【Nat.Photon.】5nm “荧光探针” 横空出世！单链超小荧光聚合物点实现16nm活细胞单蛋白追踪精度达

✨文章标题：Single-chain ultrasmall fluorescent polymer dots enable nanometre-resolution cellular imaging and single protein tracking ✉️作者：Yifei Jiang, Qingrui Fan, Jianjun Wang & Xiaohong Fang 等 🔗链接：https://doi.org/10.1038/s41566-025-01767-1

在生物医学的微观世界里，科学家们一直渴望拥有一双 “超高清显微镜”。它不仅要能看清细胞内纳米级的生物结构，还要能实时追踪单个蛋白质的动态活动，这对理解生命机制、攻克疾病至关重要。

但长期以来，这个愿望被两个难题困住：传统荧光染料和蛋白虽小（<5nm），却亮度不足、光稳定性差，难以捕捉快速变化的微观过程；而荧光纳米颗粒虽亮度高、稳定性强，却体型偏大（>10nm） ，容易干扰生物分子的自然活动，且表面化学性质复杂，难以实现精准标记。

就在 2025 年 10 月，发表在《Nature Photonics》上的一项研究，彻底打破了这个僵局。中国科学院的科研团队研发出一种单链超小荧光聚合物点（suPdots） ，尺寸小于 5nm，兼具超高亮度、优异光稳定性和精准标记能力，让纳米级生物成像和单蛋白追踪变得更高效、更易实现。

核心突破：5nm “荧光探针” 是如何炼成的？

要解决传统荧光探针的痛点，关键在于找到 “小尺寸” 与 “高性能” 的平衡点。科研团队另辟蹊径，采用了一种类似 “速冻保鲜” 的创新方法 ——玻璃化策略，成功制备出单链超小荧光聚合物点。

制备原理：给聚合物链 “速冻定型”

这个制备过程可以类比为制作 “纳米级果冻”。首先，科研团队将共轭聚合物溶解在有机溶剂中，形成均匀的前驱体溶液。此时，溶液中的聚合物链像一根根散开的细线，保持着独立的状态，这一步要严格控制聚合物浓度，避免链之间相互缠绕。

接着，他们将这种溶液滴在预先用液氮冷却至≤-150℃的低温台上。瞬间的超低温让溶剂迅速凝固，就像把聚合物链 “冻” 在玻璃状的固体基质中，这就是 “玻璃化” 过程。这个步骤的关键作用是锁定聚合物链的自然构象，防止它们在后续处理中聚集。

最后，通过冷冻干燥去除凝固的溶剂，再将得到的固体重新分散在水中，就形成了单分散的 suPdots。整个过程就像把散开的细线快速冷冻固定，再去除周围的介质，最终得到一根根独立的、尺寸极小的 “荧光探针”。

这种制备方法的优势十分明显。一方面，它能有效抑制聚合物链的缠绕，确保 suPdots 的尺寸控制在 5nm 以下，与绿色荧光蛋白相当；另一方面，该方法具有广泛的适用性，能用于多种商业化荧光聚合物，实现 420-650nm 的可调荧光发射，为多色成像提供了可能。

更重要的是，这种制备工艺还具备良好的 scalability，轻松就能实现 500ml 规模的生产，且不同批次的产品重复性高，为后续的实际应用奠定了基础。储存方面也很便利，在 4℃避光条件下，suPdots 能稳定保存至少 6 个月，始终保持其超小尺寸和优异的光学性能。

结构特性：单链设计 + 可控功能化

suPdots 最核心的结构特点是 “单链组成” ，这也是它区别于传统荧光纳米颗粒的关键。为了证实这一点，科研团队设计了一组巧妙的实验。他们选择了两种光谱重叠的聚合物 PFO（供体）和 PFBT（受体），如果它们处于同一颗粒中，会发生福斯特共振能量转移（FRET），表现为单一的发射峰。

实验结果显示，通过玻璃化策略制备的 suPdots，在不同激发波长下呈现出两个独立的发射峰，分别对应 PFO 和 PFBT，说明 FRET 效应几乎没有发生，证明每个 suPdots 只包含一种聚合物链。而通过传统纳米沉淀法制备的大尺寸颗粒，则表现出单一发射峰，证实了多链聚集的存在。

这种单链结构带来了一个重要优势：可以精准调控表面功能基团的密度。科研团队通过两种方式实现了羧基（-COOH）功能化：一种是将荧光聚合物与含酸酐的表面活性剂物理混合，另一种是直接在聚合物链上化学引入羧基。

