统方法难以实现的。由于具备高特异性和肿瘤靶向效率，这些探针能够在治疗过程中进行监测，同时减少单一治疗方式的无效性与不良影响。

图1. 光学探针及其在生物医学中的应用#

本综述总结了靶向 TIIC 的光学探针的最新进展，并探讨其多种应用，包括但不限于肿瘤免疫治疗、免疫状态评估、肿瘤成像与诊断。首先，阐述了 TIIC 在肿瘤发生发展中的关键作用，以加深对 TIIC 的理解。随后，概述了这些探针的靶向与设计策略，为未来靶向肿瘤免疫细胞的光学探针开发提供思路。此外，按靶标类型对现有探针进行分类介绍，重点阐述其组成及与靶标生物分子的相互作用机制。更为重要的是，强调了将靶向 TIIC 的光学探针与免疫疗法相结合的重要性与可行性，为多功能靶向 TIIC 的光学探针的未来发展提供指导。

光学探针与免疫疗法的结合将诊断与治疗直接关联，这种整合能够精准控制治疗的时机与部位，提升选择性与安全性，同时可实时追踪治疗反应并按需调整方案。除此之外，该策略还能增强免疫疗法的效果，形成从诊断、治疗到疗效评估的完整闭环，成为精准肿瘤学领域极具价值的工具。通过融合光学探针与免疫疗法，这一整合的诊疗框架旨在为更高效、个性化的癌症治疗提供支持。

本综述还总结了当前研究的不足，并对该领域的发展前景进行了展望。其旨在构建一个跨学科框架，整合肿瘤生物学、免疫学、生物医学工程、分析化学及生物医学等多领域的专业知识。光学探针的精细化设计至关重要，它能够保障生物成像数据的准确性与可靠性，最终推动肿瘤精准医学的发展。

2.1. 肿瘤浸润免疫细胞的免疫功能#

肿瘤浸润性免疫细胞作为肿瘤微环境的核心构成部分，对抗肿瘤免疫与免疫逃逸过程发挥着调控作用，同时展现出显著的功能可塑性以及双向调节功能。

经典的效应细胞群涵盖细胞毒性T淋巴细胞与自然杀伤细胞，它们借助穿孔素-颗粒酶释放途径以及Fas-FasL信号通路诱导肿瘤细胞凋亡；树突状细胞通过抗原呈递启动适应性免疫反应；M1型肿瘤相关巨噬细胞则分泌白细胞介素-12、肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子，推动Th1型免疫反应。上述细胞群共同履行免疫监视与肿瘤清除的职责。

相反，在肿瘤衍生因子的影响下，部分肿瘤浸润性免疫细胞亚群会极化为免疫抑制或促肿瘤表型。调节性T细胞通过分泌白细胞介素-10和转化生长因子-β抑制效应T细胞活性；M2型肿瘤相关巨噬细胞促进血管生成与组织重塑；髓源性抑制细胞则通过产生活性氧与活性氮物质、消耗关键代谢底物来抑制T细胞功能。此外，中性粒细胞在肿瘤微环境中呈现功能异质性：N1型肿瘤相关中性粒细胞通过增强细胞毒性与免疫活化发挥抗肿瘤作用；而N2型肿瘤相关中性粒细胞则分泌血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等因子，进而推动血管生成、细胞外基质降解与肿瘤转移。

总体而言，肿瘤浸润性免疫细胞的细胞组成、极化状态、代谢微环境及空间分布决定了肿瘤微环境的整体免疫状态，对肿瘤进展以及免疫治疗的反应性具有关键影响。

2.2. 肿瘤浸润免疫细胞的浸润过程#

体内所有免疫细胞均起源于造血干细胞。造血干细胞首先在骨髓内分化为两种主要的祖细胞谱系：淋巴样祖细胞和髓样祖细胞。上述祖细胞发育成熟后，进一步分化为固有免疫细胞（包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞）和适应性免疫细胞（包括T细胞和B细胞）。

当免疫细胞上的细胞因子受体（包括趋化因子受体如CCR、CXCR、XCR、CX3CR，以及非趋化因子受体如TNFR、IFNGR、CSF1R）与肿瘤细胞和基质细胞分泌的细胞因子相结合时，该结合过程会引导免疫细胞向肿瘤部位迁移。到达肿瘤部位后，肿瘤血管内皮细胞表达的黏附分子（如细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1）通过滚动、黏附、跨内皮迁移的连续过程，促使免疫细胞进入肿瘤组织。随后，免疫细胞借助酶类（如基质金属蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶）和黏附分子（如整合素）降解细胞外基质，并向肿瘤核心迁移。通过上述协同步骤，免疫细胞成功从循环系统浸润至肿瘤组织中。

2.3. 肿瘤浸润免疫细胞的分类#

尽管免疫细胞对维持体内平衡至关重要，但当其演变为肿瘤浸润免疫细胞（TIICs） 后，却可能反常地促进肿瘤进展。TIICs对肿瘤结局的影响具有情境依赖性，兼具抗肿瘤和促肿瘤的双重功能。此种双重性由其在肿瘤微环境（TME）** 中的特定亚型和激活状态所决定，经典的N1/N2型肿瘤相关中性粒细胞（TANs） 和**M1/M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）便是典型例证。

