研究背景与现实难题#

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, 简称 HCC）是一种恶性程度极高且发病隐蔽的肝脏肿瘤，极易发生侵袭与远端转移，这也使得传统的根治性手术切除面临巨大局限。在临床治疗中，传统全身化疗药物往往缺乏靶向性，会对人体正常组织造成不可逆的毒副作用。而在诊断与成像方面，传统超声技术难以察觉毫米级的早期微小病灶；计算机断层扫描（CT）与磁共振成像（MRI）等手段则高度依赖含重金属的造影剂，容易在体内产生累积性器官毒性，且这些影像技术仅能提供静态的解剖学结构，无法在诊疗过程中同步开展原位肿瘤治疗。传统的第一近红外区（NIR-I）荧光成像在组织穿透深度上受到严重限制，穿透极限通常不足3毫米，同时还伴随着强烈的组织散射与背景自发荧光干扰，无法满足深部肝脏肿瘤的精准可视化需求。

除了诊断手段的局限，实体肝癌内部特殊的微环境也给治疗带来了严峻挑战。肝细胞癌组织内部血管结构紊乱、供氧严重不足，极易形成持久的低氧（缺氧）微环境。传统的光动力治疗（PDT）主要依赖“II型机制”，该机制严重依赖组织内的分子氧来产生单线态氧。在严重缺氧的肿瘤内部，II型光动力疗法的活性氧（ROS）产生效率会急剧下降，导致疗效大打折扣。相比之下，“I型机制”的光敏剂能够通过电子转移途径生成超氧阴离子自由基和羟基自由基，这一过程对组织氧浓度的依赖程度极低，被认为是应对缺氧肿瘤微环境的理想方案。此外，羧酸酯酶（Carboxylesterase, 简称 CE）在肝细胞癌细胞中呈现出特异性高表达，而在正常肝细胞或其他类型的肿瘤细胞中表达量极低，是极具潜力的肝癌生物标志物。因此，设计一种能够精确识别CE酶、且兼具高穿透深度与缺氧耐受性的诊疗一体化探针成为了打破临床瓶颈的关键突破口。

Scheme.1 CE-Activated NIR-II Thioxanthene Probe with Amplified Type I ROS Generation and Elevated PCE for Enhanced Photoacoustic Imaging and Type I Phototherapy of Hepatocellular Carcinoma

探针分子设计与核心创新优势#

针对上述诊疗难题，研究团队设计并合成了一种具有半乳糖靶向性与羧酸酯酶 responsive 激活特性的水溶性近红外二区（NIR-II）硫杂蒽分子探针（命名为 SP）。探针在分子结构设计上实现了多重功能的精准集成：核心底物采用了具有优质I型光敏特性的近红外二区硫杂蒽荧光团（SOH），并在其侧链通过酯化反应连接了带有半乳糖（Galactose）修饰的亲水性聚乙二醇（PEG）链段。其中，半乳糖配体能够特异性识别肝细胞癌表面高表达的脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），赋予探针主动定位肿瘤的能力；亲水性PEG片段极大地提升了分子的水溶性；而连接核心荧光团与侧链的内酯键则作为羧酸酯酶的特异性切割位点。

Fig.1 (a) Absorption spectra of SP, SP incubated with CE, and SOH; (b) fluorescence spectra of SP, SP incubated with CE, and SOH (an excitation wavelength of 808 nm was adopted for all subsequent fluorescence measurements); (c) time-dependent absorption spectra of SP (10 μM) incubated with CE (1 U/mL) over 0–90 min; (d) time-dependent absorbance enhancement at 808 nm extracted from panel c; (e) time-dependent fluorescence spectra of SP (10 μM) incubated with CE (1 U/mL) over 0–90 min; (f) time-dependent fluorescence intensity enhancement extracted from panel e; (g) absorption spectra of SP (10 μM) incubated with varying concentrations of CE (0–10 U/mL) for 90 min; (h) concentration-dependent absorbance enhancement at 808 nm extracted from panel g; (i) fluorescence spectra of SP (10 μM) incubated with varying concentrations of CE (0–10 U/mL) for 90 min; (j) curve between fluorescence intensity and CE concentration derived from panel i; time-dependent absorption spectra of SP (10 μM) incubated with CE (1 U/mL) at pH values ranging from 2 to 12 for (k) 0 min, (l) 30 min, and (m) 90 min; (n) fluorescence spectra of SP (10 μM) incubated with CE (1 U/mL) at pH values ranging from 2 to 12 for 90 min; (o) absorption spectra and (p) fluorescence spectra of SP (10 μM) after 90 min of incubation with various interfering substances: 1. SP only; 2. GSH; 3. Cys; 4. 1O2; 5. O2•–; 6. •OH; 7. H2O2; 8. Leucine; 9. Proline; 10. Methionine; 11. Lysine; 12. Tryptophan; 13. Aminopeptidase; 14. Tyrosinase; 15. γ-Glutamyltransferase; 16. Nitroreductase; 17. β-Galactosidase; 18. AChE; 19. BChE; 20. Glucose oxidase; 21. CE. 2–14<100> μM; 15–21<1> U/mL.