通过与荧光染料 Alexa Fluor 568 的共价结合实验验证，化学合成的 COOH-suPdots 表面羧基密度更均匀，荧光强度分布更窄。这意味着，未来可以通过侧链工程，实现 suPdots 与目标分子的精准化学计量比结合，为精准生物标记提供了可能。

性能实测：碾压传统探针的 “荧光利器”

一款优秀的荧光探针，最终要靠性能说话。科研团队从光物理特性、生物标记能力、超分辨成像表现等多个维度，对 suPdots 进行了全面测试，结果堪称 “碾压级”。

光物理性能：亮度爆表 + 稳定性拉满

亮度是荧光探针的核心指标之一，直接决定了成像的清晰度和追踪的灵敏度。科研团队将 suPdots 与三种常用的商业探针 —— 荧光蛋白（EGFP）、有机染料（Alexa 488）和量子点（Qdots 605）进行了对比测试。

在相同的成像条件下，CNPPV suPdots 的单颗粒每秒光子计数达到了 1.4×10⁴，是 EGFP（约 850）的 15 倍，Alexa 488（约 2.1×10³）的 7 倍，甚至是量子点 Qdots 605（约 6.5×10³）的 2 倍。如果进一步提高激光功率，suPdots 的亮度还能再提升约 2 倍，饱和激发功率仅为 0.2kW/cm²，展现出极强的光响应能力。

光稳定性同样表现出色。在 STED 成像中，经过 150 帧的连续拍摄后，商用 STED 染料 ATTO 565 的荧光信号几乎完全漂白，而CNPPV suPdots 仍保留了超过 50% 的初始荧光强度，PDFDP suPdots 更是保留了 90% 以上，这为长时间持续成像提供了保障。

不同类型的 suPdots 还表现出多样化的闪烁行为。PFO 和 PFBT suPdots 呈现出明显的 “开关闪烁”，而 CNPPV 和 PDFDP suPdots 则表现为连续波动。这种差异与聚合物的主链结构、侧链取代基和缺陷有关，意味着可以通过分子设计来调控 suPdots 的闪烁特性，适配不同的成像需求。

生物标记：高密度 + 低干扰

生物相容性和标记特异性是荧光探针进入生物体系的 “敲门砖”。suPdots 在这方面表现优异，细胞毒性实验显示，即使在 50μg/ml 和 100μg/ml 的高浓度下，孵育 48 小时后，HeLa 细胞的存活率仍保持在较高水平，证明其良好的生物相容性。

超小尺寸（<5nm）带来了一个关键优势：极低的空间位阻。这使得 suPdots 能够实现高密度的特异性标记，避免了传统大尺寸颗粒因空间拥挤导致的标记不连续问题。科研团队成功用 suPdots 标记了细胞内的多种亚细胞结构 —— 微管蛋白、网格蛋白包被小窝（CCPs）和线粒体，都获得了清晰的成像效果。

尤其是对微管蛋白的标记，suPdots 展现出连续的丝状结构，而传统大尺寸聚合物点（~20nm）标记则呈现出不连续的点状分布，对比十分明显。多色标记方面，利用不同发射波长的 suPdots（CNPPV 发射绿色荧光，PDFDP 发射品红色荧光），可以同时清晰观察到微管蛋白和 CCPs 的相对分布位置，为多靶点成像提供了便利。

超分辨成像：25nm 分辨率 + 多色兼容

刺激发射损耗（STED）显微镜是常用的超分辨成像技术，而探针的性能直接决定了成像分辨率。suPdots 凭借其超小尺寸和高光稳定性，在 STED 成像中表现出惊人的能力。

针对 CCPs 的成像结果显示，在共聚焦显微镜下只能看到模糊的斑点，而使用 CNPPV suPdots 的 STED 成像，成功分辨出了连续的环状结构，甚至能清晰观察到由 2-3 个环状结构组成的 CCPs 聚集体。定量分析表明，STED 成像下 CCPs 的平均直径为 178nm，与电子显微镜和随机光学重建显微镜的结果一致，证明了其成像的准确性。

分辨率方面，CNPPV 和 PDFDP suPdots 在 STED 成像中都实现了25nm 的超高分辨率，是传统聚合物点的 3 倍左右。更令人惊喜的是，suPdots 的大斯托克斯位移（~250nm）让多色 STED 成像变得异常简单 —— 只需一对激发 / 损耗激光（488nm 激发，775nm 损耗），就能实现双色超分辨成像，分辨率达到 51nm，远超现有双色 STED 纳米探针的性能。

这一突破解决了传统多色 STED 成像中需要精准对齐多条光路的难题，大大降低了实验复杂度，为同时观察多种生物结构的动态相互作用提供了强大工具。

单蛋白追踪：16nm 步长 + 50Hz 帧率

在活细胞内追踪单个蛋白质的动态过程，是理解生命活动机制的关键，但这对荧光探针的要求极为苛刻 —— 既要足够小，不干扰蛋白质功能，又要足够亮，能在高帧率下提供清晰信号。