在肿瘤发生早期，TANs和TAMs主要聚集于肿瘤边缘，通过释放凋亡诱导因子和活性氧（ROS） 抑制肿瘤进展。然而，随着肿瘤进展，上述细胞逐渐极化为N2型和M2型，并向肿瘤内部深层浸润。在此阶段，TANs和TAMs主要通过释放血管内皮生长因子（VEGF）** 和基质金属蛋白酶（MMPs） 来促进血管生成与肿瘤进展。值得注意的是，由于**髓源性抑制细胞（MDSCs）可分化为髓系细胞，部分研究认为TME中的TAMs和TANs可能源自MDSCs。

与MDSCs不同，树突状细胞（DCs） 和自然杀伤细胞（NK细胞） 均具备天然的抗肿瘤功能。DCs能够识别并捕获肿瘤抗原，随后将其呈递给T细胞，从而激活T细胞介导的细胞毒性作用。NK细胞通常存在于血液中，通过释放穿孔素和颗粒酶（Grs） 诱导肿瘤细胞凋亡，在清除循环肿瘤细胞、抑制肿瘤转移方面效果显著。有趣的是，尽管传统上将NK细胞归为固有免疫细胞，但已有证据表明其在TME中也呈现出适应性免疫样特征。具体而言，NK细胞可获得长期的抗肿瘤记忆并增强细胞毒性效力。这一发现表明NK细胞是肿瘤诊断和免疫治疗的潜在靶点。

但在TME中，DCs和NK细胞的抗肿瘤活性常受到多种因素抑制，包括免疫抑制性因子（如转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）、血管内皮生长因子）、免疫抑制性细胞（如调节性T细胞（Tregs）、MDSCs）、代谢紊乱（包括乳酸堆积、缺氧、营养竞争）以及肿瘤细胞的免疫逃逸机制（如受体-配体调控、外泌体干扰）。

适应性免疫细胞对肿瘤进展具有强大的抑制作用，并展现出广泛的细胞间相互作用。T细胞亚群包括细胞毒性T淋巴细胞（CTLs） 、CD4+辅助性T细胞和调节性T细胞（Tregs） 。CTLs通过T细胞受体识别肿瘤细胞，与细胞表面呈递的肿瘤特异性抗原相结合，并通过分泌穿孔素和颗粒酶诱导细胞凋亡。CD4+辅助性T细胞分泌白细胞介素-2（IL-2） 、干扰素-γ（IFN-γ）** 和**肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，促进CTLs和NK细胞的活化，从而增强抗肿瘤免疫反应。B细胞通过呈递抗原激活并增强CTLs介导的细胞毒性，进而促进肿瘤抑制。

尽管适应性免疫细胞对肿瘤发生具有强烈的抑制作用，但其中也存在负面调控群体。例如，Tregs和调节性B细胞（Bregs） 通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子，在TAMs、TANs和CTLs中诱导免疫抑制表型，从而支持肿瘤免疫逃逸。

简而言之，TIICs及其周围微环境共同构成了高度复杂的肿瘤免疫微环境（TIME） 。因此，开发靶向TIICs并整合免疫治疗功能的光学探针具有重要的科学价值和转化价值。该策略突破了传统以肿瘤细胞为中心的成像模式，能够对TIME进行实时、动态和功能性的可视化分析。其可在体内对TIICs的激活/极化状态及免疫抑制网络进行无创表征，从而提升对免疫治疗反应的预测能力并助力患者分层。此外，通过构建兼具成像与免疫调节功能的诊疗一体化光学探针，可在特定肿瘤微环境中实现精准激活与局部免疫重编程，在增强全身抗肿瘤免疫的同时降低全身毒性。总体而言，这一新兴研究方向为阐明TIME的动态演变提供了关键工具，为精准免疫治疗的发展以及无创、实时监测技术的进步奠定了坚实基础，彰显了显著的跨学科创新价值与临床潜力。

图3.（A）TIIC靶向光学探针的组成部分。（B）TIIC靶向光学探针的信号转换机制。#

3.1. 由肿瘤免疫治疗相关生物标志物激活的探针#

肿瘤浸润免疫细胞产生的代谢物不仅反映了其生物学功能，还为合理设计酶/反应性物种激活型光学探针提供了关键分子线索（图4A）。这些代谢物包括多种可促进或抑制肿瘤生长与转移的酶——如在肿瘤相关中性粒细胞中高表达的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、在肿瘤相关中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞中表达的髓过氧化物酶（MPO）、在肿瘤微环境中各类细胞表达的基质金属蛋白酶（MMPs）和组织蛋白酶（CTS），以及由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞释放的颗粒酶（Grs）——同时还包含活性氧（ROS）、活性氮物种（RNS）和活性硫物种（RSS）等反应性物种。

这些代谢物可通过定制的识别单元（例如肽序列、酰胺键或反应性官能团）被识别，从而触发信号转换单元，激活成像单元以产生可量化的光信号，实现分子水平的读出。这种基于分子识别的主动靶向策略被广泛应用于靶向TIICs的小分子探针的设计与构建。通过合理选择信号转导单元，并借助有机合成将成像部分、识别元件、连接子和辅助组分进行共价结合，可构建出靶向特异性探针。小分子探针通常具有分子量低、响应动力学快、灵敏度高和结构可调控等特点。该主动靶向策略的主要优势在于其高特异性和丰富的信息输出。具体而言，当特定受体在病变组织中过表达、蛋白酶异常激活或特定细胞亚群显著富集时，小分子探针可在病变组织与正常组织之间产生显著的信号差异，从而提高成像对比度，提升检测结果的分子诊断价值。

