【Nature】北京大学刘志博|让偶联药物在细胞表面完成释放：一种不依赖内吞的靶向递送策略#

Summary

针对多数肿瘤靶点内吞效率低、传统偶联药物难以释放毒素的瓶颈，该研究提出了“结合即释放”（BTR）策略，开发出邻近诱导的五价磷-酚交换（PhoPEx）化学反应。药物分子与靶点（如FAP、PD-L1）结合后，利用结合口袋邻近残基直接触发胞外药物释放，在多种体内模型中实现肿瘤高效消退并拓宽了治疗窗口。

靶向递送长期依赖内吞，把九成以上的膜蛋白挡在门外#

在肿瘤靶向药物递送领域，抗体偶联药物（ADC）和小分子偶联药物（SMDC）是目前应用最广泛的分子形式之一。这类药物的标准工作模式是“内吞后释放”（internalization-to-release, ITR）。它的基本逻辑是：偶联分子先通过抗体或配体识别肿瘤细胞表面的特异性抗原，随后依赖受体介导的胞吞作用将整个复合物吞入细胞内部，进入内体并最终转运至溶酶体。在溶酶体的酸性环境或特定组织蛋白酶（如组织蛋白酶B）催化下，连接子断裂，从而将细胞毒性小分子释放出来杀伤肿瘤细胞。

这种机制虽然在临床上取得了明确成效，但在分子靶点的选择上存在明显的天然局限。人类细胞膜蛋白有2000多种，但其中能够介导高效内吞的蛋白只有大约10%（约180种）。绝大多数具有高度肿瘤特异性的表面抗原并不具备高效内吞的能力。

成纤维细胞活化蛋白（FAP）就是一个代表性的例子。FAP在多种实体瘤的肿瘤相关成纤维细胞（CAF）以及部分肿瘤细胞表面高度表达，而在绝大多数正常组织中表达极低。在核医学诊断中，基于FAP抑制剂（FAPI）的放射性示踪剂已经在28种以上的癌症类型中展现出清晰的显影效果。但在治疗性偶联药物开发中，FAP靶向药物一直进展缓慢。针对FAP开发的ADC候选药物（如OMTX705）在临床试验中的最佳疗效仅为26%的患者实现疾病稳定。这类靶点与偶联分子结合后，无法迅速把药物吞入细胞内部，导致偶联药物在细胞表面快速解离并被血液循环清除，难以在肿瘤局部释放足够浓度的毒素。

除了靶点选择受限之外，内吞途径本身也是一个多步骤、效率逐级衰减的过程。偶联药物从细胞表面结合、形成内吞小泡、内体分选到溶酶体降解，每一步都有相当比例的分子发生解离、降解失败或被回收到细胞外，最终能够真正进入胞浆发挥杀伤作用的毒素分子通常只占进入细胞总量的一小部分。

此前，为了绕开内吞限制，学术界和工业界尝试过几种非内吞或胞外释放策略。例如利用肿瘤微环境中微量存在的细胞外基质金属蛋白酶或组织蛋白酶进行剪切，或者设计需要先后两次给药的生物正交“点击释放”系统。然而，胞外酶切策略往往面临体内特异性不足的问题，相关水解酶在肝脏、血液等正常组织中也存在活性，容易引发脱靶释放；而两步法化学释放系统则面临两次注射药物在肿瘤局部的药代动力学难以完美匹配的实际困难。因此，如何在单个分子体系内，不依赖外源酶或辅助试剂，仅凭靶向结合本身直接触发精准释放，成为偶联药物递送中长期悬而未决的技术瓶颈。

Fig.1 PhoPEx chemistry enables a BTR strategy for endocytosis-independent targeted drug release.#

不等细胞吞进去，让配体结合直接触发化学键断裂#

为了解决上述问题，研究人员转变了思路，提出了一种“结合即释放”（binding-to-release, BTR）的设计理念。这种设计的核心逻辑在于：将毒素释放的触发条件从“细胞内吞并转运至溶酶体”，转变为“配体与受体结合口袋对接后引发的近邻化学反应”。

