【JACS】激发态分子内质子转移实现活细胞内自报告荧光光亲和标记，可视化蛋白质互作
传统光亲和标记易受溶剂淬灭或扩散干扰。该研究利用激发态分子内质子转移（ESIPT）机制，开发了基于HBI的可逆光亲和探针。HBI光照下皮秒级可逆生成亲电中间体，高效且特异地交联邻近半胱氨酸，并自带荧光报告功能。研究成功捕获了FGE酶-底物互作及活细胞中8个Tau蛋白关键互作蛋白，为活细胞互作网络解析提供了高精度新工具。
传统光亲和标记的困境：极高活性导致的干扰与扩散引发的失真
捕获活细胞内瞬时发生的蛋白质-蛋白质或蛋白质-小分子相互作用，是理解生物学过程的重要手段。传统的光亲和标记技术主要依赖苯双酮、叠氮化物和双氮丙嗪这三类基团。它们在光照下会产生双自由基、氮宾或卡宾等高活性中间体。这类中间体反应速度极快，但也存在明显的缺点。因为活性过高，它们会无差别地与周围的水分子或溶剂发生反应，导致对目标蛋白的标记效率偏低，同时生成极其复杂的产物结构，甚至可能引发细胞内活性氧水平升高，干扰正常的生理状态。
为了克服这些问题，研究人员随后开发了反应性相对温和的亲电体探针，比如四唑和邻硝基苄基衍生物。这类探针在光激发后生成的亲电中间体不会轻易被水分子淬灭。然而，温和的活性带来了一个新的麻烦：生成的亲电中间体存在较长的寿命，在尚未遇到靶蛋白的侧链之前，就可能通过扩散离开原来的作用位点。这种扩散效应直接破坏了标记的空间定位精度，使得研究人员无法准确判断相互作用发生的具体位置。此外，传统探针在完成交联后，通常还需要通过多步生物正交反应引入荧光基团，才能进行显影和定量，整个操作流程显得较为繁琐。
Figure 1. Mechanistic comparison between conventional one-time photoactivation cross-linkers and reversible activation in photoaffinity labeling.
引入激发态分子内质子转移，打造可逆的瞬时亲电分子
针对这一两难困境，研究人员改变了思路。他们设想，如果光激发产生的亲电中间体只在极短时间内存在，且在没有遇到合适靶标时能够自动还原回初始状态，就能同时解决无差别淬灭与扩散失真的问题。
基于这个逻辑，研究人员将视线投向了激发态分子内质子转移（ESIPT）过程。在ESIPT机制中，分子受光激发后，质子会从氢供体转移至邻近的杂环氮原子上，在激发态下形成酮式异构体。这一异构体本质上是一个具备亲电性的迈克尔加成受体。关键在于，整个光循环（烯醇式变酮式，再变回烯醇式）处于皮秒量级。如果在光照期间邻近区域存在足够强的亲核侧链，酮式中间体就会发生共价交联；如果周围没有合适的亲核试剂，它就会通过反向质子转移无损地弛豫回基态烯醇式。这意味着亲电性中间体不会向外扩散，也不会被水分子白白消耗掉。与此同时，ESIPT过程形成的酮式具有长波长和高荧光亮度的特性，这让探针本身兼具了荧光报告的功能，无需后续额外标记。
Figure 2. ESIPT-based peptide photo-cross-linking. (a) General ESIPT photocycle shared by the four probes (HBO, HBT, HBI, ABI) and the proposed reactive intermediate, an _ortho-_quinone methide-type electrophile susceptible to addition by a biomolecular nucleophile (Nu). (b) In vitro photo-cross-linking of ESIPT probes against a panel of 14 heptapeptides of general sequence (X-LHAPTD: X = C, E, F, G, I, K, M, N, Q, R, S, V, W, Y). LC-MS profile revealed that only HBI produced a notable peptide-probe adduct, and exclusively with C-LHAPTD. (c) Tandem MS2 sequencing of the C-LHAPTD-HBI adduct. The b- and y-ion series unambiguously match the HBI modification to the cysteine residue.
在筛选了HBO、HBT、HBI和ABI这四个常见的ESIPT骨架后，研究人员发现2-(2’-羟基苯基)苯并咪唑（HBI）的表现最为符合预期。HBI不仅具有较高的荧光量子产率，其激发态酮式的寿命可达到纳秒量级，在保持低溶剂淬灭的同时，为化学捕获保留了足够的时间窗口。
从短肽筛选到活细胞蛋白质组：多层级的实验验证
为了确认HBI的交联选择性，研究人员设计了一系列单氨基酸替换的七肽（X-LHAPTD）进行体外筛选，其中N端的氨基酸X被替换为14种不同的天然氨基酸。在生理缓冲液（pH 7.4）条件与365 nm波长光照射30分钟后，LC-MS分析显示，HBI仅与含有半胱氨酸的短肽（C-LHAPTD）生成了明确的加成产物，而对其他13种氨基酸短肽均没有检测到交联产物。质谱串联碎片分析进一步证实，HBI的修改位点精准定位于半胱氨酸侧链。
Figure 3. ESIPT-based photoaffinity labeling captures the FGE–substrate interaction in a complex proteome. (a) Schematic of the experimental strategy. HBI-LCTPSR undergoes nonselective photo-cross-linking in a proteome lacking FGE (path-1) but achieves selective on-target labeling of FGE when the target is present (path-2). (b) In-gel fluorescence (left) and Coomassie Blue staining (right) of E. coli lysates with (+) or without (−) FGE overexpression, treated with HBI-LCTPSR and irradiated at 365 nm for 30 min. A selective fluorescent band at ∼35 kDa (arrow) appears only upon FGE overexpression, confirming proximity-driven cross-linking. The protein size of FGE is 34.74 kDa.
