核心主旨与成果概览#

本研究提出了一套用于快速构建高性能人工荧光蛋白的非共价“双钥匙锁”结合策略。研究团队设计并使用了一种具有特定结构的聚集诱导发光（AIE）荧光分子，通过将其与牛血清蛋白进行非共价组装，在极短时间内成功激活了极其强烈的荧光信号。该荧光蛋白复合物具有73.74%的高荧光量子产率，荧光强度相较于游离发光分子提升了12.62倍，且在强光持续照射90分钟后仍能保持出色的光稳定性。该策略在保留天然蛋白生物活性的同时，实现了高对比度的细胞成像与低毒性检测，为生物传感和成像领域提供了一个高效、通用的人工荧光蛋白构建平台。

研究背景与现实痛点#

荧光蛋白作为生物医学研究中不可或缺的光学报告探针，广泛应用于细胞成像、蛋白质动态追踪与生物标记检测。然而，传统的天然基因工程荧光蛋白必须经过复杂的发光基团成熟过程，这一过程高度依赖环境中的氧气浓度、温度和酸碱度，耗时可达数十分钟至数小时，且难以实现高剂量的大规模工业化生产。为了突破这一瓶颈，学术界尝试通过化学反应将外源荧光发光体与蛋白质连接。但传统的共价化学连接反应时间长、步骤繁琐，且容易破坏蛋白质原有的天然三维结构与生物活性；而现有的非共价结合策略往往对分子间相互作用机制缺乏系统深入的认识，导致构建出的荧光复合物发光效率低、稳定性差，难以满足高灵敏度检测的要求。因此，如何利用明确的分子间作用力，快速、无损且高效地构建出高亮度的荧光蛋白复合物，成为当前生物成像领域亟待解决的技术难题。

核心创新与设计逻辑#

针对上述难题，本研究受绿色荧光蛋白内部发光基团受限发光的启发，提出了“双钥匙锁”协同非共价结合机制。所谓的“双钥匙锁”策略，是指利用分子同时具备的氢键作用与疏水作用这两把“钥匙”，精准嵌入蛋白质的结合口袋（即“锁”）中。研究团队设计合成了名为TCBPE的AIE荧光分子，该分子拥有强疏水性的四苯乙烯中心骨架，同时外围修饰了四个能够提供氢键结合位点的羧基基团。

为了验证氢键与疏水协同作用的不可或缺性，研究团队设立了两组仅具备单一种类作用力的参考分子进行对比：一组是仅具有疏水性而无氢键位点的TPE分子，另一组是仅具备氢键位点但疏水骨架较小的TCPE分子。实验与密度泛函理论计算以及分子对接模拟表明，仅依赖单一作用力的分子无法在蛋白质结合口袋中形成稳定的限制。唯有TCBPE能够同时开启两重结合作用，与牛血清蛋白（BSA）表现出高达54.8 nM的极低解离常数（Kd），证明了两者之间存在极强的非共价结合亲和力，从而彻底限制了分子内部的旋转与振动，将无辐射耗散转变为高效率的荧光发射。

Fig.1 Elucidating the “Dual-Key Lock” mechanism through comparative studies of AIEgens. (A) Chemical structures and HOMO-LUMO distributions of TPE, TCPE, and TCBPE. (B) Fluorescence enhancement and (C) fluorescence brightness of BSA@TPE, BSA@TCBPE, and BSA@TCPE. (D–F) Molecular docking simulations of TPE, TCBPE, and TCPE with BSA, respectively, performed using AutoDock Vina. For each complex, the panels from left to right show: (i) The predicted binding pose of the ligand within the BSA structure; (ii) A detailed view of the interacting amino acid residues and the types of molecular forces; (iii) The electrostatic potential surface at the binding pocket, illustrating the complementary charge distribution around the docked ligand molecule. (G) Docking scores from 10 runs and (H) the highest docking scores between BSA and the three AIEgens. (I) Capillary electrophoresis of BSA, BSA@TPE, BSA@TCBPE, and BSA@TCPE.

实施过程与分子结合机制#

在构建实验中，研究人员将TCBPE的有机溶液与牛血清蛋白的缓冲溶液在室温下进行简单的混合孵育。得益于非共价作用的超快动力学，混合仅5分钟即可达到最高荧光强度的92%，大幅缩短了传统荧光蛋白的制备周期。在组装过程中，TCBPE分子的疏水核心驱动其深入蛋白质内部的非极性空腔，而外围的羧基则与口袋周围的氨基酸残基（如赖氨酸、谷氨酸等）形成稳固的氢键网络。

为了确证复合物的结合模式为非共价作用而非化学共价键，研究团队采用了毛细管电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行验证。结果显示复合物在电泳中的迁移行为与纯蛋白完全一致，质谱也未检测到共价加成物。此外，当向复合物溶液中加入蛋白变性剂十二烷基硫酸钠（SDS）或疏水竞争试剂 Triton X-100 时，复合物的荧光发生了浓度依赖性的猝灭，这进一步从反向实验中证实了该荧光蛋白是通过可逆的疏水与氢键非共价作用力维持其高发光状态的。

Fig.2 Protein-induced AIE activation and molecular binding insights. (A) Schematic of TCBPE and fluorescent proteins. Protein structures were obtained from UniProt. (B) Fluorescence brightness and (C) fluorescence enhancement factor of β-LG@TCBPE, OVA@TCBPE, and BSA@TCBPE FPs. (D) Fluorescence enhancement factors of TCBPE upon interaction with 13 different proteins (I: BSA, II: KLH, III: OVA, IV: β-LG, V: HSA, VI: Muramidase, VII: Gelatin, VIII: Fish Collagen, IX: Peanut protein, X: Zein, XI: Pea protein, XII: Rice protein, XIII: Lactalbumin) were calculated relative to the corresponding TCBPE-only controls under matched solvent conditions. (E–G) Molecular docking simulations of TCBPE with β-LG, OVA, and BSA, respectively, performed using AutoDock Vina. For each protein complex, the panels from left to right show: (i) The predicted binding pose of TCBPE within the protein structure; (ii) A detailed view of the interacting amino acid residues and the types of molecular forces; (iii) The electrostatic potential surface at the binding pocket, illustrating the complementary charge distribution around the docked TCBPE molecule. (H) Docking scores from 10 independent runs and (I) the highest docking scores between TCBPE and the three proteins. (J) Capillary electrophoresis analysis of β-LG, β-LG@TCBPE, OVA, OVA@TCBPE, BSA, and BSA@TCBPE.