这种想法借鉴了化学生物学中的配体导向邻近化学反应原理。配体与靶蛋白活性口袋特异性结合时，二者的空间构象是高度固定的。如果在配体分子的特定位置安装一个亲电反应中心，并连接上毒素分子；当配体插入靶蛋白口袋后，这个亲电中心刚好能够与蛋白口袋周围原本就存在的亲核氨基酸残基（如酪氨酸、组氨酸或丝氨酸）在空间上靠得非常近。这种极短的空间距离会大幅提高局部有效碰撞浓度，促使亲核残基直接进攻亲电中心，发生取代反应。在亲核基团与亲电中心形成共价连接的同时，原先连接毒素的离去基团发生自发消除，将毒素以游离形式在细胞表面直接释放出来。

为了让这个设想成为可行的药物化学工具，研究团队开发了一种基于五价磷的反应体系——五价磷-酚交换反应（PhoPEx）。

在化学探索的初期，研究人员首先考察了六价硫氟交换（SuFEx）化学。SuFEx虽然在化学生物学中共价标记蛋白表现优异，但直接用它构建自消除型连接子时遇到了困难。如果将SuFEx中的氟原子替换为酚类自消除离去基团（即六价硫-酚交换，SuPEx），即使引入强吸电子的对硝基苯酚，在体外溶液中与酪氨酸类似物反应48小时也几乎检测不到取代产物。

受到生物体系中磷酸酯键反应特性的启发，研究人员将核心亲电中心从六价硫（S）调整为五价磷（P），设计出PhoPEx反应骨架。实验发现，五价磷中心的引入显著提高了对酪氨酸酚羟基的反应活性。基于此，研究团队设计了一系列带有酚类自消除离去基团的五价磷连接子，用于连接靶向配体与功能分子（荧光分子或抗肿瘤毒素）。

在作用机制上，BTR策略释放出的毒素处于细胞膜外表面。为了使药物能够真正杀灭肿瘤，该策略明确要求所搭载的细胞毒素必须具备良好的细胞膜通透性（例如MMAE或喜树碱类衍生物Exatecan）。释放出来的游离脂溶性毒素分子可以通过自由扩散直接穿过细胞膜进入靶细胞胞浆，也可以扩散到周围临近的抗原阴性肿瘤细胞中，产生较强的旁观者效应。对于像FAP这种主要分布在间质成纤维细胞上的靶点而言，这种胞外释放后自由扩散的特征，反而有助于毒素均匀覆盖致密肿瘤组织中的各类细胞。

Fig.2 Binding-induced PhoPEx release through Tyr745 proximity.#

从体外反应动力学到动物模型的全链条证据检验#

为了验证PhoPEx化学及其介导的BTR策略在生物体内的可行性与严谨性，作者从基础化学修饰、作用靶点解析、细胞功能验证到多种体内肿瘤模型，提供了相对完整且能够交叉印证的实验证据链。

1. 结构微调与反应动力学筛选#

第一代PhoPEx连接子虽然能够在体外实现FAP依赖的释放，但反应速率相对较慢，难以匹配小分子药物在活体内的快速代谢清除特性。为此，研究人员系统合成了15种在离去基团苯环不同位置带有吸电子或供电子取代基的PhoPEx衍生物，以SuFEx分子作为对照基准，平行测定了它们的反应速率常数（ $k_{react}$ ）与pH 9.5条件下的水解速率常数（ $k_{hydro}$ ）。

筛选结果表明，引入间位氟取代（m-F）和对位酰胺取代（p-CONH2）的化合物在活性与稳定性之间取得了最佳平衡。其中间位氟取代化合物的反应速率常数达到 $3.92\times10^{-3}\,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$ ，与SuFEx对照（ $3.99\times10^{-3}\,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$ ）相当，但其水解速率常数仅为 $2.28\times10^{-8}\,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$ ，水解稳定性约为SuFEx的4倍。优化后的第二代分子（间位氟修饰）与纯化FAP蛋白孵育时，反应半衰期缩短至3.5小时，能够更好地匹配小分子在体内的药代动力学时间窗。

Fig.3 The BTR strategy exhibits release specificity for efficient drug delivery.#

2. 反应位点的生物物理与结构学确证#

为了证明毒素释放确实来自于靶点活性口袋周围残基的亲核进攻，而不是由于FAP蛋白自带的酶切水解活性所致，作者联合使用了串联质谱（MS/MS）、定点突变和冷冻电镜（Cryo-EM）进行交叉验证：

