【Angew.Chem.】深圳大学李明乐、王超联手广西大学曾林涛|18 秒极速响应！基于 TICS 机制打造 6.6 nM 级亚硝酸盐荧光传感新体系
文章标题：Twisted Intramolecular Charge Shuttle (TICS) Enables Ultrafast Ratiometric Sensing and Imaging of Nitrite
通讯作者：Lintao Zeng、Chao Wang、Mingle Li
文章概要
引言
比率型荧光传感凭借出色的抗干扰能力与自校准特性，成为分析检测领域的热门技术，但目前这类荧光探针的开发大多缺乏可通用的作用机理，理性设计依旧面临不小挑战。亚硝酸盐是衡量水质状况、自然界氮循环的重要环境指标，同时在生物体内参与一氧化氮稳态调节，还和亚硝化应激引发的各类病症密切相关，由于它在生物信号通路中存在时间极短，对应的检测技术不仅需要高灵敏度，还必须具备优秀的时间分辨能力。行业内长期使用的格氏（Griess）比色法是亚硝酸盐检测的经典手段，可该方法反应速率缓慢，且对酸碱环境十分敏感，完全无法应用于活体生物的实时成像分析。此前有研究将邻苯二胺（OPD）作为识别基团接入 NBD 荧光骨架，依托扭曲分子内电荷转移（TICT）机理构建亚硝酸盐探针，不过该体系存在电子耦合效果不佳、反应动力学迟缓、抗干扰性能弱、荧光开启比例低等诸多问题。研究团队经过分析判断，这些缺陷并非来源于 OPD 识别片段，而是识别基团在荧光母核上的连接位点不够合理，于是决定另辟蹊径，利用荧光团独特的中位（meso-position） 进行分子改造，并结合全新的扭曲分子内电荷穿梭（TICS） 机理，开展新一代亚硝酸盐比率荧光探针的研发工作。
The illustration of the previous work on (a) donor engineering design strategy, (b) TICT mechanism, (c) NO2− detection with NBD-OPD, and (d) its corresponding detection performance. The illustration of this work on (e) meso-position engineering design strategy, (f) TICS mechanism, (g) NO2− detection with PY-OPD, and (h) its corresponding detection performance. (i) The broad applicability of the TICS mechanism to various fluorophores.
主要实验及结论
研究团队选取吡喃鎓（PY）作为荧光母核，将邻苯二胺（OPD）片段精准修饰在其活性中位，成功构建出目标探针PY-OPD。团队先借助含时密度泛函理论（TD-DFT） 开展理论模拟计算，对探针及其衍生物的紫外 - 可见吸收光谱、分子几何构型、自然跃迁轨道以及 HOMO-LUMO 能带间隙进行预测，结果显示质子化、去质子化以及与亚硝酸盐发生重氮化环化反应后，分子吸收峰、扭转角度和能带间隙都会发生规律性变化，完全符合 TICS 型比率传感的结构要求。研究人员完成了 PY-OPD 的化学合成，并通过X 射线单晶衍射明确了分子的晶体结构，晶体数据证实探针中的氨基质子活性较高，在水溶液中会自发形成动态的基态平衡，这一结果和理论计算相互印证。后续对不同 pH 环境下探针的光谱测试，也进一步验证了整套分子设计方案的科学性与合理性。
(a) Schematic illustration of the working mechanism of PY-OPD toward NO2−. Calculated (b) UV–vis absorption spectra and (c) the optimized molecular geometries, electron and hole NTOs, oscillator strengths, and the HOMO-LUMO gaps of PY-OPD derivatives at the CAM-B3LYP-D3BJ/Def2-SVP level of theory in water. (d) The molecular geometry of PY-OPD in the crystalline state. The absorption spectra of PY-OPD (e) at different pH values and (f) in response to NO2−, along with the corresponding photograph of color changes. (g) The linear relationship between the absorbance at 592 nm and NO2− concentration. (h) Changes in the CIE chromaticity diagram. (i) UV–vis absorption spectra of Griess reagents (10 µM) in the presence of NO2−. (j) Competitive selectivity of the Griess reagent. (k) UV–vis absorption spectra of the PY-OPD after treatment with various analytes. Error bars represent ± SD, n = 3.
