双光子激发显微镜用于活体完整组织的三维成像#

Nonlinear Optics and 2PM#

相比之下，双光子激发显微镜依赖于光与物质之间的非线性相互作用。在极高的激发强度下，荧光团有可能同时吸收两个激发光子，每个光子的能量仅为单光子吸收事件所需能量的一半（通常为红光到红外光波长，见图6.1）。由于光子能量与波长成反比关系，能量减半的光子其波长将是原来的两倍。例如，蓝光范围内的光子（约450纳米）的能量是近红外光范围内的光子（约900纳米）的两倍。因此，在双光子激发显微镜（2PM）中，通常用紫外光（约350纳米）激发的荧光探针可以用红光（约700纳米）激发，而通常由蓝光、绿光或橙光（450-550纳米）激发的探针可以用近红外光（900-1100纳米）激发。对于通常吸收红光（>600纳米）的探针，则需要更深层的红外光激发（>1200纳米），此时水的光物理特性可能会成为限制因素。正如下面将详细说明的，这种非线性吸收意味着在显微镜中，双光子激发仅发生在焦点区域。由于单个激发光子本身能量不足以激发荧光，它们会以极小的相互作用穿过样本。这有两个直接的重要含义：首先，显微镜焦平面之上和之下的荧光团不会被照明激光激发，因此不会发生光漂白，也不会导致光毒性损伤。需要注意的是，焦平面内的荧光团仍然会受到光漂白和相关的光毒性损伤——事实上，在双光子激发所需的高激光强度下，这些有害事件往往会加速发生。其次，激发光在穿过样本时不会因焦外吸收而衰减。这使得激发光能够更深入地穿透厚样本，并且在焦点深度上实现更均匀的照明。然而，正如下面将详细说明的，这种局部激发的另一个实际后果是，2PM图像受样本内光散射的降解较少，因此在深度组织成像方面，双光子激发显微镜比其他光学切片方法更具优势。

History and Theory of 2PM#

双光子吸收的可能性最初由玛丽亚·格珀特-迈耶（Maria Goppert-Mayer）在其1931年的博士论文中预测 [2]，但当时尚未具备实现这种非线性效应所需的高光子通量（格珀特-迈耶博士后来因发展核壳层模型而荣获1963年诺贝尔物理学奖）。即使当时通过最好的物镜聚焦的最亮的弧光灯，每几分钟也只能产生一次双光子事件，远低于检测限。然而，在激光发明不久后，凯撒（Kaiser）和加勒特（Garrett）于1961年首次观察到双光子激发，但早期激光产生的双光子激发事件数量仍然过低，无法用于成像。直到超短脉冲锁模激光器的发明（见附框6.1），双光子激发显微镜（2PM）才变得实用，这一点首次由登克（Denk）等人 [1] 在1990年展示。在过去的25年中，仪器的持续改进使2PM成为光学切片显微镜的一种实用选择，尤其是在深度组织成像方面。

我们现在知道，格珀特-迈耶正确地预测了多个光子的同时吸收，并设定了实现这种效应所需的光子密度（光强度）水平。根据她最初的理论，这一理论在过去50多年中得到了多次验证，实现高效双光子激发所需的强度大约是实现相同数量单光子激发所需强度的百万倍。如果没有超短脉冲激光器的出现，这种高强度在生物实验中是无法达到的。超短脉冲激光器提供了高峰值功率（非常适合双光子激发），但平均功率足够低（这使得成像样本时不会因线性吸收而产生过度加热或其他效应）。事实上，超快脉冲激光器的发展最初使2PM得以实现。这些细节在附框6.1中进行了介绍。

对于激光扫描成像，每幅图像需要在大约1秒内获取约一百万像素，为了在图像中获得良好的信噪比，每个像素需要检测到超过一千个光子。为了在样本处获得足以用于双光子激发显微镜（2PM）成像的功率，激发光子不仅需要通过脉冲激光在时间上聚集，还需要通过显微镜物镜的聚焦在空间上聚集。这一聚集的关键点可以通过反应的基本物理化学原理来理解，反应过程为A + 2B → C（其中A是处于基态的荧光团，B是光子，C是处于激发态的荧光团）。该反应发生的概率取决于B的浓度的平方。随着激发光在显微镜中被聚焦，光子变得越来越密集，其浓度增加，从而大大提高了双光子激发的概率。使用高数值孔径（NA）的物镜，激光束可以聚焦到直径约为300纳米的斑点，这使得光子密度比典型1毫米直径的激光束中的密度高出1000万倍（或比样本表面附近的100微米直径光束高出约10万倍）。由于双光子激发速率与光子浓度的平方成正比，这种聚焦将概率提高了数万亿倍。因此，通过聚焦在空间上聚集光子以及使用脉冲激光在时间上聚集光子，每秒可以产生数十亿次通常极为罕见的双光子激发事件。