在创新机制方面，研究团队引入了“酯键屏蔽与酶促解锁”的智能响应策略。在未接触肝癌细胞之前，处于游离状态的探针SP因亲水侧链的存在，内部的分子内电荷转移（ICT）通道被封闭，光声信号、活性氧产生能力以及光热效应均处于“静默”的被动关闭状态。这种设计确保了探针在循环系统中不会产生毒副作用或背景噪声。唯有当探针主动靶向进入CE高表达的肝癌细胞内部时，过量的羧酸酯酶才会特异性剪断酯键，释放出具有强大光物理活性的母体荧光团SOH，从而彻底解锁全部诊疗功能。这种设计从根本上规避了传统探针对正常组织的非特异性损伤，实现了诊疗过程的高选择性与高安全性。

Fig.2 TEM images of SP after incubation with CE for (a) 0 min, (b) 30 min, (c) 60 min, and (d) 90 min. Under irradiation with an 808 nm laser at a power density of 0.8 W·cm–2: (e) 1O2 production from SP and CE-treated SP; (f) O2•– generation from SP and CE-treated SP; (g) •OH production from SP and CE-treated SP; (h) total ROS generation from SP and CE-treated SP; (i) photothermal performance of SP at varying concentrations; (j) photothermal performance of CE-incubated SP at varying concentrations; (k) photothermal behavior of SP under different laser power densities; (l) photothermal behavior of CE-incubated SP under different laser power densities; (m) photothermal stability of SP; (n) photothermal stability of CE-incubated SP; (o) calculation of the PCE of SP; (p) calculation of the PCE of CE-incubated SP.

酶促激活过程与作用机制解析#

为了厘清探针在生物体内的化学转化与物理响应过程，研究团队在分子级与超微结构层面开展了深入的作用机制探究。在体外光谱表征中，未被激活的探针SP在808纳米处的吸收与荧光信号均极弱。在加入羧酸酯酶孵育后，体系的吸收光谱与荧光光谱迅速发生明显红移与强度的剧烈攀升，其光谱特征与母体分子SOH完全重合，最高发射峰值锁定在937纳米的NIR-II区域。质谱分析准确捕获到了酶解后生成的SOH分子量质荷比，证实了CE酶对酯键的专一性切割能力。动力学测试表明，探针的响应过程呈现典型的酶催化饱和曲线，在0至10 U/mL的CE浓度范围内，探针的光学信号呈良好的线性剂量依赖关系，对羧酸酯酶的最低检测限（LOD）分别达到0.032 U/mL（基于吸收光谱）和0.022 U/mL（基于荧光光谱）。在抗干扰实验中，探针面对活性氧、生物硫醇、各种氨基酸及其他共存同工酶等20余种潜在生物干扰物时均保持高度静默，仅对羧酸酯酶产生剧烈响应，展现出卓越的化学选择性。

微观结构的演变进一步印证了这一激活过程。透射电子显微镜（TEM）与动态光散射（DLS）结果显示，未激活的SP探针因长链PEG的存在呈较无序的胶束状聚集，初始平均粒径约108纳米；经过羧酸酯酶孵育90分钟后，随着带负电荷的侧链脱落，聚集体持续收缩，平均粒径缩小至52纳米，表面Zeta电位由-7.6 mV转变为+3.5 mV。这种粒径的显著减小与正电荷的显露，极大地增强了释放产物SOH对细胞内线粒体的靶向亲和力。

量子化学计算与分子动力学模拟为该激活机制提供了坚实的理论支撑。密度泛函理论（DFT）计算表明，CE酶解切断侧链后，成功解锁了SOH分子的分子内电荷转移（ICT）通道，使分子的系际跨越（ISC）速率大幅提升了141倍。系际跨越速率的飞跃极大地促进了激发态电子向三重态的转移，从而主导了以电子转移为核心的I型ROS生成路径，完美契合了肿瘤缺氧环境下的光动力治疗需求。

Fig.3 (a) Overall molecular docking conformation of SP and CE; (b) local binding pose from molecular docking of SP and CE; (c) intermolecular bonding analysis of the docked complex; (d) HOMO and LUMO orbitals of SOH; (e) HOMO and LUMO orbitals of SP; (f) dihedral angle of the optimized conformation of SOH; (g) dihedral angle of the optimized conformation of SP; (h) jablonski energy level diagram of SOH; (i) jablonski energy level diagram of SP; (j) CV curves of SP and CE-incubated SP; (k) degradation profiles of NADH in the presence of CE, SP, and CE-incubated SP, respectively; (l) degradation profiles of SP and CE-incubated SP with and without NADH; (m) schematic illustration for type I ROS generation by CE-activated SP.

