近红外二区成像与染料合成的现实困境#

在生物医学成像领域，第二近红外窗口（波长介于900纳米至1700纳米之间的光信号区）荧光成像技术正引发一场深层变革。相较于传统可见光或近红外一区成像，该波段的荧光具备组织穿透深度大、背景组织自发荧光干扰小以及图像分辨率高等显著优势，在活体微血管显影、肿瘤精准手术导航及药物靶向筛选中展现出巨大的应用价值。在众多有机荧光探针中，聚甲川染料（例如已获得临床批准的吲哚氰绿）因其主链光学可调性强、结构改性灵活，成为近红外二区成像的核心分子载体。然而，为了深刻理解染料分子化学结构与其光学物理性能之间的内在规律，并精准开发出高性能荧光探针，构建包含丰富结构多样性的聚甲川染料分子库显得至关重要。

长期以来，近红外二区聚甲川染料库的构建面临着严重的合成瓶颈。传统研究多采用单一变量策略，仅在对称染料的末端基团或连接链上进行微调，合成出的染料分子结构过于单一。而在光谱调控和功能拓展上更具优势的不对称聚甲川染料，则因传统逐步合成路线过于繁琐而极难获取。在常规逐步法中，第一步缩合生成的中间体必须经过复杂的分离与纯化过程才能用于下一步反应，这不仅耗时费力，还会因为中间体稳定性差及多步纯化损耗导致整体产率极其低下，部分关键不对称分子的合成产率甚至不足10%。合成路径的阻塞使得不对称聚甲川染料的光学表征数据严重匮乏，导致现有的“结构-性能”构效关系模型存在明显缺陷，难以有效指导新型荧光探针的理性设计。

Fig.1 Synthetic strategies of NIR-II polymethine dyes and combinatorial library construction. (a) The synthesis of polymethine dye SZ-m1m2n via condensation of two building blocks (S-m1, S-m2) with a linker (Z-n). The tandem one-pot strategy modulates the conditions of the first condensation step to achieve efficient generation of the intermediate (int.) while suppressing its further reaction; subsequently, without isolation, the reaction conditions are adjusted to activate the int. and promote its further conversion to the target dye. (b) The schematic illustration of the combinatorial process for dye library construction using a single linker (Z-a). In this case, m building blocks can generate polymethine dyes. When n types of linkers are available, the total number of combinable dyes becomes . (c) The building blocks (S-m) used for polymethine dyes synthesis, including indocyanine-based S-1, rhodamine-based S-2, and thiapyrylium-based S-3. (d) The chemical structures of three representative linkers (Z-n). Combining three building blocks and three linkers yields a total of 18 molecular dyes.

串联一步法：打破不对称染料合成的效率瓶颈#

为了解决不对称聚甲川染料合成困难、产率低下及杂质繁多的核心难题，本项研究成功开发出一种温和高效的串联一锅法合成策略。该方法巧妙利用了反应中间体与链接体在化学反应活性上的差异，通过对反应体系环境的精准调控，实现了“不需分离纯化中间体”即可连续完成两步缩合反应的高效合成过程。

以代表性不对称聚甲川染料分子SZ-12b的合成为例，研究人员将反应分为两个阶段进行精确控制。在第一阶段的缩合反应中，反应物在酸酐体系中生成活性极高的醛类衍生物，并与第一个构建模块高效反应生成关键的烯胺酯中间体。此时由于体系中不存在碱性催化剂，该中间体在酸酐环境中呈现动力学惰性，不会继续发生自我缩合或过度反应，从而完全避免了对称性杂质的生成。在第二阶段中，研究人员无需对该中间体进行萃取或柱层析纯化，只需直接向原反应容器中加入第二个构建模块并补充乙酸钠催化剂，乙酸钠即可瞬间激活中间体脱去保护基团生成新的末端醛类物质，并在室温条件下快速与第二个构建模块完成第二次缩合，以高选择性生成目标不对称染料。反应全程监控显示，这种方法大幅减少了副产物的种类，使SZ-12b的合成产率直接提升至81%。

为进一步验证该串联一锅法策略的普适性与优越性，研究人员将其应用于文献中既往采用传统逐步法合成且产率极低的两款经典不对称近红外二区染料Rh 1029与SHQ-6。实验结果表明，采用新策略后，中间体均能在第一阶段高效高选择性生成，引入催化剂后又能快速转化为目标产物，最终将Rh 1029的合成产率由传统方法的约10%大幅提升至75%，并将SHQ-6的整体产率由文献报道的11.5%显着提升至67%，极大简化了后续粗产品的纯化工序。