3.2. 被肿瘤浸润免疫细胞特异性膜蛋白标记的探针#

除了可反映TIICs生物学活性、为酶/活性物种激活型光学探针设计奠定基础的代谢物外，一系列由TIICs表达的蛋白质（如受体、糖蛋白以及参与细胞募集和功能调控的其他蛋白）也为受体结合标记型光学探针的开发提供了合理靶点（图4B）。这类光学探针通常采用荧光（FL）染料、荧光蛋白、市售荧光团等常规成像单元，而其识别模块则由能够结合TIICs表面特异性膜受体的配体构成，包括多糖、抗体、核酸适体等。典型例子包括靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表面受体CD206的甘露糖，以及针对肿瘤相关中性粒细胞（TAN）表面受体Ly6G的IgG抗体。因此，CD206和Ly6G已成为基于受体的探针设计中广泛应用的靶点。

除这些经典标志物外，调控TIICs募集的趋化因子受体（例如CXCR5和CXCR3）也为探针开发提供了另一策略。这些受体在不同TIICs亚群中广泛表达，并呈现亚群特异性分布模式。因此，根据预期应用合理选择膜受体，能够开发出高选择性的探针，用以阐明特定TIICs亚群在TME中的生物学功能。值得注意的是，尽管这些受体定位于细胞膜，但多数会发生受体介导的内吞作用，从而促进探针的胞内摄取与信号放大。此外，其表达呈动态调控，且与TME中的免疫激活或免疫抑制密切相关，这使得受体靶向探针在评估免疫状态及TIICs相互作用方面具有独特优势。

另一项值得关注的进展是，近年来生物技术的快速发展为TIICs靶向光学探针的研发提供了有力支撑。尤其是基因克隆技术和适体筛选平台（最具代表性的是配体指数富集系统进化技术，SELEX），可实现高亲和力核酸适体的筛选，包括单链DNA适体、RNA适体、镜像核酸等。这些技术显著提升了光学探针对特定TIICs亚群的识别特异性与靶向精准度，推动了受体结合标记型光学探针的精细化与多样化发展。

3.3 肿瘤浸润免疫细胞靶向光学探针的免疫治疗整合#

尽管3.1节和3.2节中描述的靶向与响应机制主要聚焦于肿瘤免疫细胞成像，但治疗单元的引入为靶向肿瘤免疫细胞的光学探针增添了一层额外的干预性功能层。诊断与治疗的同步化（通常被概念化为“可视化与治疗同步”）代表了癌症管理领域的一次重大范式转变。因此，除核心传感机制外，治疗功能的整合已将靶向肿瘤免疫细胞的光学探针从单纯的诊断工具转变为多功能诊疗一体化平台，这也构成了探针设计领域快速发展的前沿方向。

例如，在肿瘤部位富集的多功能光学探针，可通过局部精准递送化疗药物、免疫检查点抑制剂、免疫信号通路调节剂等，直接或间接（由肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式刺激）介导机体抗肿瘤免疫反应的激活，有效弥补传统全身给药方式副作用大、疗效低、疗效预测与监测不及时等缺陷，从而实现对肿瘤微环境免疫状态的时空调控。目前，整合治疗单元的策略主要包括：（1）** 将治疗剂与光学探针共同载入纳米颗粒**；（2）** 制备为前药并与光学探针联用以提升治疗效果；（3） 以光学探针为载体，直接负载并转运治疗剂**至肿瘤微环境。

值得注意的是，治疗模块的合理选择与整合需结合临床实际情况进行定制，包括治疗方案、靶向免疫细胞亚型，以及其与成像功能之间潜在的协同或拮抗相互作用。例如，靶向肿瘤细胞或T细胞上表达的程序性死亡配体1的光学探针，可与免疫检查点阻断剂联用，实现靶标结合的实时可视化与局部免疫治疗递送。这类诊疗一体化系统不仅支持影像引导的干预，还能实时评估治疗反应，进而推动个性化癌症免疫治疗的发展。

4.1. 基于酶的探针#

酶是调节生理过程的重要生物分子，参与生化反应并调控细胞生长和代谢过程。在生理条件下，酶的活性和表达保持相对稳定；然而，在疾病或组织损伤过程中，某些酶的表达和活性会发生异常变化，这为其在光学探针开发中的应用提供了基础。在TIICs中，常用于靶向肿瘤浸润免疫细胞光学探针开发的关键酶包括中性粒细胞中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE） 、中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的髓过氧化物酶（MPO） 、基质金属蛋白酶（MMPs） ，以及T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）中的颗粒酶（Grs） 。