核心实验数据与诊断治疗表现#

在光物理与光热转换特性的量化评估中，激活后的探针展示出令人瞩目的性能提升。在808纳米激光照射下，未经CE激活的SP探针ROS生成能力微弱；而在经CE激活后，超氧阴离子自由基（O₂⁻•）、羟基自由基（•OH）以及总活性氧的生成效率分别爆发式增长了5.2倍、4.5倍和4.8倍，且体系完全不产生依赖氧气的单线态氧（¹O₂），确证了其绝对的I型光反应机制。在光热性能方面，激活后的体系随探针浓度和激光功率密度的增加表现出剧烈的升温效应，且经历多次激光开/关循环后升温曲线未见衰减，展现出极佳的光热稳定性。经冷却曲线拟合计算，探针SP激活前的光热转换效率（PCE）仅为33.5%，而在羧酸酯酶作用下，其光热转换效率跃升至54.6%，实现了光能向热能的高效转化。

Fig.4 (a) Production of 1O2, O2•–, •OH and total ROS in HepG2 cells after various treatments; (b) dark cytotoxicity of SP and SP + BNPP against HepG2 cells; (c) phototoxicity of SP and SP + BNPP toward HepG2 cells under laser irradiation (*** p < 0.001); (d) visualization of the viability status of HepG2 cells with different treatments via AM/PI co-staining; (e) fluorescence imaging of 4T1, HeLa, MCF-7 and HepG2 cells incubated with SP or SP + BNPP; (f) dark cytotoxicity and phototoxicity of SP toward 4T1, HeLa and MCF-7 cells; (g) endogenous CE expression levels in 4T1, HeLa, MCF-7 and HepG2 cells.

细胞实验与动物体内诊疗结果高度验证了探针的临床应用潜能。在细胞层面的特异性毒性测试中，SP探针能够被高表达CE的肝癌细胞（HepG2）特异性摄取并激活，在激光照射下诱导线粒体膜电位丧失，引发强烈的细胞凋亡；而在CE低表达的乳腺癌（4T1、MCF-7）及宫颈癌（HeLa）细胞中，探针几乎不表现出任何荧光激活与细胞毒性。在荷瘤小鼠的体实验中，静脉注射SP探针后，肿瘤区域的近红外二区光声（PA）成像信号随时间推移显著增强，展现出深层组织的高分辨率成像能力。在随后的协同光疗实验中，在808纳米激光照射下，SP探针组小鼠的肝肿瘤生长受到了极其显著的抑制甚至消退，小鼠主要脏器未见任何病理损伤，表现出优异的生物相容性与精准治疗效果。

Fig.5 (a) PA images of SP (10 μM) incubated with varying concentrations of CE in the presence or absence of BNPP; (b) quantitative PA signal intensities extracted from the PA images in panel a; (c) time-dependent PA signal intensities at tumor sites after intravenous injection of SP, with or without intratumoral pre-injection of BNPP; (d) time-series whole-body PA images of mice after intravenous injection of SP, with or without intratumoral pre-injection of BNPP. Fig.6 (a) Infrared thermal images of mice and corresponding temperature variation curves of tumor regions during laser treatment; (b) tumor volume growth curves of mice in all groups within the 14-day treatment period (**** p < 0.0001); (c) digital photographs of dissected tumors from each group after treatment completion; (d) statistical tumor weights of all groups at the end of treatment (**** p < 0.0001); (e) histological tumor sections stained with H&E, TUNEL and Ki67 from each group after treatment.

研究总结与未来拓展空间#

本项研究成功构建了一种集近红外二区光声成像、高光热转换效率以及缺氧耐受型I型光动力治疗于一体的智能激活型分子探针。该探针通过“半乳糖-ASGPR”主动靶向与“羧酸酯酶特异性激活”的双重保险机制，成功克服了传统光疗手段在肝细胞癌诊疗中遇到的肿瘤选择性差、组织穿透深度不足以及缺氧微环境中疗效受限等多重瓶颈，为深部实体肿瘤的非侵入性精准诊疗提供了高性能的分子工具。

尽管该探针展现出巨大的应用价值，但研究仍存在一定的优化空间。在临床转化层面，探针分子中PEG-半乳糖侧链的高分子多分散性可能对药代动力学的批次间一致性提出挑战，未来的研究方向可着眼于进一步精简和标准化侧链化学结构。此外，尽管体外与小动物模型验证了探针优秀的生物安全性，但探针在大型动物体内的长期代谢路径、器官蓄积效应以及免疫原性仍需补充更长周期的毒理学评估，以推动该类近红外二区诊疗一体化分子向临床应用的实质性迈进。