光子在空间上的聚集需求为双光子激发显微镜带来了一个显著优势——荧光激发的局域化。这一过程如图6.3所示。当激光脉冲穿过样本时，光子在时间上被聚集，但在大部分路径中，它们的聚集程度不足以使光子对同时与单个荧光团相互作用。只有在焦点附近，光子的聚集程度才足以产生大量双光子吸收事件。这个焦点附近的区域被称为双光子激发体积（通常称为焦点体积），对于高数值孔径物镜来说，其体积约为0.1飞升。由于双光子吸收事件的发生概率与激发强度的平方成正比，因此在焦点体积之上或之下，双光子吸收事件会迅速减少，如图6.4所示。从图中可以看出，双光子吸收在实际水平上仅在焦点体积内发生。这意味着所有荧光都来自这个微小的焦点区域，而不是来自激发光穿过的其他深度。这种激发的局域化实现了固有的光学切片，其效果大致相当于共聚焦显微镜所实现的光学切片。然而，在双光子激发显微镜中，无需使用共聚焦小孔来获得光学切片，因为这些切片是通过荧光的局域化直接产生的。作为一种类比，传统荧光显微镜相当于从外部用强光手电筒照亮房屋内部，而双光子激发显微镜则是在房屋内部用手电筒检查其内容。所需的光是在感兴趣的样本内部产生的。这种差异如图6.5所示，其中两束平行激光被聚焦到一个装有荧光素溶液的比色皿中。传统单光子吸收在整个样本中发生，形成了聚焦光束特有的沙漏形状，而双光子激发仅在焦点处被观察到。在共聚焦显微镜中，小孔用于排除焦点之外的背景荧光，只允许焦平面内的信号被检测到，但在双光子激发显微镜中，激发不会产生背景信号，因此无需小孔来排除背景。由于无需小孔来获得光学切片，探测几何结构可以被简化，这也有助于进一步提高信号收集效率。

The Role of Light Absorption in 2PM#

双光子激发显微镜（2PM）激发仅限于焦点的第二个重要后果是，激发光在穿过样本时不会被吸收，因此更多的激发光能够深入组织内部。这一效应在图6.7中得到了展示，图中呈现了一张轴向（X-Z）扫描图像，穿透了一块有色但其他方面透明且几乎不散射的玻璃载玻片，深度达250微米。这块玻璃载玻片的折射率与用于成像的浸油相同，因此不会因折射率不匹配而产生像差，从而保证了成像质量不受影响。

首先，使用488纳米的单光子激发获取了一张轴向X-Z扫描图像。从图像中可以看出，尤其是在沿Z轴的强度分布图中，随着成像深度的增加，信号强度逐渐减弱，到250微米深处时，信号仅为25%。由于这块玻璃是透明的，散射的贡献可以忽略不计。这意味着深度处的信号损失完全是因为激发光在到达焦点之前被焦外的荧光团吸收。换句话说，在到达样本内部250微米处的焦点之前，75%的激发光子被吸收了。虽然这块玻璃载玻片的荧光团浓度较高，但焦外吸收导致的损失始终是共聚焦显微镜的关键限制因素，事实上，对于依赖于光穿透样本的光片显微镜来说也是如此（见下文）。

第二张图展示了一个相同的轴向扫描，不同之处在于这次使用了780纳米的双光子激发。与第一种情况形成鲜明对比的是，2PM扫描图像在整个250微米深度范围内都保持了均匀的亮度。这种均匀性的原因是，在到达焦点之前，入射光不会被吸收：单个光子的能量不足以激发荧光团，而且直到到达焦点，光子的密度才足够高以产生双光子激发事件。因此，2PM能够提供更深的成像深度的一个主要原因是，入射激发光在到达焦点之前不会被焦外吸收。2PM的实际优势在于，红光和红外光激发光通常不会被生物组织吸收。这一点很容易通过用手遮住手电筒来观察——透过来的是红光，而其他颜色的光则被自然存在的分子吸收，尤其是蓝光、绿光和橙光区域的黄素、脂色素和卟啉（含铁蛋白）吸收最为强烈。尽管这一假设对大多数动物细胞都成立，但需要注意的是，许多物种，尤其是植物，在红光和近红外区域可能有很强的吸收，这种吸收可能会限制甚至排除2PM在这些样本中的使用。