4.2. 基于活性氮氧物种（RNOS）的探针#

除了针对免疫细胞标志物的探针外，还有一类独特的光学探针靶向肿瘤微环境（TME）内的活性小分子——具体为活性氧、活性氮和活性硫物质（统称为RNOS）。尽管肿瘤浸润性免疫细胞（TIICs）是其主要来源，但基质细胞和癌细胞自身也会产生RNOS，这使其成为反映TME活性的更广泛、不依赖细胞类型的指标。与上述主要追踪中性粒细胞或巨噬细胞群体的髓过氧化物酶（MPO）定向探针不同，RNOS响应型传感器可反映整体氧化应激和氧化还原信号传导。这些物质对肿瘤进展具有双重作用：在一定水平上促进肿瘤增殖和治疗耐药，而在其他情况下则有助于免疫介定力的肿瘤抑制。因此，对RNOS动态进行成像是研究其在肿瘤生物学中依赖于具体情境的作用的关键。为此，相关研究开发了一系列光学探针来追踪RNOS的波动，从而深入了解这些物质如何影响TIICs功能、肿瘤生长以及治疗反应。

针对活性氧（ROS） ，相关研究合成了一种基于光诱导电子转移（PeT）机制的光学探针（PSiR），该探针能够对高活性氧物种（hROS）进行实时成像（图10A）。hROS与2,4-二甲基-3-乙基吡咯基团快速反应，生成的氧化产物打破了电子转移平衡，使PSiR在数秒内被激活，实现了对hROS的高效实时成像。

此外，后续研究报道了一种基于荧光共振能量转移（FRET）机制的多色光学探针（探针4），可同时响应过氧化氢（$\text{H}_2\text{O}_2$）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）水平的变化（图10B）。当仅存在$\text{H}_2\text{O}_2$时，该探针发射波长为672纳米的近红外荧光（NIRF）；而当存在MMP-2时，由于肽键断裂及$\text{H}_2\text{O}_2$的激活，探针会发射波长为555纳米的绿色荧光。

针对ROS的多模态成像光学探针也已有相关报道。例如，相关研究报道的BTPE-NO₂@F127可用于$\text{H}_2\text{O}_2$的荧光/光声（FL/PA）双模态成像（图10C）。另一方面，后续研究报道的MPN@CeOx可通过磁共振/计算机断层扫描（MR/CT）成像监测体内ROS水平的实时变化（图10D）。三价铁离子和氧化铈（CeOx）材料分别赋予了MPN@CeOx磁共振和计算机断层扫描成像能力。更重要的是，MPN@CeOx可通过清除ROS调控巨噬细胞极化，从而有效缓解炎症症状。

4.3. 中性粒细胞胞外诱捕网探针#

中性粒细胞成像的研究重点最近已从标记细胞内酶拓展到靶向中性粒细胞胞外陷阱（NETs） ——即中性粒细胞在NETosis（中性粒细胞胞外陷阱形成）过程中释放的细胞外DNA支架。这些结构通过促进局部侵袭、血管锚定、免疫逃逸和器官定植，主动推动肿瘤转移。为阐明NETs在肿瘤微环境（TME）中的这些特异性作用，研究人员开发了一系列可直接可视化NETs的光学探针，从而能够研究其与母代中性粒细胞不同的、对肿瘤进展的影响。针对这一研究方向，相关综述总结了该领域的研究进展，并指出NETs有望成为肿瘤成像与治疗的一种有前景的替代手段。NETs中含有的DNA片段以及多种蛋白质（如中性粒细胞弹性蛋白酶NE和组织蛋白酶CTS）是开发靶向肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）光学探针的关键要素。

相关研究在靶向肿瘤相关中性粒细胞（TANs）相关酶的光学探针开发方面取得了重大进展，研制出了一系列针对NE、蛋白酶3和CTSG的可激活光学探针。然而，由于背景荧光较高、信号放大能力有限，且难以穿透NET结构并与其相关酶有效结合，这些常规光学探针无法实现NET的有效成像。因此，研究人员采用优化设计策略开发了一种光学探针（HNE-FQ），以实现NET的精准成像（图11A和E）。连接在三肽分支支架上的肽底物（Glu–Glu–Ile–Nle–Arg–Arg）可被NE切割，使荧光基团（5-FAM）与淬灭剂（甲基红）分离，从而恢复荧光。得益于三价支架和荧光共振能量转移（FRET）效应，HNE-FQ的荧光强度提升了420倍。此外，后续研究还使用磺化花青5（Cy5）荧光基团进一步优化新型光学探针（HNE-3F1Q）的深层组织穿透能力，成功实现了深层组织中的NET成像（图11B和F）。

4.4. 基于受体的探针#

配体与其同源受体之间的特异性结合，为开发对肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）具有高靶向特异性的光学探针提供了坚实基础。例如，CD206作为M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的经典生物标志物，已成为靶向成像与治疗应用的热门研究靶点。此外，TIICs亚型上大量表达的多种受体（如趋化因子受体）也是探针设计的重要靶点，基于此开发的探针展现出可观的应用潜力。

相关研究采用CD206配体（甘露糖）和聚集诱导发光（AIE）机制，设计了一种用于体内肿瘤成像和光动力治疗（PDT）的光学探针（TPE-Man）（图12A）。TPE-Man通过CD206介导的内吞作用进入TAMs，并基于AIE机制发出600纳米波长的荧光（FL）。经白光照射后，TPE-Man通过PDT产生活性氧（ROS），显著降低TAMs的存活率，从而实现精准治疗。

