光动力疗法的两道墙：穿透深度与缺氧#

光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）依靠光敏剂在光照下产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）来杀死癌细胞。它的临床推广一直受两个因素制约。一是光在组织中的穿透深度有限，可见光或近红外光在几厘米厚的组织后就会严重衰减，深部肿瘤难以被有效照射。二是肿瘤缺氧。多数光敏剂走的是II型光化学路径，依赖氧气生成单线态氧（¹O₂），而实体瘤内部血管紊乱、耗氧旺盛，氧气本就稀缺；PDT过程本身还会进一步消耗氧气，让缺氧更严重，疗效随之下降。

X射线能穿透几十厘米的组织，理论上可以解决深度问题。但X射线本身不选择性杀伤，需要借助闪烁体或光敏剂把辐射能量转化为ROS。近年发展的X射线诱导光动力疗法（X-PDT）在深度上确有优势，却仍然绕不开缺氧限制，而且缺少一种能在照射结束后持续报告治疗状态的手段。余辉成像可以避开组织自发荧光，提供高信噪比信号，但现有余辉体系大多依赖多组分级联，能量传递效率低，且余辉激发和治疗激活仍以可见/近红外光为主，深度瓶颈依旧。

这篇发表于JACS的工作试图用一个分子平台同时回应上述问题：把X射线吸收、I/II型ROS生成、余辉发射和自维持化学能循环整合进同一个分子骨架，并在此基础上设计分次照射方案，在等总剂量下获得更高的累积ROS和更好的抑瘤效果。

把一个光敏剂、一个余辉底物和一个能量中继压进同一分子#

研究团队设计的分子叫TBR，核心是聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission, AIE）活性的三苯胺衍生含硫杂环，末端带对二甲氨基苯乙烯基，整体呈给体-π-给体-π-受体（D-π-D-π-A）构型。与常见的D-π-A结构相比，多插入一个D-π单元带来三个效果。

第一，X射线照射下分子内电荷分离更充分，I型（•OH、O₂•⁻）和II型（¹O₂）ROS都能产生，其中I型路径不依赖氧气，在严重缺氧下仍保持活性。第二，扩展的π共轭体系可以作为ROS的化学陷阱，生成[2+2]环加成产物——1,2-二氧杂环丁烷型环状过氧化物中间体（TBR-OO）。这个中间体在暗处自发分解，释放储存的化学能，重新激发邻近的TBR分子，通过化学引发电子交换发光（Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence, CIEEL）机制维持ROS产生和近红外余辉。第三，AIE特性让余辉在水相环境中更强，适合成像引导的长时程治疗。

理论计算给出几个关键参数：TBR的HOMO-LUMO能隙为1.01 eV，单-三重态能隙（ΔE_ST）仅0.08 eV，系间窜越（Intersystem Crossing, ISC）速率达4.34×10⁹ s⁻¹，三重态寿命6691 ns。相比对照分子T（ΔE_ST 0.261 eV，ISC速率2.39×10⁹ s⁻¹，三重态寿命1708 ns），TBR的ISC更快、三重态布居更高，为高效ROS生成提供了物理基础。飞秒瞬态吸收光谱显示，TBR-NPs在光激发后1.87 ps内发生构象转变，24.37 ps内继续结构弛豫，230.29 ps完成ISC，与计算结果一致。

Scheme 1. Schematic Illustration of the Molecular Design and the Mechanisms of Afterglow Luminescence and ROS Generation

I型ROS如何在缺氧下保持效力#

ROS种类鉴定用了多种探针和电子自旋共振（ESR）。ABDA探针显示TBR-NPs在X射线照射下产生¹O₂，但效率低于T型纳米颗粒；DHR 123探针显示O₂•⁻生成效率TBR-NPs最高；HPF探针显示•OH生成TBR-NPs最强，且在常氧和缺氧条件下信号相当。ESR用TEMP捕获¹O₂、DMPO捕获O₂•⁻和•OH，均确认了相应信号，且信号强度随X射线剂量增加。

能带分析进一步支持I型机制：TBR-NPs的导带底为−0.47 V（vs NHE），比O₂/O₂•⁻的氧化还原电位（−0.33 V）更负，价带顶为+1.14 V，比O₂/H₂O₂的电位（+0.68 V）更正。这意味着X射线激发后，TBR可以高效还原O₂生成O₂•⁻，后者进一步参与歧化、Fenton和Haber-Weiss反应生成高细胞毒性的•OH。