最后，尽管激发光在穿过样本时可能不会被吸收，但由激发产生的荧光在从样本中传出时通常会有显著的吸收，这也会限制2PM的最大成像深度。

The Role of Light Scattering in 2PM#

双光子激发显微镜（2PM）的激发仅限于焦点的第三个后果是，与共聚焦显微镜相比，2PM对样本中光散射导致的信号退化不那么敏感。尽管如此，光散射仍然是成像深度的最终限制因素。吸收和散射的相对作用可以通过一个简单的实验来演示，使用红色和绿色激光笔。用手指遮住红色激光笔时，可以看到红色光透过手指（类似于前面提到的手电筒实验）。红色光没有被手指中的分子和细胞吸收。然而，激光束并没有直接透过——光在穿过手指时被大量散射，并向各个方向散开。与红色激光笔不同，用手指遮住绿色激光笔时，结果则大不相同。绿色光完全无法透过手指——它被全部吸收了。在激光束照射手指的附近，可能会观察到少量散射的绿色光，但没有光能够穿过手指并从另一侧透出。

尽管红色光能够穿透组织，但它高度散射，这限制了其在成像中的实用性。双光子激发显微镜的深度穿透能力受到样本中入射激发光和出射荧光散射的限制。然而，与共聚焦显微镜相比，2PM对光散射导致的信号退化不那么敏感，这一点在图6.8中得到了展示，图中描述了光散射对共聚焦显微镜和2PM的影响方式。图6.8a展示了使用蓝光激发和绿光荧光的共聚焦显微镜。显微镜将蓝色激光聚焦到焦点（1），产生的荧光被收集并通过共聚焦小孔传输到探测器（2）。然而，部分从样本返回的荧光可能会被散射并错过小孔（3）。这些荧光来自焦点，本应被检测到，但由于散射而丢失。同样，激发光在到达焦点的途中也会被散射（4）。这些光可能会与焦点外的荧光团相互作用，产生额外的背景荧光。在弱散射样本中，大部分背景荧光会被小孔排除，因此只有极少量会被检测到。在强散射样本中，或者在样本深处成像时，增加的激发光散射会导致大量背景荧光散射进入小孔（2）。这种额外背景的检测会在图像上表现为一种均匀的雾状，降低图像对比度（如图6.11所示）。因此，激发光和荧光的散射会降低检测到的信号强度，而背景荧光的散射则会降低图像对比度。

图6.8b展示了使用红光（双光子激发）和相同绿光荧光的2PM。激光被聚焦（6）到一个点，激发光子在这个点足够密集，从而产生双光子激发。与共聚焦显微镜类似，荧光被收集并传输到探测器。然而，由于我们知道2PM的荧光仅来自焦点，因此无需使用共聚焦小孔来排除焦外荧光。因此，无论是直接从样本返回的荧光（7），还是被散射的荧光（8），都可以被高效地检测到，这大大提高了信号强度。正如后面仪器部分所述，可以在物镜之后立即使用非扫描探测器，这进一步提高了信号收集效率。正如接下来一段详细描述的，2PM中使用的红光和红外光激发光在样本中仍然会发生散射，类似于共聚焦显微镜中的情况。然而，在2PM中，这些散射的激发光不会产生额外的背景荧光，因为两个光子同时散射到同一位置的概率几乎为零。因此，与共聚焦显微镜相比，2PM通过提高收集效率和成像深度而更具优势。

关于2PM中使用的较长波长光如何显著减少散射，已有大量讨论，但这并非深度穿透能力增强的真正原因。这种误解的根源在于，光散射在大气中最为人熟知，它使天空呈现蓝色。这种效应基于瑞利散射理论，该理论假设散射颗粒远小于光的波长。这导致散射强度与光波长的四次方成反比。因此，瑞利散射对紫光和蓝光的影响远大于对红端较长波长光的影响。然而，在细胞和组织中，散射颗粒（细胞器、囊泡、染色体）的大小并不远小于光的波长；实际上，它们可能比光的波长还要大。与组织成像相关的光散射已在扩散光学层析成像研究中得到了广泛研究，该技术用于测量组织氧合水平和检测肿瘤。这些研究表明，组织散射可以用米氏散射理论更好地预测，该理论描述了任意直径的球形颗粒对光的散射。对于与光波长相当或更大的颗粒，米氏散射的量并不强烈依赖于波长，而是与颗粒直径的平方成正比。