串联质谱分析： 将放射性标记探针与FAP蛋白共孵育后进行酶解质谱鉴定，明确证实Tyr745（745位酪氨酸）是共价结合的主要位点，同属于该α螺旋区域的His743和Thr741为次要反应位点。
定点突变验证： 当把FAP蛋白的745位酪氨酸突变为不具备亲核酚羟基的苯丙氨酸（Y745F）后，探针的不可逆共价结合能力显著丧失，其介导的毒素释放效率相较于野生型FAP下降了63%。
冷冻电镜解析： 解析得到的复合物三维结构显示，配体部分紧密结合于FAP的催化中心口袋，分子模拟与密度图显示反应性磷中心与Tyr745之间的空间距离约为4.99 Å，从空间构象上合理解释了邻近诱导反应的高反应活性。

3. 释放特异性与体外细胞毒性测试#

在特异性测试中，FAP-BTR分子展示出严格的选择性：

在体外与过量100倍当量的各种亲核氨基酸（半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸等）、10倍当量的其他非靶标蛋白（白蛋白、碱性磷酸酶、组织蛋白酶B），以及FAP的同源水解酶（DPPIV、PREP）共孵育时，均未检测到明显的非特异性毒素释放，对FAP蛋白的结合选择性高于同源蛋白1000倍以上。与之对比，传统用于FAP前药开发的Gly-Pro二肽底物很容易被DPPIV、PREP和CTSB非特异性切开。
在细胞水平，搭载MMAE的FAP-BTR小分子偶联物对FAP阳性细胞（U87MG-FAP）的半数抑制浓度（ $\text{IC}_{50}$ ）为9.0 nM，而对FAP阴性对照细胞（U87MG-Vector）的 $\text{IC}_{50}$ 为498.9 nM，展现出明显的靶向依赖性杀伤。
膜通透性依赖实验： 当分别连接膜通透性好的MMAE和不通透的MMAF时，基于传统内吞释放（Val-Cit连接子）的偶联物对细胞均有杀伤，而基于PhoPEx连接子的BTR偶联物仅在搭载MMAE时表现出细胞毒性，MMAF组则完全无效。这一结果直接印证了毒素释放发生于细胞外膜表面的推论。

4. 体内药代动力学、生物分布与毒性容忍度#

在小鼠肿瘤模型中，研究人员将FAP-BTR-SMDC与基于经典Val-Cit连接子的FAP-ITR-SMDC以及FAP靶向ADC（Sibrotuzumab-VC-MMAE，DAR约3.5）进行了定量对比：

肿瘤内暴露量： 在HT1080-FAP荷瘤小鼠中，静脉注射相同毒素摩尔当量的药物后，FAP-BTR-SMDC在肿瘤局部的MMAE药时曲线下面积（ $\text{AUC}_{0-120\text{h}}$ ）达到了FAP-ITR-SMDC的5.9倍，这一肿瘤暴露水平已经与大分子抗体偶联药物FAP-ITR-ADC相当。
脱靶释放与靶本比： 在血液和肝脏等正常组织中，FAP-BTR-SMDC的非特异性毒素释放水平显著低于对照组。其瘤/血比分别达到FAP-ITR-SMDC的14.7倍和FAP-ITR-ADC的3.6倍；其瘤/肝比则分别达到FAP-ITR-SMDC的55.1倍和FAP-ITR-ADC的58.7倍。
最大耐受剂量（MTD）： 在健康小鼠急性毒性试验中，以体重下降不超过20%为标准，FAP-BTR-SMDC的小鼠摩尔剂量MTD比FAP-ITR-SMDC提高了7.5倍，治疗安全窗口得到明显拓宽。

Fig.4 The BTR drug delivery system exhibits improved therapeutic profiles on FAP protein in CDX and PDX models.#

5. 动物模型中的抗肿瘤疗效#

在治疗实验中，FAP-BTR-SMDC在多个小鼠肿瘤模型中展示了抑瘤效果：

细胞系异种移植模型（CDX）： 在HT1080-FAP模型中，单次静脉注射6.2 mg/kg的FAP-BTR-SMDC，在30天观察期内实现了100%（8/8只）的小鼠肿瘤完全消退，小鼠体重保持平稳，生存率为100%。
肉瘤患者来源异种移植模型（PDX）： 在肿瘤细胞本身高表达FAP的肉瘤PDX模型中，以约15% MTD剂量的FAP-BTR-SMDC给药，其抑制肿瘤生长的效果优于对照组小分子偶联物，且略优于以约50% MTD剂量给药的FAP-ITR-ADC。
胰腺腺鳞癌患者来源异种移植模型（PASC PDX）： 在该模型中，FAP仅高表达于肿瘤间质的CAF细胞上，且伴有致密的间质纤维化屏障。大分子ADC由于穿透困难，疗效受限；而FAP-BTR-SMDC治疗组的终点肿瘤重量为 $0.19\pm0.07\,\text{g}$ ，明显低于ADC组的 $1.32\pm0.41\,\text{g}$ 。