更直接的证据来自生物分子氧化实验。NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）是细胞 redox 代谢的核心辅因子，TBR-NPs在X射线照射下诱导NADH吸收剂量依赖性下降，缺氧条件下同样如此；而单独X射线照射几乎不改变NADH。Hemin（氯化血红素）也被TBR-NPs氧化，常氧缺氧下均有效。凝胶电泳显示，TBR-NPs加X射线导致双链DNA和蛋白质（BSA）明显降解，单独X射线组则无明显变化。这些结果说明，TBR-NPs的氧化杀伤不依赖氧气浓度，具备放射增敏的潜力。

Figure 1. Characterization and X-ray-triggered ROS generation of TBR-NPs.

Fig.2 X-ray-induced biomolecular oxidation and energy band characterization of TBR-NPs.

自维持循环：余辉持续10分钟以上，ROS在暗处继续产生#

TBR-NPs在X射线照射后呈现持续余辉，肉眼可观测超过10分钟。余辉强度随纳米颗粒浓度和X射线剂量增加而增强。机制上，X射线产生的ROS与TBR分子中的共轭双键发生环加成，形成TBR-OO。高效液相色谱（HPLC）在照射后出现两个新峰，高分辨质谱（HR-MS）确认它们分别是环状过氧化物TBR-OO（质量增加1.55）和醛类衍生物TBA（质量增加5.69）。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在1768 cm⁻¹出现C=O伸缩振动，¹H核磁共振（NMR）在约10 ppm出现醛基质子信号，都支持O-O键断裂后生成醛基产物。

TBR-OO在暗处自发分解，释放化学能，激发邻近TBR分子，产生余辉和持续ROS。用DCFH（通用ROS探针）检测发现，X射线照射后避光孵育，DCFH荧光随时间持续增强，证明照射停止后ROS仍在产生。DHR123和HPF也分别证实O₂•⁻和•OH在暗处持续生成。清除剂实验显示¹O₂和O₂•⁻是余辉的主要驱动者，•OH贡献较小。经过六轮X射线“开-关”循环，余辉峰值强度没有明显衰减，说明TBR-NPs可反复充电，光漂白很低。

Fig.3 Mechanistic study of the excited-state dynamics and triplet-state formation of TBR-NPs.

分次照射比连续照射产生更多ROS，缺氧下抑瘤更有效#

基于自维持循环，作者设计了一种分次X-PDT方案：把总剂量拆成多次照射，每次之间留暗间隔，利用暗间隔中化学能驱动的持续ROS生成来累积更多毒性物质。在溶液水平，5次2 Gy照射（间隔2分钟）产生的DCFH荧光累积量约为单次10 Gy连续照射的1.7倍。在4T1细胞中，分次照射（5×2 Gy，间隔20分钟）比连续10 Gy产生更强的DHE（O₂•⁻探针）和HPF（•OH探针）荧光，且缺氧（2% O₂）与常氧（21% O₂）下信号相当，说明I型路径在低氧下仍然有效。γ-H2AX免疫荧光显示分次照射导致更严重的DNA双链断裂，缺氧下同样明显。

细胞毒性方面，常氧下TBR-NPs加连续X射线的IC50为41 μg/mL，缺氧下为46 μg/mL，差距不大；而分次照射在缺氧下的IC50降至28 μg/mL，显著优于连续照射的46 μg/mL。这说明在等总剂量下，分次策略通过持续ROS生成增强了缺氧癌细胞的杀伤。

Fig.4 Chemical energy-driven afterglow mechanism and sustained ROS generation of TBR-NPs.