Lasers for 2PM#

共聚焦显微镜与双光子激发显微镜（2PM）之间的第一个主要区别在于激光器。如前所述，2PM所需的激光必须是“超快”的，通常定义为亚皮秒级的激光脉冲。利用这些短脉冲激光，可以在不汽化样本的情况下，将高激光强度传递到样本上（见附框6.1）。双光子激发显微镜如今已是一项成熟的技术，这在很大程度上得益于易于使用的超快锁模激光系统的出现，这些系统非常适合该技术。尽管2PM最初是随着亚皮秒脉冲锁模激光的发明而成为可能的，但早期版本远非即插即用的系统。当时，细胞生物学或生理学实验室通常缺乏日常激光操作所需的专业知识。然而，在过去的15年中，激光制造商开发了钛宝石（Ti）和其他激光系统，这些系统实现了自动对准和波长调节，几乎与激光笔一样即插即用。除了使非专业实验室能够使用2PM外，这些激光器还允许轻松进行激发波长扫描，这对于2PM成像不同荧光团是必需的。

目前最常用的激光源是钛宝石激光振荡器，其波长范围通常在680-1050纳米之间（大致相当于单光子吸收波长范围的340-525纳米）。这种宽可调谐波长范围带来了另一个优势：在2PM中可以选择连续的激发波长，而共聚焦显微镜的激发通常仅限于几个离散的波长线。这些锁模钛宝石激光器产生超短光脉冲（约100飞秒），重复频率约为100兆赫兹（即每10纳秒一个脉冲）。由于激光在开启状态下的时间比关闭状态少10^5倍，因此平均功率保持较低，同时在脉冲操作期间提供高光子通量。如前所述，这种在时间上聚集激光光子的方式与显微镜中聚焦到衍射受限的焦点体积相结合，实现了2PM成像所需的高光子通量，从而产生足够的非线性激发事件。一种较新的发展是广泛可调谐的光学参量振荡器（OPO）激光器，目前已有商业化的全自动免操作版本。这些激光器提供了与钛宝石激光器相似的脉冲和功率特性，但其可调谐范围从680纳米扩展到1300纳米。这一更宽的调谐范围使得2PM能够使用通常在红光区域（约650纳米）被单光子激发的荧光团。这些荧光团在组织中的吸收非常弱，理论上可以实现比蓝光、绿光或橙光荧光团更深的成像深度。然而，目前使用红色荧光团进行2PM成像的研究才刚刚开始探索。尽管存在一些实际限制，但到目前为止，这些限制尚未得到实验验证。首先，我们知道水在红外光谱中的吸收会显著增加。由于这种吸收是线性的，产生双光子激发所需的高功率可能导致加热（下文将详细描述）。使用1300纳米的光，简单的计算表明，在成像过程中加热可能高达5°C。这足以使脂质膜变性，并显著干扰细胞功能。如果事实确实如此，那么就需要谨慎控制激光功率，这可能会导致空间和时间分辨率的降低。其他潜在限制可能来自红色荧光蛋白的稀缺性以及红色荧光探针的相对质量较差。尽管对开发用于活体成像的此类探针有相当大的兴趣，但即使是最好的红色和近红外荧光团的量子产率也仅为约10%（相比之下，绿色荧光团的量子产率接近100%）。最后，使用更深层的红外波长将需要专用的显微镜光学元件。幸运的是，显微镜制造商已经开发出专为双光子显微镜优化的物镜。这些物镜考虑了高效传输红外激发光和可见光发射光的需求，并能够在各种组织和其他样本中进行深度成像，而不会引入显著的像差。尽管使用钛宝石激光波长可以在普通显微镜光学元件上获得合理的结果，但使用最新的即插即用OPO激光器将2PM扩展到红外区域时，优化的2PM物镜将至关重要。

关于2PM适用激光的一个重要考虑因素是脉冲到底需要多短。对此并没有一成不变的规则，但一般来说，脉冲越短越好。最初的2PM实验使用了一种碰撞脉冲锁模（CPM）染料激光器，其脉冲宽度小于100飞秒（<10^-13秒），而通常使用的钛宝石和OPO激光器也能提供类似的脉冲。因此，标准脉冲宽度约为100飞秒，这在广泛的应用中已被证明是有效的。超过1皮秒（10^-12秒）的脉冲也已成功用于2PM。与不同激光脉冲相关的权衡在附框6.2中有详细说明。

