【Adv.Sci.】香港中文大学陈斯杰|打破超分辨成像瓶颈，OTS-12C兼顾线粒体嵴动态成像与抗氧化精准评估
文章标题：A Molecular Engineering Strategy to Fine‑Tune Phototoxicity of AIE Probes for Super‑Resolution Imaging of Mitochondrial Cristae Dynamics
通讯作者：Sijie Chen
文章概要
该研究提出了一种创新的分子工程策略，通过在聚集诱导发光（AIE）光敏剂中引入羧基并调控烷基链长度，成功实现了对光毒性的精准微调，摆脱了传统超分辨成像中高发光效率与高活性氧（ROS）毒性不可兼得的困境。研究团队成功开发出新型荧光探针OTS-12C，该探针不仅能以极高特异性锚定线粒体内膜，在STED和SIM超分辨成像下清晰呈现线粒体嵴的梯状微细结构，更突破性地将可控的低剂量活性氧释放转化为一种内在的“应激刺激”。这使得OTS-12C不仅能实时追踪活细胞内线粒体嵴在活性氧胁迫下的动态重构与自我修复，还开创了在纳米尺度下直观评估药物抗氧化功效的新范式，为线粒体相关疾病研究与抗氧化药物筛选提供了强大的双功能成像平台。
引言
线粒体作为真核细胞的能量工厂，其独特的双层膜结构尤其是高度折叠的内膜嵴，是执行氧化磷酸化和ATP合成的核心场所。当线粒体功能发生异常时，嵴的超微结构会发生剧烈的外观重塑，因此实时观测活细胞内线粒体嵴的动态演变对理解多种慢性疾病与衰老机制至关重要。传统的透射电子显微镜虽然分辨率极高，但严苛的制样固定程序使其无法捕获活细胞内的动态流变。近年来，受激发射损耗显微术（STED）和结构光照明显微术（SIM）等超分辨成像技术的兴起，使活细胞超微结构研究成为可能。然而，这些技术通常需要极高的激发光功率，极易诱导荧光探针产生大量毁灭性的活性氧，导致线粒体迅速受损、形态失真甚至引发细胞凋亡。传统策略一味追求完全抑制光毒性，往往伴随着复杂的化学合成或荧光亮度的牺牲。本研究则另辟蹊径，试图通过精准的化学修饰，将光毒性限制在一种温和、可控的生理应激范围内，从而利用这种微量ROS作为内置触发器，去主动观测线粒体嵴在面对氧化压力时的真实抗逆反应。
(a) Illustration of the design strategy of mitochondrial dyes based on previously reported IQ-TPA. (b) Absorption spectra and fluorescence emission spectra of OTS-4C, OTS-7C, and OTS-12C. (c) I/I0 plots of OTS-4C, OTS-7C, and OTS-12C in a mixture of DMSO/H2O, where I is the intensity with different H2O volume fractions (_f_w), and _I_0 is the initial intensity in DMSO. (d) Plots of the relative PL intensity of DCFH (for general ROS detection) in the presence of 10 µM OTS derivatives in PBS with 1 vol.% DMSO vs. irradiation time (white light, 30 mW•cm−2).
主要实验及结论
研究团队首先基于具有良好光稳定性的异喹啉阳离子核心进行系统性的模块化改造，如图1所示。为了红移吸收与发射波长，他们在三苯胺单元中引入了供电子的甲氧基，并用噻吩环取代了原本的稠环结构以延伸共轭骨架。为了精细调控光毒性，核心步骤在于引入亲水的羧基（COOH） 以及不同长度的烷基链，合成了OTS-4C、OTS-7C和OTS-12C三款衍生探针。光物理表征证实它们具有显著的聚集诱导发光（AIE）特性，随着水尺度的增加荧光强度大幅跃升。ROS生成检测显示，带有羧基的衍生探针其活性氧产量均显著低于未修饰的母体分子，其中总ROS和羟基自由基的生成速率呈现明确的链长依赖性。
(a) Calculated values of Log P based on different software. (b) ΔES-T and (c) SOC values of OTS, OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C based on density functional theory calculations. (d) Hydrodynamic diameters and distribution of OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C in 99 vol.% _dd_H2O. (e) Schematic illustration of the relationship between packing modes and nanoparticle sizes. (f) Time-resolved fluorescence decay of OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C in solution and aggregated state.
为了阐明这种光毒性调控的内在机理，研究团队进行了理论计算与物理表征，如图2所示。密度泛函理论计算表明，羧基的引入显著降低了单线态与三线态之间的自旋-轨道耦合（SOC）值，从而在源头上抑制了三线态的形成。同时，动态光散色与荧光寿命分析表明，烷基链越长，分子在聚集态下的堆积越紧密，其荧光寿命也相应延长。这种羧基介导的SOC抑制与链长依赖性分子堆积调控AI-ISC的双重机制协同作用，赋予了OTS-12C产生微量且高度可控ROS的独特本领。
(a) Confocal fluorescence images of living HeLa and NIH/3T3 cells incubated with 5 µM OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C for 30 min. (b) Cell viability of HeLa cells incubated with varied concentrations of OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C for 24 h. (c) Phototoxicity of OTS, OTS-4C, OTS-7C and OTS-12C in HeLa cells measured by cell survival rates after white light illumination for different periods of time. (d) Confocal fluorescence images in indicated iterations of HeLa cells labeled with Mito-tracker Green, OTS-7C or OTS-12C over 10 min by a confocal laser scanning microscope. Selected frames (#1, #20, #40, #60, #80, #100) from a 100-frame time-lapse sequence obtained by continuous epifluorescence scanning.
