【Nat.Biomed.Eng.】实时单颗粒荧光成像技术打破传统的均匀扩散假设，实现颗粒精细运动与沉积机制的突破#

Fig. 1: A mosaic pattern of aerosol deposition is observed using different aerosolized materials independent of ventilation modality.#

2.1 “水晶胸腔”平台的构建与通气模式#

研究团队利用微计算机断层扫描（micro-CT）获取小鼠胸腔的三维几何结构，并通过立体光刻（SLA）三维打印技术制作正向模具，热成型制备出透明、生物相容、且与小鼠年龄及应变相匹配的“水晶胸腔”。其内表面涂覆了永久性的亲水水凝胶涂层，以减少通气时的摩擦力。

实验中采用了多种通气模式，包括小鼠在麻醉状态下的自主呼吸（spontaneous breathing）、离体肺在水晶胸腔内的正压通气（PPV，模拟机械通气）和负压通气（NPV，模拟生理自主呼吸）。在常规实验中，呼吸频率控制在每分钟 120 次（120 bpm）。

2.2 气溶胶物料选择与递送系统#

研究测试了广泛的物料类型，覆盖了不同的特征尺寸与物理化学性质：

• 液体气溶胶：包含级联蓝（Cascade blue, 479 Da）、荧光素异硫氰酸酯结合白蛋白（FITC-albumin, 70 kDa）等不同分子量的可溶性荧光染料，以及特异性结合细胞核的 Hoechst 33342 和结合细胞膜的 DiD 染料。

• 纳米与微米颗粒：包括直径约 100-200 nm 的 DiD 标记 PLA-HPG 纳米颗粒、14-18 kDa 的抗纤连蛋白（Anti-FN1）纳米抗体，以及直径 1-2 µm 的大肠杆菌荧光菌株（E. coli-GFP）。

• 固体干粉：包括直径 1-5 µm 的荧光氨基甲醛聚合物微塑料球，以及直径 1.2-1.3 µm 的喷雾干燥合成肺表面活性剂药物制剂。

气溶胶通过微孔网式或超声网式雾化器产生，并通过专门定制的三维打印适配器和气管插管输送至小鼠气管。

2.3 实时光学成像与数据分析管线#

为了在动态呼吸过程中精确追踪微粒，研究采用了高通量高速旋转磁盘共聚焦显微镜（Spinning-disk confocal microscopy）及双光子显微镜。

为了清除呼吸运动带来的图像位移伪影，团队开发了基于 Python 3.9、SimpleITK、OpenCV 的图像稳定化处理管线，通过定向 FAST 和旋转 BRIEF（ORB）算法提取特征点进行精确的矩阵变换与 B-样条非刚性配准。微粒的单个轨迹跟踪则通过 FIJI 软件的 TrackMate 插件（采用 Hessian 检测器和卡尔曼跟踪器）实现。

3.1 层次化且确定性的“马赛克样”沉积模式#

研究最惊人的发现是，吸入的气溶胶并非均匀分散在所有肺泡中。相反，微粒 preferential 沉积在特定的近矩形肺泡区域，形成强荧光的“块区”（Tiles），而周围环绕着几乎没有微粒沉积的“带区”（Bands）（图1b）。这种独特的异质性空间分布被称为“马赛克模式”（mosaic pattern）。

该马赛克模式具有跨尺度的自相似层次结构，从全肺叶尺度延伸至肺泡尺度，分为大马赛克块（macrotiles）、中马赛克块（mesotiles）和微马赛克块（microtiles，仅包含几个肺泡）（图1b）。通过图像分割比对发现，在同一只小鼠体内先进行在体自主呼吸递送（红色荧光），随后在离体水晶胸腔内进行负压通气递送（青色荧光），两者的马赛克块区空间位置几乎完全一致，Dice重合系数高达 $96\% \pm 0.015\%$（图1c）。这表明气溶胶的沉积是由高度确定性的物理机制决定的，而非随机过程。