Detection Strategies for 2PM#

双光子激发显微镜（2PM）与共聚焦显微镜设计之间的第二个主要区别在于探测器的位置。在共聚焦显微镜中，荧光会重新经过扫描镜，从而被“反扫描”，然后聚焦到共聚焦小孔上，以排除焦外背景荧光，否则这些背景荧光会模糊图像。尽管小孔在共聚焦系统中实现了所需的光学切片，但这一过程是以牺牲部分焦内荧光为代价的，同时也会排除焦外背景。这种“好”光子的损失在对样本进行深度成像时变得更加显著。除了小孔处的损失外，荧光在到达共聚焦小孔之前还需要重新经过扫描镜光学系统，这一过程不可避免地会导致进一步的信号损失。

相比之下，2PM不需要使用小孔，因为我们知道荧光仅来自焦点。因此，所有荧光发射都可以在不使用小孔的情况下被收集，这为探测器的位置提供了许多新的可能性。

在2PM中，可以简单地打开小孔（图6.9中标记为#1），从而捕获部分散射的荧光光子（图6.8中标记为光子(8)）。尽管这比共聚焦显微镜提高了收集效率，但荧光在经过扫描系统并重新聚焦到探测器时仍会损失。此外，由于光学系统的设计，即使完全打开小孔，它仍然会起到空间滤波器的作用，并排除许多在2PM中应该被收集的散射荧光光子。实际上，可以采用一种更简单的探测器布局，将物镜收集到的所有光子直接导向光电倍增管探测器。这种策略被称为非反扫描探测（NDD，图6.9中标记为#2），是2PM中最常见的探测布局 [4]。对于NDD，唯一应用的选择是基于波长的，通过使用适当的光学滤波片来排除激发光，仅检测感兴趣的荧光。使用NDD可以测量物镜收集到的所有散射荧光，从而显著提高信号水平。与共聚焦显微镜类似，使用GaAsP光阴极的新型光电倍增管探测器可以进一步提高收集效率，如果可能的话，应将其用于2PM。最后，还可以使用一个不依赖于物镜的外部探测器（图6.9中标记为#3）。这种探测器可以是一个大面积光子探测器，或者是一个非光学探测器，例如通过电生理学测量的细胞电响应（如2PM应用示例中所述）。

The Advantages of 2PM for Deep-Tissue Imaging#

将优化的非反扫描探测（NDD）与2PM固有的深度穿透能力相结合，可以实现最大深度的成像。实际的最大成像深度取决于样本，但一个经验法则是，使用NDD的2PM能够比共聚焦显微镜深入6到10倍。如图6.10和图6.11所示，深度增加的2到3倍归因于2PM中缺乏焦外吸收，而NDD对散射荧光的改进收集又额外增加了3倍的深度。

图6.10展示了一系列对苏木精重染色的小鼠肾脏切片的X-Z扫描图像。为了使每张图像中组织表面的信号水平保持一致，每次X-Z扫描时都调整了激光功率。使用共聚焦显微镜时，只能从表面以下约10微米范围内获得有用的信号。虽然可以收集更深层的荧光，但对比度会丢失（如图6.11所示）。从共聚焦显微镜切换到2PM，但使用反扫描探测（图6.9中标记为探测策略#1），并打开小孔，可以收集到从表面以下约20到30微米的有用数据。这一改进主要归因于2PM中缺乏焦外吸收，使得更多的激发光能够到达样本深处的焦点。虽然通过打开的小孔可以收集到一些散射荧光，但许多有用的光子在返回扫描系统并聚焦到小孔时会偏离光路而丢失。

NDD（图6.9中标记为探测策略#2）可以直接在物镜之后使用，从而显著提高散射荧光的收集效率。使用NDD时，即使不增加激光功率，也可以从样本内部超过50微米处获得有用的数据。通过增加激光功率，有可能从这个样本的表面以下100微米处获得有用的数据。正如图6.8所述，在2PM中，增加激发功率不会产生额外的背景荧光，否则会形成雾状背景并降低图像对比度。这一效应在图6.11中得到了展示，图中呈现了小鼠大脑切片（用罗丹明染色）内部50微米处的两个可比的X-Y平面。第一张是使用共聚焦显微镜拍摄的，激光功率被增加以提高荧光信号。确实，荧光信号水平增加了，但大部分荧光表现为背景雾状，模糊了生物结构的对比度。另一方面，使用2PM时，可以在不产生额外背景雾的情况下增加激发激光功率。在这种情况下，信号水平增加，而精细的生物结构仍然清晰可见。重要的是，图像中没有结构的区域保持黑色，这表明图像对比度达到了最大。

