【JACS】一种正交反应，实现了三种不同细胞表面蛋白的选择性修饰四色荧光标记#

总结#

研究开发了一种基于2-[(烷基硫)(芳基)亚甲基]丙二腈（TAMM）分子的单一生物正交反应，实现了多重细胞表面蛋白的快速、高效标记。该方法在细胞系、初级神经元和活体小鼠中均表现出优异的标记效率和特异性。

摘要#

小分子荧光团是荧光成像的重要工具，但其与目标蛋白的共价结合方式限制了多色成像的应用。本文通过详细的机制研究，发现TAMM分子与1,2-氨基硫醇的反应速率超过10⁴ M⁻¹ s⁻¹。TAMM分子和温和的反应条件使得在细胞系、初级神经元和活体小鼠中实现了表面蛋白的位点特异性标记。通过基因编码扩展和序列特异性蛋白水解，实现了三种不同细胞表面蛋白的选择性修饰。TAMM缩合反应还兼容Cu催化的叠氮-炔环加成和四嗪连接，实现了四色荧光标记，达到了常规共聚焦显微镜的最大可用颜色数。因此，生物共轭化学不再是多重细胞表面蛋白成像的限制因素。

研究结果分类展示#

反应机制与动力学增强#

反应速率：TAMM分子与1,2-氨基硫醇的反应速率常数超过10⁴ M⁻¹ s⁻¹。
中间体表征：通过质谱和NMR光谱确认了两个中间体Int-1和Int-2的存在。
反应路径：TAMM缩合反应通过硫醇捕获、四氢噻唑环形成和N-连接中间体的重排实现。
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活细胞蛋白标记#

细胞系实验：在HEK293T细胞中，Cy5-TAMM-SCH₂CF₃的标记效率显著高于Cy5-TAMM-SEt。

初级神经元实验：在初级小鼠皮层神经元中，TAMM标记显示出高特异性和低毒性。
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多重标记与应用#

三色标记：通过TAMM缩合反应、CuAAC和四嗪连接，实现了三种不同细胞表面蛋白的选择性标记。
四色标记：结合基因编码扩展和序列特异性蛋白水解，实现了四色荧光标记。
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这项研究展示了单一生物正交反应在多重细胞表面蛋白标记中的巨大潜力，为未来的荧光成像应用提供了新的思路和方法。详细信息可以在这里找到。

参考文献#

Huang, Y.; Wu, C.; Lu, A.; Wang, J.; Liang, J.; Sun, H.; Yang, L.; Duan, S.; Berezin, A. A.; Wu, C.; Zhang, B.; Wu, Y.-L.; Tsai, Y.-H. A Single Bioorthogonal Reaction for Multiplex Cell Surface Protein Labeling. J. Am. Chem. Soc. 2025, jacs.4c11701. https://doi.org/10.1021/jacs.4c11701.