此外，马赛克模式在正压（PPV）、负压（NPV）以及自主呼吸下均表现出一致的大块区间距（图1d）。同时，这种沉积表现出明显的重力依赖性，与重力矢量最一致的肺叶展现出最高的荧光强度（沉积量最多）（Extended Data 图2）。

1
[吸入气溶胶] ──> 进入气道 ──> 沿直捷路径传输 ──> 优先沉积于 Tile 肺泡群 (高风险/高效区)
2
                                           └──> 窄且迂回路径 ──> 无法直接触及 Band 肺泡群 (免受暴露区)

3.2 通气参数对马赛克模式的调控#

研究探究了潮气量（Tidal volume）和呼吸频率（Respiratory rate）对该沉积模式的影响：

• 潮气量效应：将潮气量从低（0.15 ml）提升至高（0.30 ml）时，气管微流控芯片动态成像显示进入肺部的液滴数量显著增加（图1g）。这导致马赛克块区在多个尺度上的面积均发生显著增大（图1f, g，Extended Data 图4）。

• 呼吸频率效应：在保持潮气量不变的情况下，改变呼吸频率（60、120、180 bpm）并不会改变马赛克块区的几何大小（Extended Data 图5）。然而，降低呼吸频率会导致马赛克块区的荧光强度增强得更快（图1h, i）。

  研究团队利用斯托克斯数（Stokes number, $Stk$）对此进行了流体力学解释：

  $Stk=\frac{\rho_{p}d_{p}^{2}U}{18\mu D}$

  当呼吸频率加快时，气流速度 $U$ 增大，导致 $Stk$ 增加。较大的 $Stk$ 意味着微粒由于惯性难以跟随流体流线，更容易在主气道及气道分叉处发生惯性撞击沉积，从而减少了能够到达远端肺泡表面成象区的微粒数量。因此，在较高的呼吸频率下，需要更长的时间才能在肺表面累积出清晰可见的马赛克图样。

3.3 马赛克模式在全生命周期的演变与跨物种守恒#

研究追踪了从出生后 24 小时（P0）的新生鼠、成年鼠（2-4个月）到老年鼠（20-28个月）的肺部。结果显示，马赛克模式的空间组织架构从出生起便一直存在，并贯穿小鼠的整个寿命周期（图2a）。随着年龄的增长，单个马赛克中块（mesotile）内包含的肺泡数量显著增加，但块区之间的“带区”（Bands）宽度却表现出高度的保守性，在所有年龄段均稳定保持在 1-3 个肺泡的宽度（图2b）。

为了验证该发现的普适性，团队进一步测试了大型动物。在猪肺吸入气溶胶后，其胸膜表面同样观察到了清晰的块状异质性沉积（图2c，Extended Data 图6）。最后，通过对两例人类移植排斥肺叶（分别具有长期吸烟/COPD史和多囊纤维化病史）进行离体通气递送实验，同样观察到了类似的马赛克样沉积异质性（图2d，Extended Data 图7）。这些证据强有力地证明了马赛克沉积模式是哺乳动物正常肺部生理的共性底层规律。

3.4 气道解剖结构是马赛克模式的根本决定因素#

研究通过切片和疾病模型深入探究了马赛克模式的物理起源：

• 解剖学关联：精细大切片（PCLS）三维高分辨成像显示，马赛克沉积不仅存在于肺表面，还深居于肺实质内部（图3a）。高沉积的“块区”肺泡直接与终末细支气管的直捷路径相连，而无沉积的“带区”肺泡则占据了气道分叉后的窄小、迂回空间。这说明微粒倾向于沿阻力最小的直捷气流路径运动。

• 气道平滑肌调控：通过血管内灌注乙酰甲胆碱（Methacholine）诱导急性气道痉挛收缩，结果发现由于部分气道流量受限，部分马赛克块区的平均荧光强度显著下降，但整个马赛克块区的空间几何拓扑结构依然维持不变（图3b, c）。