总结来说，2PM具有多项实际优势，这些优势源于显微镜中双光子激发的光物理特性，即激发仅限于焦点。这导致了光学切片的固有产生（通常被称为“免费的共聚焦”，因为不需要小孔），并且激发光的焦外吸收缺失使得更多的光能够到达焦点。重要的是，光漂白和光毒性损伤也仅限于焦平面，因此在厚样本中，这些有害效应可以显著减少。由于2PM成像形成的细节，这种方法对组织中光散射导致的退化比其他光学切片方法不那么敏感。此外，2PM中使用的红光和红外光对许多生物样本的吸收较少，因此生物损伤也较小。这些因素共同赋予了2PM在亚细胞分辨率下进行深度组织成像的巨大优势。

Limits of Spatial Resolution in 2PM#

由于双光子激发显微镜（2PM）使用较长的波长，在实际应用中，其空间分辨率通常比共聚焦显微镜稍差。在2PM中，激发强度的平方依赖性使激发体积缩小了√2倍，但使用双倍波长的光会使焦点斑扩大2倍。使用检测小孔可以提高2PM的空间分辨率，但这将抵消该方法的大部分优势（见图6.8）。由于共聚焦显微镜使用较短的波长，其分辨率可以达到双光子显微镜的一半。然而，在生物荧光共聚焦显微镜中，信号收集通常通过打开小孔来优化，这会降低空间分辨率。因此，在实际应用中，双光子显微镜的空间分辨率仅略逊于共聚焦显微镜。

Potential Sample Heating by the High Laser Powers in 2PM#

当使用过高的功率时，红光和红外光激发可能会导致样本局部加热。这种加热主要是由于水对激发光的单光子吸收引起的。由于所有生物系统中都含有高浓度的水，即使是非常小的直接吸收也可能导致大量的激发事件。水本身不具备荧光特性，因此吸收的能量几乎全部以热量的形式在样本中耗散。图6.12 [5]展示了水在红光和近红外区域的吸收特性曲线。该图以半对数形式绘制，因此在980纳米处的吸收实际上比680纳米处高100倍。在成像实验中对局部加热的计算表明，即使在980纳米处，最大加热幅度也小于1°C。然而，在单点实验中（激光束固定不动而不进行扫描），加热速率可能超过1°C/秒。使用水吸收较低的其他波长（例如800纳米或1060纳米）可以最小化样本加热带来的潜在影响。因此，对于使用钛宝石激光器成像所需的激光强度，只要避免使用980纳米的固定光束，加热通常不会造成问题。

然而，使用新型的光学参量振荡器（OPO）系统可能会带来更显著的加热风险，因为这些系统可调谐至1300纳米。水在红外光谱中的吸收随着波长增加而持续上升，1300纳米附近的吸收可能比980纳米处高近100倍。这意味着在高激光强度下，样本温度可能上升超过10°C。如前所述，1050纳米到1300纳米的光谱区域尚未被充分探索，但显然，样本加热将是这一光谱窗口中一个重要的挑战。

Difficulties in Predicting and Measuring Two-Photon Excitation Spectra#

使用双光子激发显微镜（2PM）时面临的另一个挑战是，荧光团的双光子激发光谱通常与其单光子激发光谱有很大差异。这是由于双光子吸收过程的特性所导致的。这一点至关重要，因为选择错误的激发波长可能会加剧2PM中的其他问题，例如样本加热和加速光漂白。图6.13展示了荧光团二苯基己三烯（DPH）的单光子和双光子吸收光谱之间的差异。在该图中，双光子激发光谱以半波长绘制用于比较（即，双光子吸收峰在400纳米处，实际对应的波长为800纳米）。已知单光子光谱很容易测量，通过将吸收峰加倍，初步推测双光子吸收峰可能在770纳米（2×385纳米）。然而，770纳米实际上处于双光子吸收的低谷。相比之下，800纳米是一个更好的选择。这个例子提示了一种优化双光子激发波长的合理方法。从单光子峰的两倍波长开始，然后在该初始波长的上下调节双光子激发波长，通过最大化观察到的荧光强度，可以找到最佳的双光子激发波长。在这种情况下，初始波长为770纳米，但每10纳米向上下调节一次，可以在750纳米和800纳米处获得更高的荧光信号。