此外，后续研究报道了一种可代谢的光学探针（DN-ICG），用于胰腺癌中TAMs的成像（图12B）。DN-ICG中的羧甲基葡聚糖与捕获细胞间黏附分子-3的非整合素相关蛋白1（SIGNR1）相互作用，使DN-ICG能够特异性靶向TAMs。实验结果表明，DN-ICG的发射强度比游离吲哚菁绿（ICG）高约279%，其1000–1700纳米的第二近红外（NIR-II）发射波长确保了深层组织穿透性，可实现胰腺癌治疗过程中TAMs变化的动态监测。残留在肿瘤组织外的探针通过酶解作用分解为无毒小分子并经肝脏代谢清除，从而降低了体内成像的背景荧光。

与靶向CD206的光学探针不同，靶向淋巴细胞抗原6复合物G（Ly6G）的探针主要用于体内中性粒细胞的动态追踪。例如，相关研究利用主要在中性粒细胞表面表达的Ly6G，设计了一种荧光/磁共振/计算机断层扫描（FL/MP/CT）多模态成像光学探针（Ly6G纳米颗粒），用于监测腹主动脉瘤（AAA）中的中性粒细胞浸润（图12C）。Ly6G纳米颗粒中的超顺磁性纳米颗粒材料（$\text{Fe}_3\text{O}_4\text{@PEG-COOH}$）和Cy7荧光染料分别提供了MP/CT和FL成像能力。在小鼠模型中，FL/MP/CT多模态成像结果直观反映了中性粒细胞浸润与AAA严重程度的相关性。

与此同时，2026年，相关研究将Ly6G与NIR-II探针DCPD7偶联，构建了超亮的NIR-II光学探针（DCPD7-Ly6G），用于深层组织中单个中性粒细胞的高分辨率成像（图12D）。在脑卒中小鼠模型实验中，该研究开发了一套多色成像系统，整合了DCPD7-Ly6G、专门靶向间充质干细胞的NIR-II探针DCPD3-KTP5以及ICG，以实时追踪中性粒细胞的动态变化。该方法揭示了脑卒中后中性粒细胞迁移的精细时空特征以及干细胞与免疫细胞的相互作用，为阐明复杂的生物学过程提供了有力工具。

4.5. 基于人工肿瘤免疫浸润细胞的探针#

前文总结了基于酶、活性物质和特殊结构的光学探针的最新进展，以及它们的设计策略与应用。除上述方法外，研究人员还探索了其他策略用于靶向肿瘤浸润免疫细胞（TIICs）的探针开发。例如，体外重编程免疫细胞以构建具备光学成像能力的“人工肿瘤浸润免疫细胞”（ATCs），可实现对免疫细胞在血液中迁移的实时追踪，为揭示TIICs在肿瘤进展中的生物学作用提供了新的见解。

大多数TIICs都具有向肿瘤组织迁移的固有能力。因此，可利用这一特性构建光学成像细胞（ATCs）——通过策略性设计赋予细胞光学成像能力——以实现对免疫活性的有效体内追踪。构建光学成像细胞时，研究人员通常选择同源的TIICs作为基础，以确保最佳的生物相容性并逃避宿主免疫清除。随后将这些同源的TIICs与光学探针共孵育，或提取其细胞膜并用于包封光学探针。采用上述方法构建的ATCs通常会保留同源免疫细胞的全部或部分生物学特性，从而实现光学探针在肿瘤部位的精准递送与靶向聚集。

最直接的方法是将成像探针化学偶联到天然免疫细胞表面。相关研究合成了一种用于FL/MR双模态成像的光学探针（Gd@BSA-BODIPY）（图13A）。该研究通过配位键和共价键将钆离子（$\text{Gd}^{3+}$）和硼二吡咯亚甲基（BODIPY）固定在牛血清白蛋白（BSA）骨架上，形成Gd@BSA-BODIPY纳米颗粒，随后用5-硫代-2-硝基苯甲酸酯（TNB）对其进行活化，并进一步通过共价键偶联到中性粒细胞膜表面。肺癌动物模型实验表明，接受该型ATCs的小鼠，其肿瘤组织中的FL和MR信号得到了显著增强。

一种更具整合性的方法是将纳米探针内化到免疫细胞中，使其成为可追踪的活性微载体。相关研究开发了一种人工“超级中性粒细胞”（GCZM），用以靶向并清除恶性肿瘤细胞和病原体。整合到GCZM中的花青5.5（Cy5.5）可对其肿瘤靶向能力进行成像。此外，研究中还合成了一种光学探针（BClO），通过检测活性氧（ROS）实时监测GCZM的毒性（图13B）。此外，后续研究通过生物工程改造活性中性粒细胞，使其包裹多功能纳米复合物（RA/Ce6），开发出一种新型光活性中性粒细胞（PANs），在黑色素瘤和口腔癌小鼠模型中实现了自放大、多级肿瘤靶向，并触发线粒体特异性光化学治疗（图13C）。

5.1. 化疗-抗肿瘤免疫反应协同作用#

化疗的作用机制是通过靶向并广泛杀伤快速分裂的肿瘤细胞来抑制肿瘤增殖，其主要特点包括起效快、适用范围广。该疗法广泛用于各阶段多种癌症的治疗，但其局限性也十分明显。例如，化疗药物通常缺乏特异性，无法有效靶向肿瘤组织，从而对正常细胞和组织造成损伤，引发骨髓抑制、脱发等严重副作用。