在活细胞应用中，生物相容性与靶向精准度得到了严格验证，如图3所示。CCK-8细胞活性实验表明，即使在无光照的高浓度孵育下，这几款探针也几乎无细胞毒性。共聚焦成像显示，OTS-7C和OTS-12C表现出极高的线粒体特异性靶向能力。在连续光照剥离的光毒性测试中，相比于未修饰分子导致的细胞大面积死亡，羧基化探针保护下的细胞展现出优异的生存率。此外，在长时间高频次扫描下，OTS-12C和OTS-7C展现出了超越商用高亮线粒体染料的超强抗光漂白性，为其在超分辨成像下的长时程追踪奠定了坚实基础。
在随后的超分辨成像挑战中，OTS-12C交出了惊艳的答卷，如图4所示。在STED显微镜下，传统共聚焦无法分辨的线粒体内部结构被彻底撕开，清晰地呈现出横向间距极小的梯状线粒体嵴模式，其成像半高宽达到了极高的空间分辨率。同时，利用高速、低损伤的Hessian-SIM成像，OTS-12C不仅同样能精准捕获嵴的超微外貌，其高时空分辨率还支持以每秒数帧的速度实时记录活细胞中线粒体嵴的纤细变化。
Fluorescence images acquired by confocal microscopy and STED microscopy and their corresponding intensity profiles along the lines across cristae in HeLa cells stained with OTS-7C (a,b) or OTS-12C (c,d). The insets are their corresponding enlarged views. (e) HeLa cells stained with OTS-12C were imaged using Hessian-SIM in time-lapse mode, and (f) the corresponding intensity profiles along the lines across cristae at the 0 s time point.
得益于这种微量可控的ROS释放特性，研究团队利用Hessian-SIM实现了对氧化应激下线粒体演变的全程录像，如图5所示。在温和的激发光功率下，他们首次目睹了线粒体从正常的管状结构在ROS诱导下转变为哑铃状，随后又神奇地重逆回管状并重新丰满嵴结构的完整自我修复过程。而在强光触发的高氧化应激下，则观察到线粒体出现典型的病理肿胀、嵴密度骤降。有趣的是，实验还意外捕捉到了原本缺乏嵴结构的线粒体亚群在应激状态下自发从头合成内膜折叠（嵴）的动态自适应机制，揭示了线粒体强大的功能可塑性。
(a and b) Time-lapse SR imaging of mitochondria in U2OS cells using Hessian-SIM under different laser intensities. Images were acquired at 9.26 fps, the 488 nm laser with an intensity of 2 mW (a) and 6.4 mW (b), respectively. Selected frames (#1, #100, #200, #400, #500, #600) from a 600-frame continuous time-lapse sequence under constant epifluorescence illumination.
这种由探针内置ROS引发的形态改变，进一步被开发成了纳米级药物评价系统，如图6所示。当细胞预先接触维生素C或虾青素等经典抗氧化剂后，再利用OTS-12C进行持续光照激活动态成像，结果直观地证实，抗氧化剂浸润的线粒体在数分钟内依旧能维持高度稳定的管状宽度和健硕的嵴密度，显著延缓了氧化损伤的发生，这直接证明了该探针具有定量、可视化评估抗氧化药物效能的独特潜力。
(a) Representative SIM time-lapse images of OTS-12C‑stained mitochondria in control, Vitamin C‑treated, and Astaxanthin‑treated cells with continuous light irradiation. (b, c) Quantification of mitochondrial width (b) and cristae density (c) over 6 min of continuous illumination. Data are presented as mean ± SD. Statistical significance was determined via Student’s t-test: *p< 0.05; **p< 0.01; ***p< 0.001; ****p< 0.0001; ns, not statistically significant. The mitigation of cristae disruption by antioxidant pretreatment validates OTS-12C as a dual‑function probe for imaging and functional assessment of mitochondrial oxidative stress.
最后，研究团队将超分辨与荧光寿命成像（FLIM）深度融合，探索了超微结构背后的理化环境演变，如图7所示。在持续高能激光照射导致嵴结构逐渐消隐的过程中，OTS-12C的荧光寿命呈现出精确的逐步延长趋势。通过排除膜张力与膜电位的影响，并结合脂质组分调控实验，团队最终证实这种荧光寿命的拉长，本质上灵敏地响应了ROS引起的线粒体内膜不饱和脂质过氧化、导致膜排列无序度及膜硬度发生改变的微环境过程，从而为线粒体受损程度提供了不依赖于形态的数字化多维评判标准。
Time-lapse (a) STED imaging and (b) fluorescence lifetime imaging of mitochondria in living HeLa cells stained with OTS-12C and (c) the corresponding fluorescence lifetime distribution of OTS-12C in the enlarged area was analyzed using Gaussian fitting at different time points. (d) Box plots of mean fluorescence lifetime and fluorescence lifetime images of mitochondria labeled by OTS-12C in living HeLa cells pretreated with or without palmitic acid (PA, 100 µM) and linoleic acid (LA, 400 µM) for 24 h.
总结及展望
该研究打破了“探针产生ROS即等同于劣质毒性”的传统成见，成功展示了如何通过精准的分子结构微调，将光毒性化作可控的科学工具。开发的双功能探针OTS-12C，在完美胜任线粒体超分辨结构成像的同时，通过释放温和ROS主动刺探线粒体的应激底线，不仅实时捕捉到了嵴重构与新型合成的 live-cell 证据，还实现了抗氧化药效的精细化、高灵敏体外可视化筛选。未来，这种“变害为利”、将成像与微量原位刺激相结合的设计逻辑，将为开发下一代智能化功能荧光探针打开全新大门，有望在更复杂的疾病模型中大放异彩。