在传感性能测试环节，PY-OPD 与亚硝酸盐发生反应后，体系吸收光谱出现118 nm的显著红移，溶液肉眼可见从金黄色转变为深紫色，同时分子摩尔吸光系数提升一倍以上，光谱中出现的等吸收点也证明该反应是纯净的两态转化过程，不会产生长寿命中间产物。实验数据显示，这款探针用于荧光比率检测时，检出限低至 6.6 nM，优于绝大多数已报道的同类荧光探针与传统格氏法，同时实现了18 秒的超快响应，反应速度相比格氏法提升了两个数量级。结合激发态势能面、轨道分布等理论分析，研究团队证实该探针的荧光调控机制为TICS 效应，而非以往常见的光诱导电子转移（PET）：原始状态下探针受强 TICS 作用影响几乎不产生荧光，质子化后 TICS 效应被部分抑制，荧光微弱恢复，当与亚硝酸盐反应完成后，TICS 被彻底阻断，探针发出红移的强荧光，由此形成特征性比率信号。团队还将 OPD 片段修饰在多种吡喃鎓衍生物的中位，制备出系列探针，所有样品均展现出优异的亚硝酸盐识别能力与快速反应特性，证明荧光团中位修饰结合 TICS 机理是一套普适性极强的探针设计策略，并且 PY-OPD 在 21 种常见共存阴离子存在的环境中依旧能特异性识别亚硝酸盐，抗干扰能力表现突出。
(a) Schematic illustration of TICS and (b) the corresponding ratiometric sensing mechanism of PY-OPD. (c) Calculated excited state PES for TICS and (d) the corresponding optimized molecular geometry, electron and hole NTOs, and the oscillator strengths at the CAM-B3LYP-D3BJ/Def2-SVP/cLR-SMD level in water. (e) Fluorescence response of PY-OPD (10 µM) towards NO2− (0–10 µM). Inset: fluorescence images of PY-OPD before and after reaction with NO2−. (f) Linear relationship between fluorescence intensity ratio (F615/F565) of PY-OPD (10 µM) versus the concentrations of NO2−. (g) Time-dependent fluorescence responses of PY-OPD to NO2− (10 µM). (h) Fluorescence spectra of PY-OPD (10 µM) in water/glycerol systems with increasing viscosity. λex = 520 nm, slit width: 2 nm/2 nm.
研究人员首先将 PY-OPD 应用于实际样品检测，选取腊肉、酱肉、香肠、熏鸭等肉制品，以及江河、湖泊等环境水体作为检测对象，采用紫外 - 可见吸收、荧光比率双模式开展定量分析。最终检测结果和经典格氏法的测试数据高度吻合，加标回收率、相对标准偏差等指标均处于理想范围，充分证明该探针在复杂实际基质中也能保持良好的检测准确性与重复性。为实现现场快速检测的应用需求，团队把 PY-OPD 固定在试纸芯片上，结合智能手机搭建起便携式智能传感平台（PSSP），通过手机采集自然光与紫外光下的样品图像，依托图像 RGB 数值建立定量标准曲线，整套设备可在 60 秒内完成检测，兼具操作简单、可视化效果好的优势，十分适合食品与环境水体中亚硝酸盐的现场筛查工作。
(a) Chemical structures of APY-OPD, JPY-OPD, 2JPY-OPD, and PPY-OPD. (b) Calculated excited state PES for TICS of neutral species (R-OPD), protonated species (R-OPD-Pro), and the reaction products (R-BTA) at the CAM-B3LYP-D3BJ/Def2-SVP/cLR-SMD level in water. R = APY, JPY, 2JPY, and PPY. (c) UV-vis absorption spectra and (d) fluorescence spectra of OPD-based probes. (e) Fluorescence intensity as a function of time of OPD-based probes.