将化疗功能整合到靶向肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）的光学探针中的一大优势在于，可利用其肿瘤靶向能力减少化疗药物在正常组织中的非特异性积累，进而减轻全身化疗带来的不良反应。另一项优势是，聚集在肿瘤组织内的化疗药物能高效杀伤肿瘤细胞，促使肿瘤相关抗原（TAAs） 释放，进而激活TIIC介导的抗肿瘤免疫反应。这一过程可在肿瘤微环境（TME）中实现抗肿瘤免疫的局部激活，最终达成化疗与免疫介导的肿瘤抑制之间的协同治疗效果。

5.2. 光动力治疗/光热治疗与抗肿瘤免疫反应的协同作用#

光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）是两种基于光能的治疗方法，因其精准性和微创特性而受到广泛关注。与传统方法相比，PDT和PTT均能通过局部光照射实现更精准的治疗。相较于手术切除、化疗和放疗，这两种疗法对正常组织的损伤更小，且能加快术后恢复。此外，PDT与PTT通过活性氧的产生和局部热疗直接介导肿瘤细胞死亡。肿瘤相关抗原（TAAs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放可激活适应性免疫反应。这一过程以钙网蛋白（CRT）暴露以及ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放为特征。

上述DAMPs通过CRT-CD91轴促进树突状细胞（DC）的吞噬作用，通过ATP-P2X7信号通路触发NLRP3炎症小体激活和白细胞介素-1β分泌，并通过HMGB1-TLR4介导的核因子-κB激活促进DC成熟。同时，胞质DNA激活cGAS-STING通路，诱导I型干扰素产生并增强抗原交叉呈递能力。在摄取和处理TAAs后，成熟的DCs通过主要组织相容性复合体II类（MHC II）呈递激活CD4+ T细胞，并通过MHC I交叉呈递启动细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的反应。在共刺激分子和促炎细胞因子的支持下，T细胞发生克隆扩增和效应分化。最终，该信号级联反应建立针对肿瘤的全身性适应性免疫反应，抑制原发灶和远处转移灶的生长，同时为持久的免疫记忆奠定基础。此过程增强了免疫系统的抗肿瘤活性，构建出协同的PDT/PTT-抗肿瘤免疫反应网络。

将PDT和PTT整合到单一光学探针中已成为诊疗一体化平台的明确发展方向。相关研究开发了一种脂质体纳米卟啉探针（Pp18-lipos） 。通过调节Pp18的脂质比例，该平台实现了荧光（FL）成像、光声（PA）成像、磁共振成像（MRI）、光动力/光热治疗以及抗肿瘤免疫激活的结合。

• 荧光成像：可检测微克每毫升水平的药物分布，并追踪探针在0.5至48小时内在肿瘤及主要器官中的富集情况，从而验证其靶向性。

• 光声成像：能够对肿瘤解剖结构和血管生成进行深层组织成像，同时追踪探针的富集过程，便于实时评估治疗效果。

• 磁共振成像：可提供毫米级的解剖结构信息，且具备优异的软组织对比度，能清晰区分肿瘤与正常组织，有助于术前规划和术后监测。

这种一体化设计降低了多组分纳米药物的复杂性和不稳定性，使临床转化更简便、安全且高效。成像反馈可供相关人员实时调整激光照射时间和剂量。在小鼠皮下肿瘤模型中，联合的PDT/PTT不仅减缓了肿瘤生长，还触发了更强的抗肿瘤免疫反应：肿瘤中DCs和CTLs的浸润增多，细胞因子（干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白介素-12p70）水平上升，调节性T细胞（Treg）浸润减少。这一变化使肿瘤从免疫抑制的“冷”状态转变为免疫激活的“热”状态，从而提高了对免疫治疗的响应性。

5.3. 免疫相关信号通路的激活#

信号通路涉及一系列分子，如蛋白质、酶、受体和第二信使，上述分子通过有序的相互作用传递信号。这些信号通常由细胞外刺激启动，最终通过调控基因表达和蛋白质活性，影响细胞增殖、分化、凋亡和免疫反应等生物学功能。在癌症免疫治疗中，A2AR、cGAS-STING和JAK-STAT信号通路已成为关键靶点，其在调节免疫细胞活性、肿瘤免疫逃逸及肿瘤微环境中的作用已得到广泛研究。

A2AR是免疫细胞上的一种受体。当被激活时，其信号传导会抑制免疫激活与功能，降低肿瘤微环境中的抗肿瘤反应，并帮助肿瘤逃避免疫攻击。2024年相关研究设计了一种纳米诊疗平台（SSPNiNO），该平台可将A2AR抑制剂直接递送至胶质母细胞瘤，同时提供原位治疗（图16A）。SSPNiNO首先靶向血液中的中性粒细胞。上述细胞可自然穿过血脑屏障，因此能将探针带入胶质母细胞瘤组织中。近红外荧光照射随后产生局部热量，杀死肿瘤细胞并触发SSPNiNO内热敏供体释放一氧化氮。该一氧化氮有助于重新极化肿瘤相关巨噬细胞。同时，释放的A2AR抑制剂作用于肿瘤微环境中的多种免疫细胞亚群，重塑免疫微环境，逆转胶质母细胞瘤的免疫抑制状态。

