探针设计理念与作用机制#

肠切酶是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，能够专一性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK）氨基酸序列并进行切割。除了在生物制药中用于去除融合标签外，肠切酶在肠道中激活胰蛋白酶，进而诱导肿瘤细胞基质降解并促进肿瘤迁移。传统检测手段如凝胶电泳操作繁琐且通量较低，而现有的荧光探针依赖外部激发光，易受生物组织背景荧光干扰和光漂白影响，难以在活体动物体内实现精准定量。

生物发光成像无需外源激发光，具有极低的背景噪音和极高的信号对比度。如图1所示，研究团队将D-氨基荧光素（Luc）通过酰胺键连接至肠切酶特异性肽段DDDDK的C端，构建了生物发光探针DDDDK-Luc。在探针未被切割时，荧光素的游离氨基被笼蔽，生物发光信号处于关闭状态。当遇到肠切酶时，肽键被特异性水解，释放出游离的Luc。游离Luc在荧光素酶（fLuc）、三磷酸腺苷（ATP）、镁离子和氧气共同参与下发生酶促反应，释放出强烈的生物发光信号。

Fig.2 (a) BL spectra of 50 μM DDDDK-Luc before and after incubation with 50 U/L ENTK or coincubation with 50 U/L ENTK and 1 mg/mL soybean trypsin inhibitor (Inh.) in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h. (b) The fitted calibration curve of DDDDK-Luc BL intensity at 600 nm with ENTK concentration ranging from 0 to 50 U/L. (c) HPLC traces of DDDDK-Luc (black), Luc (green), 50 μM DDDDK-Luc incubated with 50 U/L ENTK in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h (red), and 50 μM DDDDK-Luc incubated with 50 U/L ENTK and 1 mg/mL soybean trypsin inhibitor (Inh.) in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h (blue). Wavelength for detection: 254 nm. (d) BL intensity of 50 μM DDDDK-Luc incubated with various substances: Na+ (1 mM), Ca2+ (1 mM), Mg2+ (1 mM), K+ (1 mM), Cys (1 mM), GSH (1 mM), H2O2 (1 mM), CTSB (1 U/mL), ALP (1 U/mL), CES (1 U/mL), TYR (10 U/mL), MMP-2 (10 U/mL), uPA (1 U/mL), or ENTK (50 U/L) in the presence of fLuc, Mg2+, and ATP. Emission: 600 nm.

体外性能评估与细胞水平成像#

在体外光谱实验中，如图2所示，50微摩尔浓度的DDDDK-Luc在无肠切酶存在时仅表现出微弱的基线信号。加入50 U/L肠切酶孵育一小时后，探针在600纳米处的生物发光强度迅速提升了59.7倍。当加入大豆胰蛋白酶抑制剂共孵育时，发光信号被显著抑制，证实了信号响应的酶特异性。高效液相色谱分析进一步证明，经过一小时酶切后有52.6%的探针转化为游离荧光素。

Fig.2 (a) BL spectra of 50 μM DDDDK-Luc before and after incubation with 50 U/L ENTK or coincubation with 50 U/L ENTK and 1 mg/mL soybean trypsin inhibitor (Inh.) in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h. (b) The fitted calibration curve of DDDDK-Luc BL intensity at 600 nm with ENTK concentration ranging from 0 to 50 U/L. (c) HPLC traces of DDDDK-Luc (black), Luc (green), 50 μM DDDDK-Luc incubated with 50 U/L ENTK in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h (red), and 50 μM DDDDK-Luc incubated with 50 U/L ENTK and 1 mg/mL soybean trypsin inhibitor (Inh.) in Tris-HCl buffer at 37 °C and pH 7.4 for 1 h (blue). Wavelength for detection: 254 nm. (d) BL intensity of 50 μM DDDDK-Luc incubated with various substances: Na+ (1 mM), Ca2+ (1 mM), Mg2+ (1 mM), K+ (1 mM), Cys (1 mM), GSH (1 mM), H2O2 (1 mM), CTSB (1 U/mL), ALP (1 U/mL), CES (1 U/mL), TYR (10 U/mL), MMP-2 (10 U/mL), uPA (1 U/mL), or ENTK (50 U/L) in the presence of fLuc, Mg2+, and ATP. Emission: 600 nm.

定量分析表明，探针的发光强度在0至50 U/L的肠切酶浓度范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数达0.999，计算所得的检测限低至5.58 U/L。干扰实验显示，即使面对高浓度的常见金属离子、还原性小分子及其他蛋白酶（如组织蛋白酶B、基质金属蛋白酶2等），探针均未产生明显的发光信号，显示出极佳的底物选择性。此外，研究团队将末端赖氨酸突变为丙氨酸制备了对照探针DDDDA-Luc，该突变探针与肠切酶反应后无任何发光信号与水解产物生成，从分子结构上证实了DDDDK序列对酶识别的不可替代性。

Fig.3 (a) Schematic illustration of the experimental procedure for imaging ENTK activity in living cells. (b) Time-course BL images of fLuc-transfected HeLa cells under the indicated conditions. (c) Quantified total flux (photon/sec) from the images in (b).

细胞实验进一步验证了探针的细胞相容性与成像能力。细胞毒性测试表明，探针在50微摩尔浓度下孵育24小时后，细胞存活率仍保持在90%以上。如图3所示，在转染了荧光素酶的高表达肠切酶HeLa细胞中，加入探针后生物发光信号随时间逐渐增强，并在80分钟时达到峰值。预先加入肠切酶抑制剂处理的细胞组，其整体发光强度降至对照组的35.7%（信号相差约2.8倍）。阴性对照实验排除了一步法抑制剂对发光反应体系本身的影响，确认了探针具备监控活细胞内源性肠切酶活性的实用价值。

Fig.4 (a) Time-course BL images of fLuc-transfected HeLa tumor-bearing mice after DDDDK-Luc injection, with or without Inh. pretreatment. (b) Quantified total BL flux from the images in (a).

活体肿瘤靶向成像及诊断潜力#

在成功完成细胞水平验证后，研究团队评估了探针在小动物体内的成像表现。研究人员建立荷载HeLa肿瘤的裸鼠模型，并通过尾静脉注射探针DDDDK-Luc。如图4所示，小鼠肿瘤区域迅速出现明显的发光信号，并在静脉注射后20分钟达到峰值。相比之下，瘤内预注射肠切酶抑制剂的小鼠组，其肿瘤区域发光强度大幅降低，两组之间的信号对比度达到了3.9倍。

Fig.4 (a) Time-course BL images of fLuc-transfected HeLa tumor-bearing mice after DDDDK-Luc injection, with or without Inh. pretreatment. (b) Quantified total BL flux from the images in (a).

离体组织分析显示，注射探针后，肿瘤组织中的发光强度显著高于心、肝、脾、肺、肾及血浆等样品。这一发现排除了外周器官裂解荧光素后通过血液循环富集至肿瘤的假象，证实探针主要是在肿瘤微环境中被高表达的肠切酶特异性切割激活。探针在活体复杂生理环境下的优异表现，为其在疾病诊断中的应用奠定了坚实基础。