从细胞到小鼠：SBR>120与95.8%抑瘤率#

体内成像使用了TBR的肿瘤微环境响应衍生物BTBR。BTBR在TBR的调控位点引入苯硼酸酯笼蔽基团，抑制分子内电荷转移，使余辉和ROS生成处于“关闭”状态；肿瘤高表达的H₂O₂可选择性切除硼酸酯，释放活性TBR，恢复余辉和ROS。BTBR-NPs在H₂O₂存在下余辉增强5.4倍，检测限低至10 μM，对Na⁺、Mg²⁺、K⁺、•OH、ClO⁻、O₂•⁻等常见干扰物响应很低。

组织穿透实验用鸡胸肉切片覆盖TBR-NPs溶液。光诱导余辉在1 cm组织后几乎不可检测，信号强度仅0.94×10⁶ photons s⁻¹ cm⁻² sr⁻¹；X射线诱导余辉在1 cm组织后约3.19×10⁶ photons s⁻¹ cm⁻² sr⁻¹，在10 cm组织后仍可检测，信号约为无组织时的5.1倍。ROS生成方面，1 cm组织后X射线诱导的ROS保留约75%，光诱导仅剩24%；10 cm组织后X射线仍能产生可区分的ROS信号。

在4T1腹腔转移瘤模型中，静脉注射BTBR-NPs后，X射线余辉成像在完整腹壁下信噪比（SBR）为75，开腹后为153，而荧光成像因背景高无法有效区分肿瘤。在皮下肿瘤模型中，注射后36小时肿瘤部位余辉信号达到峰值，SBR为123，是荧光成像（SBR=29）的4.2倍；离体成像显示BTBR-NPs的肿瘤/肝脏信号比达12.5，而DiR荧光纳米颗粒的肿瘤信号仅为肝脏的82%。药代动力学显示血浆终末半衰期11.3小时，24小时肿瘤蓄积约5.8 μg/g。

治疗实验中，当肿瘤体积约100 mm³时，小鼠随机分为PBS对照、单独X射线、BTBR-NPs、BTBR-NPs+X射线四组。BTBR-NPs+X射线组每周期接受3次2 Gy照射（间隔20分钟），累计6 Gy，共3个周期。第16天，PBS组和BTBR-NPs组肿瘤体积分别增至初始的8.1倍和7.9倍，单独X射线组增至5.4倍，而BTBR-NPs+X射线组肿瘤体积降至初始的0.15倍，抑瘤率95.8%。生存分析显示，BTBR-NPs+X射线组80%小鼠存活至第36天。免疫荧光和H&E、TUNEL染色确认治疗组ROS升高、DNA损伤加重、凋亡增加。血液生化（ALT、AST、BUN、CRE）和炎症因子（TNFα、IL-6）未见异常，主要器官H&E染色无明显损伤。

Fig.5 In vitro therapeutic efficacy of TBR-NPs under continuous and fractionated X-ray irradiation. Fig.7 In vivo radio-afterglow imaging for tumor detection and surgical guidance.

推进了什么，还有什么没有回答#

这项工作把X射线触发的余辉成像、I/II型ROS生成和自维持化学能循环整合到一个D-π-D-π-A分子中，在细胞和小鼠层面证明了分次X-PDT在等总剂量下优于连续照射，并实现了缺氧肿瘤的显著抑制（95.8%）和高对比度余辉成像（SBR>120）。与依赖多组分级联的传统余辉体系相比，单分子平台在结构均一性和能量传递效率上有优势；与依赖可见/近红外光的PDT相比，X射线激发解决了深部穿透问题，I型路径又绕开了缺氧限制。

但走向临床之前，有几个问题需要回答。长期生物安全性只观察了治疗周期内的血液生化和器官病理，BTBR-NPs的长期代谢、清除和潜在慢性毒性尚未评估。 分次照射方案在4T1小鼠模型上有效，但不同肿瘤的H₂O₂水平、缺氧程度和放射敏感性差异很大，BTBR-NPs的肿瘤特异性激活是否具有普适性，需要更多肿瘤模型验证。余辉信号与肿瘤负荷的相关性虽然在小鼠中成立，但余辉强度受纳米颗粒蓄积、组织光学特性和X射线剂量等多因素影响，能否作为临床治疗响应的定量生物标志物，还需要系统研究。 CIEEL机制的关键中间体TBR-OO已通过HPLC、HR-MS、FT-IR和NMR确认，但暗处分解后能量如何具体传递给邻近TBR分子、传递效率受哪些分子间参数控制，目前仍主要是推断，精细调控余辉波长和持续时间的分子设计规则尚未建立。此外，X射线本身的安全性和分次照射在临床放疗中的兼容性，也需要在更大动物模型和早期临床试验中检验。