• 肺泡结构破坏模型的验证：在弹性蛋白酶（Elastase）诱导的肺气肿小鼠模型中，尽管肺泡隔膜大量断裂、组织发生严重重塑（图3d），沉积的马赛克块区在表面覆盖的空间面积、整体组织形式仍与健康肺相似，仅表现出块区边界几何形状规则性的轻微下降（固实度 Solidity 显著降低）（图3e）。在黑色素瘤转移的小鼠模型中，只有当肿瘤结节体积跨越临界尺寸（>200 µm）并造成实质性的局部物理气道阻塞时，才会开始破坏马赛克块区的几何形态（图3f, g）。这些结果共同证实，更上游、更大尺度的气道分支结构而非局部的肺泡有力学微环境，是决定马赛克沉积模式的主导驱动力。

3.5 沉积后的再分布：分子量与年龄依赖性#

气溶胶液滴在接触肺泡上皮后的行为因物料性质而异：

• 扩散与模糊：低分子量荧光小分子（0.5 kDa）及纳米抗体（15 kDa）在沉积后数分钟内便会顺着液膜发生二次再分布，导致马赛克图样在 10 分钟内发生模糊（图4b, c）。

• 局域锁定：相比之下，亲脂性细胞膜结合染料（DiD）、高分子量右旋糖酐（70 kDa）、PLA 纳米颗粒（300 nm）、微塑料球（1-5 µm）以及大肠杆菌（1 µm）在沉积后数小时内均被紧紧锁定在初始着陆的马赛克块区肺泡内，不发生明显扩散（图4b, c）。

• 扩散系数（$D$）的定量：通过将空间线轮廓的荧光强度拟合至 Fick 第二扩散定律的球形模型：

  $\text{FWHM}^2 = 4\ln(2)Dt$

  定量测得年轻小鼠肺中可溶性染料的扩散系数（图4e, f）。然而在老年小鼠（20-28个月）和肺气肿小鼠中，高分子量（70 kDa）示踪剂的再分布速率显著下降，其扩散系数 $D$ 降低了整整一个数量级（图4d, f）。

• Kohn孔的瞬时屏障跨越：高速成像揭示了一个关键机制：单液滴撞击肺泡壁后，除了沿气液界面快速铺展外，还会在数毫秒内直接穿过特定上皮隔膜进入相邻肺泡（图4g）。这种超快速度（ms级）无法通过纯分子扩散解释，暗示其受到由表面张力梯度驱动的Kohn孔（pores of Kohn）侧支通气道的物理对流调控，而这种微结构在衰老过程中会发生实质性病理重塑。

3.6 单颗粒水平的肺泡内动力学异质性#

在更微观的尺度上，研究打破了“远端肺泡内微粒运动完全由无规则随机热运动（扩散）主导，因而沉积概率各向同性”的传统假设。

• 气体密度的影响：研究发现单液滴在肺泡腔内会悬浮 30-50 ms 随后才撞击着陆。若将吸入的载气替换为低密度的氦气，远端肺泡内观察到的气溶胶液滴数量会激增整整一个数量级（图5b）。

• 撞击角度偏好：在动态通气过程中，微粒并非均匀 landing 在肺泡四周，而是表现出强烈的空间角度偏好性，其撞击方位与肺泡在呼吸通气时发生的整体刚体运动位移矢量方向高度一致（图5d, e）。这直接证明了即使在最微小的肺泡尺度上，惯性效应（Inertial effects）依然在微粒的最终着陆中发挥着不可忽视的作用。而当呼吸运动被人为暂停（Paused ventilation）时，液滴在空腔内则回归为纯粹的扩散运动特征（均方位移 MSD 随时间呈线性对数关系，斜率系数 $m \approx 1$）（图5f, h）。