在荷瘤小鼠模型中，SSPNiNO联合近红外荧光照射使小鼠在整个实验期间存活率达到100%，相较于对照组和游离A2AR抑制剂组有显著提升。由于SP2组分的存在，SSPNiNO还能在原位胶质母细胞瘤模型中实现灵敏的近红外荧光成像，荧光信号与中性粒细胞标志物Ly6G高度匹配。纵向成像显示，纳米颗粒在肿瘤中的积累在注射后24小时达到峰值，为影像引导光疗提供了清晰的时间窗口。

同年，相关研究开发了一种近红外二区（NIR-II）光热剂（DB4CaP纳米颗粒） ，用于光热治疗并激活cGAS-STING免疫通路（图16B）。实验结果表明，DB4CaP纳米颗粒能有效促进树突状细胞成熟和肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞的浸润，增强抗肿瘤免疫反应，并清除局部及转移性肿瘤。与上述SSPNiNO的研究类似，DB4CaP纳米颗粒可被808纳米激光激活，在1200纳米处发射近红外二区荧光，从而确定纳米颗粒在肿瘤部位达到最大积累的时间。这为治疗策略的精准实施提供了可靠的体内成像信息。

6.1. 探针整合型免疫治疗的实际应用局限#

光学探针应给免疫治疗带来突破，但在过往研究中却鲜少实现。一个普遍问题是：大多数研究仅报告探针的物理与化学性能（如亮度、稳定性、特异性），却未实际展示免疫治疗效果的改善。虽然研究中包含大量的成像数据，但这些数据鲜有与更佳临床治疗决策建立明确关联。

原则上，光学探针可主动指导治疗：

• 实时追踪：在治疗过程中（而非仅在孤立时间点）动态追踪TIICs的浸润与活化情况。

• 空间靶向：将免疫调节剂精准递送至所需部位，显着减少脱靶效应。

• 功能读数：早期判断患者是否产生有效的效应性免疫反应，为后续合理的治疗调整（如添加检查点抑制剂、调整光剂量、改变给药顺序）提供支持。

• 方案调整：基于探针信号助力患者分层和治疗方案的动态调整，突破“先治疗、后评估”的传统模式。

然而，目前几乎没有研究将这些做法系统化。多数研究止步于动物模型中的探针验证，从未将检测结果整合到闭环治疗策略中。该领域面临的迫切需求是从“设计更亮的探针”转向“设计更智能的探针”，使成像反馈能够直接驱动干预措施。这正是探针整合型免疫治疗的真正价值，而其在很大程度上仍未实现。

6.2. 细胞特异性识别与空间受限激活策略#

尽管取得了长足进展，但目前仍存在几个关键屏障。最根本的挑战在于：当前的探针能否可靠地将TIICs与肿瘤细胞区分开？许多用于TIICs成像的生物标志物——如活性氧（ROS）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、某些基质金属蛋白酶（MMPs）——亦由肿瘤细胞自身表达或产生。这种重叠引发了对信号特异性和误识别的切实担忧。

这一挑战推动了多锁探针等策略的发展，此类探针整合了多种响应元件以避免错误激活。遗憾的是，多锁探针虽然特异性极高，但往往存在合成复杂、激活动力学缓慢的问题，且由于存在多个能量转移步骤，信号幅度亦会有所降低。同时，基于人工抗原呈递细胞（ATC） 的策略（如同源细胞膜包被或TIICs的体外重编程）主要解决探针在肿瘤中的富集和延长循环的问题，使更多探针能够到达肿瘤部位。但这些方法也有自身的局限性，包括潜在的免疫原性、批次间的差异性以及有限的载药能力。更重要的是，即便递送效率得到提升，进入TME的探针仍面临着将免疫细胞与其恶性邻近细胞区分开的核心难题。

解决这一问题需要从仅识别型设计向可实现空间受限激活的“识别-保留”机制转变。例如：

• 原位自组装探针：利用与TIICs相关的酶触发局部聚集，从而特异性地增强在免疫细胞内的保留效果。

• 共价锚定策略：锚定在TME中的响应型探针仅在接触免疫富集的肿瘤区域时才会发生构象变化并进行共价结合。该策略将信号产生与在靶标位点的永久保留相结合，可洗去未结合的探针并显着提高成像保真度。

展望未来，解析免疫-肿瘤相互作用需要能够同时对多个靶标进行空间分辨的探针。为区室特异性传感设计的近红外多色平台可在单个纳米载体上整合正交传感器，每个传感器都针对具有分离良好光谱特征的不同生物标志物组合进行了优化。进一步而言，配备分子逻辑门（与、或、非） 的可激活探针可基于组合生物标志物表达来区分TIICs和肿瘤细胞。例如，一种需要中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G（在中性粒细胞胞外诱捕网中富集）两者共同激活的探针，将能特异性地点亮中性粒细胞胞外诱捕网，而在仅存在活性中性粒细胞或肿瘤细胞时则保持无信号状态。最终，在近红外光谱范围内实现单细胞分辨率将彻底改变对TIICs-肿瘤串扰的认知。对TIICs亚群及其相对于周围癌细胞的功能状态进行空间定位，能够揭示局部免疫结构如何影响治疗反应，并为精准免疫肿瘤学确定空间特异性生物标志物。