Fig.2 Tandem one-pot synthesis of polymethine dyes. (a) Synthetic route to a representative asymmetric polymethine dye, SZ-12b, using tandem one-pot synthesis strategy. (b) Liquid chromatogram analysis of the reaction mixtures under different conditions: the intermediate mixture after the first condensation step (1); the mixture following the tandem reaction process (2); and the mixture from the conventional one-pot synthesis (3). (c) The corresponding high-resolution mass spectrometry analysis. (d) Reaction mechanism for SZ-12b. Using acetic anhydride as the solvent, the linker Z-b is first converted to the highly reactive aldehyde derivative 2, which condenses with the building block S-2 to form a relatively stable intermediate 3. This intermediate 3 is then activated by sodium acetate to generate a new aldehyde derivative 5, enabling its reaction with the second building block S-1 to efficiently yield the target dye.

模块化组合与18种结构多样化染料库的构建#

基于突破性的串联一锅法合成路线，研究团队结合组合化学的模块化拼接思想，开展了聚甲川染料库的系统性构建。聚甲川染料本质上由两个末端构建模块与一个中央共轭连接链三部分组装而成，这种三元组合架构天生契合组合化学的反应逻辑。只要提供一定数量的末端结构与连接链，就能通过数学组合公式实现分子库的呈倍数快速扩增。

作为概念验证，本研究精选了三种兼具代表性与功能拓展潜力的末端构建模块，包括吲哚氰类结构模块S-1、罗丹明衍生物模块S-2以及硫杂吡喃类结构模块S-3；同时搭配了三种具有不同共轭链长度与环状位阻结构的中央共轭连接链Z-a、Z-b与Z-c。通过将这三类末端模块与三类连接链进行系统性的交叉组合，研究人员一举合成了包含9种对称结构与9种不对称结构在内的共18种结构各异的聚甲川染料（命名为SZ系列染料）。在串联一步法策略的保障下，这18种分子的合成产率均保持在31%至90%的高水平区间，成功构建出目前涵盖结构最丰富、对称与不对称兼备的近红外二区聚甲川染料库。

Fig.3 Molecular structures of 18 polymethine dyes in this dye library. The respective maximum absorption peaks/emission peaks of these dyes in acetone are labeled.

结构与光物理性能规律的深层拆解#

在建成的18种染料库基础上，研究团队对其光物理性质进行了全面测定与密度泛函理论计算，首次揭示了决定近红外二区聚甲川染料吸收、发光及弛豫路径的底层构效关系。测定数据显示，该染料库的光学响应范围覆盖了极宽的光谱窗口，其最大吸收峰波长横跨685纳米至1079纳米，最大荧光发射峰波长延伸至707纳米至1326纳米。

为理清复杂的结构与性能联系，研究团队借助理论计算明确提出了调控聚甲川染料光物理特性的两个核心定量物理指标：分子平面度参数（MPP）与激发态相较于基态的偶极矩变化量（$\Delta\mu$）。

分子平面度参数用于量化染料分子主链的共平面程度。计算表明，主链平面度极佳（即平面度参数数值较低）的染料分子能够维持较长且连续的有效电子共轭，表现出较高的辐射跃迁概率，因而具备极高的摩尔消光系数与荧光量子产率。相反，若分子结构内部存在剧烈的空间扭曲，例如对称染料SZ-22c因中央环己烯基团引入了强烈的空间位阻，其分子平面度参数高达1.514埃，这种显著的结构扭曲导致电子与空穴发生空间分离，非辐射跃迁剧烈增加，使其呈现出高达383纳米的超大斯托克斯位移，但荧光量子产率骤降至0.002%，荧光亮度极低。

偶极矩变化量则精准反映了分子在吸收光子跃迁至激发态后内部电荷的重新分布幅度。对于结构高度对称的聚甲川染料，激发过程中的电荷迁移极小，偶极矩变化量较低，因此吸收与发射光谱峰形狭窄且对称，荧光发射效率高。而对于不对称聚甲川染料，末端基团推拉电子能力的差异导致其激发态偶极矩变化量显著增大，分子表现出更强溶剂致变色效应与更大的斯托克斯位移。特别地，采用具备扩展共轭体系的硫杂吡喃末端模块S-3构建的SZ-33系列染料，将荧光发射峰成功推至1118纳米、1265纳米与1326纳米的深近红外二区区域，为深层组织成像提供了优秀的光学载体。