实验结果与性能表征#

光物理性能测试表明，游离的TCBPE分子在水溶液中因激子的无辐射衰减几乎不发光，但在与牛血清蛋白组装形成BSA@TCBPE复合物后，荧光强度发生了剧烈的爆发式增长。相较于单钥匙参考组，BSA@TPE仅实现了1.13倍的荧光增强，BSA@TCPE仅实现了3.00倍的荧光增强，而BSA@TCBPE实现了高达12.62倍的荧光增强，且其绝对荧光亮度是TPE组的10.21倍、TCPE组的167.86倍。在绝对量子产率测试中，BSA@TCBPE达到了73.74%的极高荧光量子产率。

在光稳定性测试中，该复合物在功率密度为 2 W/cm² 的连续强光照射下维持了90分钟，荧光信号未发生明显衰减，展现出优异的抗光漂白能力。在细胞层面的生物学评价中，利用巨噬细胞（RAW 264.7）进行的高分辨率激光共聚焦显微成像显示，BSA@TCBPE能够快速进入细胞内部并产生高对比度的荧光信号；细胞毒性检测（CCK-8法）证实，在高达 10 μM 的浓度下孵育24小时后，细胞活力依然保持良好，表明该荧光蛋白具有极高的生物相容性。

Fig.3 Construction of fluorescent proteins via a “Dual-Key Lock” strategy and comprehensive characterization of the BSA@TCBPE. (A) Schematic illustration of the rapid, noncovalent assembly of fluorescent proteins driven by synergistic hydrophobic interactions and hydrogen bonding (the “Dual-Key Lock” mechanism). (B) Kinetic studies of BSA@TCBPE. (C) Normalized excitation and emission spectra of BSA@TCBPE and TCBPE in PBS. (D) Comparison of the absolute quantum yields and (E) fluorescence lifetimes of BSA@TCBPE and TCBPE. (F) Hydrodynamic size distributions and (G) ζ-potentials of BSA@TCBPE and native BSA. (H) Photostability of BSA@TCBPE under continuous 365 nm irradiation (2 W/cm2). (I) Fluorescence intensity stability of BSA@TCBPE over 7 days. (J) pH-dependent fluorescence stability of BSA@TCBPE; the inset shows photographs of the solutions at different pH values under UV light.

应用价值与通用性验证#

该项研究不仅阐明了AIE发光体与蛋白质相互作用的分子机制，更在实际应用层面展现出广阔的前景。由于采用了温和的非共价自组装方式，蛋白质的天然构象和生物活性得到了最大程度的保留，这使其能够直接作为功能性生物探针用于靶向检测与生物传感。

此外，研究团队将“双钥匙锁”策略推广至更多种类的蛋白质系统中，测试了包括卵清蛋白（OVA）、β-乳球蛋白（β-LG）、人血清白蛋白（HSA）、明胶、溶菌酶等在内的13种结构和功能各异的蛋白质。实验结果表明，所有测试的蛋白质均能与TCBPE发生不同程度的荧光激活响应，这直接验证了该协同机制在构建多样化人工荧光蛋白平台上的广泛通用性，为快速定制个性化生物光学探针开辟了全新的途径。

Fig.4 Biosensing and Bioimaging Applications of BSA@TCBPE. (A) Comparable binding affinity of natural and TCBPE-treated BSA toward anti-BSA mAb. ELISA measurements showed no significant difference in binding affinity (p > 0.05). (B) Schematic illustration of LFIA for detection of BSA@TCBPE. (C) Standard curve of T-line fluorescence intensity vs. BSA concentration. (D) Fluorescent photographs of LFIA in response to different concentrations of BSA@TCBPE (0–500 μg/mL). (E) Fluorescence imaging of BSA@TCBPE in RAW 264.7 cells (scale bar: 25 μm). (F) Fluorescence imaging of TCBPE in RAW 264.7 cells (scale bar: 25 μm). (G) Cell viability after 24 h incubation with BSA@TCBPE. (H, I) Photostability under continuous laser irradiation (scale bar: 10 μm). Integrated fluorescence intensities are shown in (H).

研究局限与未来展望#

尽管“双钥匙锁”策略展示出了显著的优势，但研究中仍存在一定的局限性。当前实验主要依赖于蛋白质天然存在的疏水结合口袋，不同蛋白质的口袋体积、形状及氨基酸序列差异较大，导致不同蛋白对TCBPE的荧光激活倍数存在不均一性。此外，对于缺乏深大疏水口袋的结构蛋白或小分子肽段，该策略的发光效率可能会受到一定限制。

作者提出，未来的研究方向将集中于利用计算机辅助分子设计对发光分子的空间构型与氢键位点进行精准微调，以实现对特定靶点蛋白的定向匹配。同时，可以通过蛋白质工程对目标蛋白进行定点突变，人工打造完美适配发光分子的专属结合口袋，进而开发出响应更快、发光更亮、特异性更强的新型荧光蛋白探针工具包。