单光子和双光子吸收光谱之间差异的主要原因之一是与高能级激发态的相互作用强度不同 [7]。图6.14展示了荧光蛋白TagRFP在单光子和双光子激发下，最低单重态（S1）和高阶态（Sn）的相对吸收情况（在这种情况下，单光子值以两倍波长绘制用于比较——即，550纳米的单光子吸收峰绘制在1100纳米处）。与单光子吸收相比，S1态的双光子激发效率大幅降低，而Sn态的双光子激发则显著增强。这使得即使这些跃迁对于单光子成像来说过于微弱，也可以在2PM中使用Sn态的激发波长（例如750纳米）。在这种情况下，跃迁之间的间隔较大，使得区分这些差异变得相对简单。然而，即使在S1跃迁内的振动态之间，单光子和双光子吸收也存在差异。这可以从单光子光谱中在525纳米处形成肩峰的能量级在双光子激发光谱中得到增强这一现象中看出。这导致在1050纳米处的双光子效率高于1100纳米。

关于单光子和双光子吸收光谱差异的一个共同主题是荧光团分子对称性对这些差异的影响。一般的经验法则是，对称荧光团的双光子吸收峰会发生蓝移。这意味着400纳米的单光子峰会出现在双光子光谱的700-750纳米处，而不是800纳米（2×400纳米）。相比之下，不对称的荧光分子更有可能在单光子峰波长的两倍处显示出双光子吸收峰。芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸[对称]和色氨酸[不对称]）的不同吸收光谱就是一个很好的例子，如图6.15所示，其中单光子波长以实际值的两倍绘制 [8]。色氨酸的双光子吸收光谱几乎完美地覆盖了单光子吸收光谱的两倍，而酪氨酸的双光子吸收光谱则比“预期”的单光子吸收光谱的两倍蓝移约40纳米。这种关于双光子激发的对称性规则在荧光团中非常常见，通常可以为未知双光子吸收光谱提供最佳的初步推测。

荧光团通常是复杂的分子，其双光子吸收光谱难以预测。同样，由于双光子吸收过程仅利用了入射光的极小部分，因此测量双光子吸收也很困难。因此，正如图6.13中DPH的例子所述，激发最大值通常是通过调节激光并测量目标荧光团的荧光强度来确定的，并将其归一化到已知的双光子激发光谱。如今，许多常用荧光团和荧光蛋白的双光子激发光谱已经得到了表征，这极大地促进了它们在2PM中的应用。

Accelerated Photobleaching (and Associated Photodamage) in the Focal Plane#

双光子激发显微镜（2PM）的一个主要优势是光漂白和相关的光毒性损伤仅限于焦平面。在厚样本中，这可以显著减少总体光漂白，尤其是在获取三维数据堆栈时。然而，即使总体漂白减少，焦平面内的局部光漂白实际上可能会增加，这存在显著风险。由于2PM中使用的非线性吸收和高激光功率，焦平面上光漂白的概率增加。这种增加的光漂白的根源尚不清楚，但可能与额外的光子与荧光团的激发态相互作用并导致其跃迁到更易发生光漂白的状态有关。由于焦点处光子浓度很高，这种跃迁在2PM中更容易发生。这种加速光漂白的实际表现通过图6.16和图6.17中荧光素的荧光和光漂白得到了展示。

如附框6.1所述，双光子激发荧光的量与激光强度的平方成正比（F = I²）。这种平方依赖关系可以通过对数-对数图（log(F) = 2log(I)）清晰地展示出来，对于双光子激发，其斜率应为2，如图6.16所示。同样可以分析光漂白速率。如果光漂白仅依赖于荧光量（如单光子激发的情况），那么光漂白量应与激光强度的平方成正比（P = I²）。相应地，对数-对数图（log(P) = 2log(I)）对于双光子激发应呈现斜率为2的直线。然而，测量不同激光强度下的光漂白量却得到了不同的结果，如图6.17所示。对于单光子激发，光漂白的依赖关系在对数-对数图中接近1，符合预期。然而，2PM的光漂白强度依赖关系并非2，而是大于3。这意味着对于荧光素，光漂白与I³¹有关。换句话说，使用两倍的激发功率会产生四倍的荧光，但光漂白会增加八倍。因此，在2PM中，最小化激发功率至关重要，这不仅可以减少对样本的直接损伤，还可以减少光漂白及其相关的光毒性损伤。

正是因为这种加速光漂白，2PM在成像薄样本时并不总是比共聚焦显微镜有显著改进。由于加速光漂白和光毒性损伤，2PM不太适合大多数单平面时间序列成像实验。当然，也有一些情况（例如组织深处的单平面成像或使用紫外激发荧光团的实验），其他方法难以实现，而这些正是2PM能够提供新方法的领域。