Fig.4 Structure-property relationships of asymmetrical polymethine dyes. (a) Absorption and (b) fluorescence spectra of the SZ-12 series dyes in acetone. (c) The optimized S0 geometries, molecular planarity, and excited-state analyses for SZ-12 series dyes. (d) Absorption and (e) fluorescence spectra of SZ-13 series dyes in acetone. (f) The optimized S0 geometries, molecular planarity, and excited-state analyses for SZ-13 series dyes. (g) Absorption and (h) fluorescence spectra of SZ-23 series dyes in acetone. (i) The optimized S0 geometries, molecular planarity, and excited-state analyses for SZ-23 series dyes. Structure-property relationship of (j) ε, (k) QY, (l) fluorescent brightness, and (m) Stokes shift versus MPP and Δμ. Due to the orders-of-magnitude differences in QY and fluorescent brightness among the dyes, the QY and fluorescent brightness values are plotted on a logarithmic scale. The area of the circle is proportional to the respective parameter value. The numbers in the j-m correspond to the dyes listed in Table 1. The symbols + and – represent a positive or negative effect of MPP or Δμ on the optical properties, respectively.

活体多通道成像应用与临床转化潜力#

建立完善的染料库不仅为理论研究提供了构效模型，更在实际生物医学应用中展现出强大的筛选适配能力。在活体荧光成像中，实现多靶点、多器官的同时无干扰成像一直是临床诊断的难点，这要求所选用的多个荧光探针在吸收与发射光谱上高度匹配、互不重叠，以最大程度消除信号串扰。

基于本研究建立的染料库及其精细的光物理参数数据库，研究人员通过快速筛选，成功挑选出组分光谱高度匹配的荧光探针组合，搭建起一个四通道活体荧光成像平台。在小鼠活体实验中，研究团队将筛选出的不同波段染料分别对小鼠的不同生理结构进行特异性标记，成功实现了对小鼠血管系统、淋巴结、肠道以及腹膜粘膜四个不同器官与组织的实时、同步高对比度显影。成像过程中各通道间荧光信号交叉干扰极小，清晰呈现了复杂生理结构的外观形态与解剖细节，有力证明了该染料库在多靶点精准诊疗与术中导航领域的实际应用价值。

Fig.5 Multiplexed imaging using dyes from the dye library. (a) The absorption and fluorescence spectra for four-channel fluorescence imaging. (b) The multicolor imaging with SZ-11a NPs (10 μg/mL), SZ-12a NPs (10 μg/mL), SZ-12b NPs (10 μg/mL) and SZ-22b NPs (25 μg/mL) under different excitations and imaging channels. (c) The normalized fluorescence intensities plotted over the distance in b. (d) Dosing timeline for multicolor imaging of mice. The SZ-11a NPs, SZ-12a NPs, SZ-12b NPs, and SZ-22b NPs were separately administrated via oral gavage, intraperitoneal injection, plantar administration, and intravenous injection. (e) Representative single images from four-color imaging channels and merge image of the mouse. Imaging sets are as follows: Ch1, Ex. 660 nm, 700–800 nm; Ch2, Ex. 808 nm, 900–1000 nm; Ch3, Ex. 915 nm, 1000–1100 nm; Ch4, Ex.1064 nm, 1300 nm LP. (f) Representative single images and merge image of a localized region in the mouse. (g) Plotted intensity for the four-color imaging channels in f.

研究局限与未来展望#

尽管本研究在合成策略创新、染料库构建及活体成像应用方面取得了突破性进展，但从全面客观的角度审视，该项研究仍存在一定的局限性。首先，在合成适用性方面，虽然串联一步法大幅提升了反应产率，但对于部分热稳定性较差或空间位阻极大的特异性不对称分子（如SHQ-6），如果在第二步缩合过程中过度提高反应温度，依然会引发部分分子降解，因此对反应温度和时间的精准控制要求极高。其次，部分高度扭曲或柔性较强的染料分子在水相生理环境中的荧光量子产率和荧光亮度仍有待提升，在实际生物体内应用时常需要依赖纳米载体进行增溶与包裹。

展望未来，本研究开发的串联一锅法合成路线为高难度的不对称荧光分子的工业化与规模化制备开辟了新途径。同时，研究所确立的分子平面度参数与偶极矩变化量双指标构效关系模型，为后续人工智能辅助设计新型高亮近红外二区荧光分子提供了坚实的理论计算依据。未来通过进一步拓展末端构建模块的化学多样性，并将分子库筛选与靶向配体修饰相结合，该平台有望产出更多具备高特异性与高亮度的临床级近红外二区成像探针，推动分子影像学在重大疾病早期诊断中的临床转化。