Fig.5 Expand the BTR system to other clinically important targets.#

6. 策略的拓展性探索#

为了评估BTR策略是否仅能用于FAP这一个特殊靶点，作者进一步开展了拓展研究：

数据库统计支持： 检索PDBbind数据库中19,037个已知配体-蛋白共晶结构发现，94.4%（17,967个）的结构在配体结合位点周边10 Å范围内存在至少一个酪氨酸残基，这表明邻近释放机制具备较为广泛的结构基础。
PD-L1靶点的验证： 针对内吞效率同样较低的临床靶点PD-L1，研究团队基于已报道的环肽配体结构，在非关键结合位点（Leu位点）引入PhoPEx连接子构建偶联物。体外实验证实该分子能特异性结合PD-L1并释放毒素；在胃腺癌PDX模型中，PD-L1-BTR-SMDC同样展现出由于内吞对照组的抑瘤效果。
mRNA展示筛选兼容性： 研究人员还将PhoPEx非天然氨基酸引入环肽文库，体外模拟了通过mRNA展示技术直接高通量筛选BTR前药分子的可行流程。

适用范围的拓宽与面临的实际转化边界#

这项工作在偶联药物递送机制上给出了清晰的补充方案。它证明了无需依赖细胞内吞与溶酶体运输，仅利用受体结合界面的临近化学反应，同样可以在肿瘤组织实现高浓度、高选择性的有效载荷释放。

这一机制的直接价值在于能够重新激活一大批过去被判定为“不可成药”或“成药困难”的膜蛋白靶点。很多肿瘤表面标志物由于内吞极其缓慢，此前在ADC开发中被放弃；BTR策略将递送逻辑解绑于内吞之后，理论上只要靶蛋白口袋附近具备反应性亲核残基，且存在高亲和力的结合配体，就可以尝试开发对应的释放型偶联分子。此外，对于富含纤维化基质、大分子难以深入渗透的实体瘤（如胰腺癌），小分子偶联物结合间质释放扩散的模式，也展现出相对大分子抗体更好的组织分布潜力。

客观审视这项研究，目前该体系仍然存在几项明确的边界和需要进一步解决的工程问题：

第一，对有效载荷理化性质的依赖度较高。由于释放发生在细胞膜外表面，水溶性较高、无法穿透细胞膜的毒素（如MMAF）无法发挥作用。这意味着该系统必须绑定高膜通透性的毒素，而高脂溶性毒素在胞外释放后，若局部清除过快或发生血管渗漏，理论上可能带来潜在的外周毒性风险，后续需要对毒素的通透速率与肿瘤滞留特性做更精细的平衡设计。

第二，连接子设计的理性化门槛较高。BTR策略高度依赖高精度的结构生物学信息与构效关系推导。亲电中心与靶点亲核残基之间的距离、角度和柔性臂长度必须匹配得非常精确（如本研究中探索的4碳原子连接链）。如果缺乏高分辨率的靶点复合物晶体结构，仅凭盲筛开发BTR分子的难度会显著增加。

第三，小分子的体内清除速率与化学反应速率之间的博弈。尽管优化后的PhoPEx反应半衰期缩短到了3.5小时，但小分子配体在血液中的循环半衰期通常只有数十分钟至数小时。如何在配体从靶点解离之前尽可能完成更高比例的共价转化与释放，依然是决定最终给药剂量和疗效上限的关键因素。

第四，临床转化的距离。本研究的所有体内治疗数据均来自于免疫缺陷小鼠模型及PDX模型。人类患者体内复杂的免疫微环境、肿瘤血流灌注异质性以及人体正常组织中微量靶点分布带来的脱靶效应，仍需在后续正规的临床前毒理学和临床试验中进行系统检验。

综合来看，这项研究通过构建基于五价磷的邻近化学反应工具，在概念和实验层面打通了“结合即释放”的技术路径，为突破传统内吞依赖型偶联药物的靶点限制提供了一种逻辑自洽且证据扎实的新解法。

参考文献：Wen, Z., Xu, M., Yan, Z. et al. A binding-to-release strategy for targeted anticancer drug delivery. Nature (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10971-0