此前，要在活细胞内观察驱动蛋白 - 1（kinesin-1）的步进运动，只能依靠昂贵且复杂的 MINFLUX 显微镜。而科研团队用 suPdots 实现了一个壮举：在普通的转盘共聚焦显微镜上，就完成了活细胞内单个驱动蛋白 - 1 的纳米级追踪。

他们通过 HaloTag 配体将 suPdots 与驱动蛋白 - 1 特异性结合，再通过电穿孔技术将其导入 HeLa 细胞。成像结果显示，suPdots 标记的驱动蛋白 - 1 能沿着微管蛋白定向移动，扩散系数与染料标记的驱动蛋白 - 1 几乎一致（P=0.81），证明suPdots 的结合并没有影响驱动蛋白的正常功能。

追踪精度方面，suPdots 的定位不确定度仅为 8.1nm（理论值 8.5nm），在 50Hz 的 temporal 分辨率下（每帧 20ms），成功捕捉到了驱动蛋白 - 1 约 16nm 的步进运动，统计平均步长为 15.7nm，与 MINFLUX 显微镜的观测结果完全一致。

光稳定性测试中，suPdots 在连续扫描 10 秒后仍保留了 70% 的初始信噪比，而商用 JF 染料在 4 秒后信号就几乎消失了。这意味着，suPdots 能够支持长时间的单蛋白动态追踪，为研究蛋白质在生理环境下的工作机制提供了前所未有的便利。

应用展望：从基础科研到临床诊断的无限可能

suPdots 的出现，不仅解决了荧光探针领域长期存在的 “尺寸 - 性能” 矛盾，更在多个领域展现出巨大的应用潜力。

在基础生物学研究中，它将成为科学家的 “微观望远镜”。凭借超高的空间分辨率和时间分辨率，研究人员可以更清晰地观察细胞内亚细胞结构的精细形态，比如 CCPs 的环状聚集、微管蛋白的网络分布等；更重要的是，能够实时追踪单个蛋白质的动态过程，如驱动蛋白的运输机制、酶的催化过程、受体与配体的相互作用等，为破解生命奥秘提供关键数据。

多色超分辨成像能力则让同时观察多个生物过程成为可能，比如在同一细胞内观察微管运输与囊泡形成的协同作用，这对理解细胞内复杂的信号网络和代谢路径具有重要意义。

在医学诊断领域，suPdots 也有着广阔的前景。其超高灵敏度可以实现早期疾病标志物的精准检测，比如血液中微量肿瘤标志物的检测，为癌症的早期筛查提供新工具；细胞水平的精准成像则有助于病理切片的更精准分析，帮助医生发现传统成像技术难以察觉的微小病变。

未来，随着表面功能化技术的进一步优化，suPdots 有望实现靶向给药与成像监测的一体化—— 既可以作为药物载体，将药物精准递送到病灶部位，又能通过荧光成像实时监测药物的分布和作用效果，为个性化治疗提供支持。

不过，这项技术目前也存在一些需要完善的地方。比如，部分 suPdots 存在的 “开关闪烁” 行为，虽然在某些场景下有用，但在需要持续成像的应用中可能会造成信号中断；此外，虽然已经实现了较大规模的制备，但要满足临床应用的巨大需求，还需要进一步优化工艺，降低成本。

科研团队表示，未来将通过分子结构设计进一步调控 suPdots 的光学性能，同时开发更多针对特定生物靶点的功能化探针，拓展其在活体成像、临床诊断等领域的应用。

结语：荧光探针的 “纳米革命”

从传统荧光染料的亮度不足，到纳米颗粒的尺寸困扰，生物成像领域的科学家们一直在寻找完美的荧光探针。中国科学院团队研发的 suPdots，以5nm 的超小尺寸、15 倍于荧光蛋白的亮度、25nm 的超分辨能力和 16nm 的单蛋白追踪精度，实现了一次颠覆性的突破。

更重要的是，它采用的玻璃化制备方法简单高效、易于规模化，且兼容普通显微镜设备，大大降低了纳米级生物成像的门槛。这意味着，未来更多实验室都能用上这种高性能探针，加速生物医学研究的进程。

随着技术的不断成熟，我们有理由相信，suPdots 将在基础科研、医学诊断、药物研发等多个领域发挥关键作用，帮助我们更深入地探索微观生命世界，为人类健康带来新的希望。这场由中国科学家引领的荧光探针 “纳米革命”，才刚刚拉开序幕。