(a) Schematic diagram of the PSSP for detecting NO2− in food and water samples. (b) Daylight and fluorescence patterning of PY-OPD chip after exposure to different concentrations of NO2− (0, 2, 4, 6, 7, 8, 9, and 10 µM). (c) Time-lapse daylight and fluorescence images of the PY-OPD sensing chip after exposure to real samples (WS 1: Yongjiang River; WS 2: South Lake; FS 1: bacon; FS 2: duck meat; FS 3: Sausage). (d) The linear calibration curves between the G value of the PY-OPD sensing chip and the concentrations of NO2− (0–10 µM). (e) The contents of NO2− in samples were determined by the PY-OPD sensing chip and the Griess method, respectively. The error bars represent ± SD, n = 3.
团队挑选综合性能优异的 APY-OPD 探针，开展活体植物内亚硝酸盐动态成像研究，分别以豆芽、萝卜肉质根作为模式植物，搭建起外源亚硝酸盐胁迫、高氮营养胁迫、低温联合缺氧胁迫等多种实验模型。共聚焦荧光成像结果直观呈现出植物细胞内亚硝酸盐含量的动态变化规律，实验发现过量的铵根、硝酸根会打乱植物自身的氮代谢通路，造成亚硝酸盐异常堆积；低温环境会显著抑制亚硝酸盐还原酶的活性，缺氧条件则会阻碍植物有氧呼吸、减少能量供给，两种环境压力叠加后，会进一步加剧亚硝酸盐在植物体内的蓄积。这款探针凭借高时空分辨率的成像能力，为解析植物在环境胁迫下的氮代谢调控机制、把控采后果蔬的品质安全，提供了全新且可靠的研究工具。
(a) Confocal fluorescence imaging using APY-OPD to detect NO2− concentration changes in soybean sprout cells: (1) exogenous NO2− changes; (2) intracellular NO2− changes induced by high concentrations of NH4+ and NO3− in the nutrient solution. Scale bar = 250 µm. (b) Photographs and fluorescence images of soybean sprouts after cultivation in nutrient solutions containing NO2− (0, 2, 4, or 10 µM), NH4+ (4 mM), and NO3− (10 mM). (c) Soybean sprout cells’ average fluorescence intensity in different groups (n = 3). (d) Soybean sprouts’ average fluorescence intensity in different groups (n = 3).
(a) Confocal fluorescence imaging using APY-OPD to detect NO2− concentration changes in white radish cells: (1) Exogenous NO2− changes; (2) Temperature- and oxygen-concentration-induced changes in intracellular NO2−. Scalebar = 250 µm. (b) white radish cells’ average fluorescent intensities in different groups (n = 3). (c) Schematic diagram of temperature- and oxygen-concentration-induced intracellular NO2− changes.
总结及展望
该研究首次将扭曲分子内电荷穿梭（TICS） 机理系统性应用于亚硝酸盐比率型荧光探针的设计研发，通过在荧光团中位修饰邻苯二胺识别基团，有效解决了传统探针反应速率慢、灵敏度不足、抗干扰能力差等痛点，开发出兼具超灵敏、超快响应、高特异性的新型传感探针。这套基于荧光团中位改造的设计思路并不局限于单一分子骨架，能够拓展应用到多种吡喃鎓衍生物中，具备极高的推广价值。研究工作打通了分子理性设计、实验室精准检测、现场快速筛查以及活体生物成像的完整应用链条，不仅实现了食品、环境水样中亚硝酸盐的高效定量检测，还成功解析了植物体内亚硝酸盐的代谢规律与环境胁迫的影响机制。未来，这套以机理为导向的分子工程策略，能够为各类比率型荧光传感器的研发提供全新思路与参考，而研究中搭建的便携式检测平台和活体成像技术，也有望持续优化，在食品安全监管、生态环境监测、植物生理基础研究等多个领域发挥更大的作用。