在离体模型小分子反应中，研究人员观察到该反应包含对水分子的1,6-加成和对硫醇的1,4-迈克尔加成两个步骤。当体系中加入微量碳酸氢盐作为碱时，探针也能与丙二腈等其他较强的亲核试剂发生反应，这说明HBI虽然在游离状态下严格偏好半胱氨酸，但在蛋白质结合口袋的局部微环境中，其反应范围可以适度拓宽。
随后，研究人员通过两个代表性生物学案例测试了该探针在复杂环境中的应用能力。
第一个案例是甲酰甘氨酸生成酶（FGE）与其底物六肽（LCTPSR）的相互作用。将HBI偶联到底物六肽上后，放入含有或不含有FGE的大肠杆菌全蛋白提取物中。光照后，只有在表达FGE的样品中，凝胶电泳才在约35 kDa位置（FGE分子量为34.74 kDa）出现了清晰的特异性荧光带。对照组使用随机序列六肽（HBI-DEGNAI）时则完全没有产生该条带，证明交联确实是由底物特异性结合诱导的邻近效应驱动的。
第二个案例是在活细胞中捕捉Tau蛋白（K18-P301L）的传播互作网络。研究人员将HBI标记到Tau蛋白片段上，并加入HEK-Tau-BiFC报告细胞系中。活细胞荧光成像表明，HBI修饰并没有破坏Tau蛋白诱导聚集的能力。光照交联后，利用HBI自身的荧光对凝胶进行检测，可以清晰看到除了Tau蛋白自身的单体与二聚体条带外，还出现了大量新的蛋白杂交带。免疫印迹检测证实，探针成功捕捉到了已知与Tau蛋白发生相互作用的微管蛋白（tubulin）。
进一步结合免疫共沉淀与nanoLC-MS/MS质谱鉴定，研究人员从细胞质、核萃取物和培养基三个部分共鉴定了39个蛋白质，排除空白对照后，最终筛选出8个高信度的交联蛋白。在这8个蛋白中，波形蛋白（VIM）、CD93、FMNL2和CADM1这4个蛋白此前已被文献报道与Tau蛋白互作或参与Tau蛋白病理过程。另外4个（SELENOH、CMYAS、GTF2IRD2、PLCB1）则是新发现的候选蛋白。这些已知蛋白的复现和新蛋白的发现，构成了相互印证的证据链。
Figure 4. Photo-cross-linking the interactome of tau-aggregation transmission with HBI. (a) Experiment design of photoaffinity HBI-K18P301L-mediated transmission of tau aggregation in the BiFC model. (b) Live-cell BiFC imaging (ex 480/40 nm, em 527/30 nm) of HEK-Tau-BiFC cells treated for 24 h with PBS vehicle, HBI-NHS (10 μM), unconjugated K18-P301L (10 μg/mL), or HBI-K18-P301L (10 μg/mL). Both K18-P301L and the conjugate produce a robust BiFC signal. Scale bar, 50 μm. (c) PAGE images of HBI-K18-P301L photo-cross-linking. HEK-Tau-BiFC cells were treated with HBI-K18-P301L (10 μg/mL), either kept in the dark (−) or irradiated at 365 nm for 30 min; whole-cell lysates were resolved by SDS-PAGE. Left: Ponceau S staining of the membrane (loading control). Middle: In-gel fluorescence imaging of the HBI chromophore (blue-LED excitation, 518–546 nm emission filter). A prominent K18-P301L dimer band (∗, ∼35 kDa) and a monomer band (∗∗, ∼15 kDa) were detectable by intact fluorescence of HBI. Right: Anti-α-tubulin Western blot, supporting the assignment of the UV-induced α-tubulin–tau adduct formation by HBI-K18-P301L. (d) Venn diagram of MaxQuant-identified protein groups in the anti-phosphoTau-Ser262 immunoprecipitation across all three fractions with/without HBI-K18-P301L treatment. (e) Summary of the 8 high-confidence photo-cross-linked target proteins. A companion literature table with primary references is provided as Supplementary Table S8.
方法的应用价值与当前的技术边界
这项研究展示了一种全新的光亲和标记设计策略。它改变了传统探针依靠强活性中间体硬碰硬的思路，利用ESIPT的可逆化学特性，同时实现了低溶剂背景干扰、高空间定位精度以及无需二次标记的自报告荧光检测。对于分析活细胞内那些短暂存在、易受细胞裂解破坏的弱相互作用，这种工具提供了更直接的操作方式。
当然，该方法在实际应用中依然存在明确的边界。首先，HBI在生理条件下的化学反应选择性高度偏向半胱氨酸。如果目标蛋白质相互作用界面上缺乏暴露且具备亲核活性的半胱氨酸残基，探针的捕获效率可能会显著下降。其次，激发探针需要使用365 nm波长的近紫外光。虽然光照时间控制在30分钟内对短时间细胞实验影响有限，但紫外光对深层组织的穿透力较弱，且长光照可能带来潜在的光毒性，这限制了它在活体动物组织内部的直接应用。最后，在Tau蛋白组学筛选中发现的4个新候选蛋白，目前尚处于质谱鉴定的初步阶段，它们在疾病传播中的具体功能机制仍需后续更多的生物学实验予以验证。
参考文献：K. Kozoriz, D. P. Murale, S. C. Hong, K. T. Hong, Md. M. Haque, Y. K. Kim and J.-S. Lee, J. Am. Chem. Soc., 2026, jacs.6c08200.