6.3. 转化技术障碍与多模态融合成像#

除了细胞特异性之外，临床转化还面临与成像性能相关的技术障碍。对深部肿瘤（如肺癌、肝癌、卵巢癌）进行成像的需求，对探针设计在深层组织穿透性和长期监测能力两个方面提出了严格要求。NIR-II荧光技术可减少光子散射与自发荧光，但在长期监测过程中仍存在光漂白和重复激发的问题。新型NIR-II余辉成像探针通过单次激发后提供延长的成像窗口来解决这一问题，可最大限度降低光学背景，且无需持续光照就能进行多次成像操作。

不过，这些先进的光学方法大多只能提供分子层面的信息。要了解肿瘤内部TIICs复杂的空间结构，仍需要互补的解剖学和结构学背景信息。这推动了多模态光学探针的发展，此类探针将荧光与光声成像（PA）、计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、超声成像（UL）、磁共振粒子成像（MPI）或正电子发射断层扫描（PET）相结合。上述整合技术在灵敏度、穿透深度和空间分辨率之间存在权衡。

通过结合多种成像模式，可将TIICs的分布与详细的解剖特征关联起来，从而对肿瘤免疫结构获得多维度的认知。尽管如此，当前的多模态探针也存在自身缺陷，如合成过程复杂、批间变异性大，且不同成像模式之间可能存在潜在干扰。此外，探针尺寸增大和表面化学性质改变也可能影响药代动力学、生物分布以及肿瘤穿透性。未来的研究应致力于开发更简单、性能稳定的探针设计，采用正交信号输出以最大限度减少相互干扰，同时保持良好的体内行为。

6.4. 免疫细胞亚群的研究失衡现象#

与上述技术挑战并行的是，当前TIIC靶向光学探针的研究格局呈现出研究重点显着失衡的特点。大多数探针是针对巨噬细胞、中性粒细胞等丰富的髓系群体开发的，其中ROS响应性探针尤为普遍，这主要是因为为小分子设计化学传感器相对容易。相比地区，许多淋巴亚群——尤其是调节性T细胞（Tregs） 、记忆性T细胞和先天淋巴样细胞——的研究仍处于不足状态。

这种差异主要源于以下因素：

• 上述群体缺乏稳定、特异的表面标志物。

• 在同一谱系内设计能够区分功能不同亚群（如活化T细胞与耗竭T细胞）的探针面临技术挑战。

Tregs正是这一研究空白的典型例证。越来越多的证据表明，Tregs在肿瘤中表现出显着的功能异质性、代谢可塑性和情境依赖性作用，与患者预后及免疫治疗结果密切相关。目前临床对Tregs的检测主要依赖组织活检等传统方法，而基于成像的方法则受限于高昂的成本和技术复杂性。缺乏Treg特异性光学探针阻碍了在TME中对这些细胞进行实时可视化，极大地制约了基于Treg的免疫疗法的开发与评估。因此，通过开发针对研究不足的TIIC亚群的探针来解决这一失衡问题，是未来研究中一个重要且富有前景的方向。

6.5. 跨学科技术融合与AI模式识别应用#

为克服上述概述的生物学和技术双重挑战，未来的进展将越来越依赖于跨学科合作。除了传统的识别元件筛选技术之外，多样化导向荧光文库（DOFL）方法等创新平台为发现新型探针提供了有力策略。DOFL能够对大量荧光小分子文库进行系统性生成和筛选，从而可在无需预设生物标志物的情况下，识别出能够区分免疫细胞亚群间细微表型差异的探针。这种基于表型的发现范式对于靶向目前“不可成药”或特征尚不明确的TIIC群体具有重要价值，为免疫细胞可视化开辟了新途径。

此外，人工智能（AI）先进的分析与模式识别能力也将是未来探针开发和应用的关键所在。AI可精准匹配现有数据，将成像读数与疾病特征相关联，系统分析高维数据集，并以更高的准确度预测潜在的临床风险。

6.6. 临床转化路径与工程设备协同发展#

最终，实现靶向TIICs的光学探针从实验室到临床的成功转化，取决于解决探针设计和仪器设备两方面的挑战。许多设计精良的探针在应用于患者之前，仍需开展大量临床试验。研发新型探针的研究人员应优先选用获得监管机构（如FDA）批准的生物相容性材料，如普朗尼克F127、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和吲哚菁绿（ICG）。这些材料具有优异的生物相容性、可生物降解性和低免疫原性，已广泛应用于临床实践中，使用它们能够显着加快监管审查流程。

在仪器设备方面，多模态、多功能探针的发展趋势，要求同步研发高度兼容、便携且操作便捷的成像设备。成像质量既取决于探针本身，也同样依赖于硬件系统。探针化学家与生物医学工程师的密切合作，对于探针成功实现临床应用至关重要。简而言之，实现高性能肿瘤诊断与治疗的道路漫长且艰难，但随着持续的创新和跨学科研究的推进，光学探针无疑将成为这场战斗中不可或缺的重要助力。

[!cite] Xinglong Chen, Cong Hu, Heejeong Kim, Lemeng Zhang, Zhipengjun Zhang, Hongwen Liu, Juyoung Yoon; Optical probes for bioimaging of tumor-infiltrating immune cells and their applications in cancer immunotherapy. Chem. Soc. Rev. 2026; 55 (11): 6075–6116. https://doi.org/10.1039/d5cs01412c