Expensive Lasers Create a Practical Limitation for Some Experiments#

双光子激发显微镜（2PM）的另一个实际限制是其所需的激光系统成本高昂。目前，一套最先进的光学参量振荡器（OPO）系统的费用可能相当于一台入门级共聚焦显微镜系统的总价。这不仅限制了该技术的可及性，还阻碍了一些可能有用的成像方法的实现。例如，由于激光成本较高，同时使用多个激发波长的情况极为少见。这使得多色成像变得相对复杂，尽管大多数用于2PM的激光具有可调谐性，能够找到一个单一波长同时激发两种荧光团。因此，尽管双色成像在2PM中相对容易实现，但与共聚焦和宽场荧光显微镜中使用的多通道成像（依次激发单个波长并逐一检测荧光团）相比，超光谱成像在2PM中更难以实现。

Thick Specimen including In Vivo Imaging#

本章多次强调了双光子激发显微镜（2PM）在深度组织成像方面的优势，其关键优势也已多次提及。然而，对于那些延伸到样本内部或被样本埋藏的结构，成像绝对需要光学切片。共聚焦显微镜通常可以通过在样本深处（最多可达100微米或更深）提供高质量图像来完成所需的实验。正如附框6.3中详细所述，2PM可以将这一深度限制扩展到1毫米。其原因已在前面详细讨论过。

同样，2PM也是活体动物内部结构成像的最佳选择。首先，与共聚焦显微镜相比，2PM能够实现更深层的成像，这在无法切除样本的情况下是一个显著的优势。此外，2PM使用的红外光不会被动物感知，这也是一个优点。更重要的是，减少的光漂白和光毒性损伤有助于降低动物的光毒性，因此2PM成为活体成像的首选方法。

然而，在成像薄样本时，除非需要考虑以下列出的其他因素，否则共聚焦显微镜是更好的（也更便宜的）选择。此外，对于单层细胞样本，传统的宽场荧光显微镜通常比共聚焦显微镜是更好的解决方案，因为在如此薄的样本中可能根本不需要光学切片。

Imaging Fluorophores with Excitation Peaks in the Ultraviolet (UV) Spectrum#

由于许多生物分子会吸收紫外光，因此在不损害样本完整性的前提下，对活细胞中的紫外荧光团进行成像往往较为困难。紫外光子能量较高，容易导致细胞损伤，尤其是在时间序列成像中，同一区域会被反复成像，这种损伤会更加明显。对于光学切片而言，紫外激发变得更加复杂，因为需要特殊的物镜来正确传输和聚焦紫外光。

双光子激发显微镜（2PM）使用680-800纳米的光可以激发通常由340-400纳米紫外光激发的荧光团。红光和近红外光的使用减少了光散射，同时2PM将光毒性损伤限制在焦平面，从而大幅降低了整体损伤。因此，在时间序列成像实验中，2PM可以在不产生紫外光所导致的光毒性损伤的情况下，显著增加扫描次数。

Localized Photochemistry#

双光子激发不仅可以用于激发荧光，还能激发任何类型的光化学反应。事实上，双光子激发显微镜（2PM）在将光化学反应精确定位到样本的特定区域方面极为有用，因为其非线性特性将激发事件严格限制在焦点体积内（约为1微米³）。利用2PM，可以在细胞内部引发反应，而不会在细胞外部或细胞表面产生任何激活。反应的性质取决于所使用的光活性化学物质，但双光子光激活通常用于解笼（uncaging）光敏化合物以及荧光分子（包括荧光蛋白）的光开关。在所有这些情况下，虽然可以用单光子激发来触发反应，但无法实现2PM所提供的空间限制性。

与单光子光漂白（见图6.6）类似，在共聚焦显微镜中，光激活会在整个样本中发生——包括目标区域的上方和下方。此外，大多数光激活过程使用紫外光，因此如前所述，2PM更适合用于这些实验。在应用部分中，提供了几个2PM光激活的实例。

Imaging UV-Excited Fluorophores, such as NADH for Metabolic Activity#

如前所述，双光子激发显微镜（2PM）为紫外激发提供了一种便捷的替代方案，能够将340-400纳米范围内的单光子激发替换为680-800纳米范围内的双光子激发。这一波长范围可通过商业化的即插即用型钛宝石激光系统实现。许多有用的荧光探针需要紫外光激发，但由于紫外激发的高光毒性，在活体样本中使用时可能会出现问题，尤其是在需要较低荧光团浓度的情况下。

双光子激发显微镜最成功的应用之一是通过内源性荧光辅酶β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[简称NAD(P)H]来成像代谢活动。与355纳米紫外激发相比，NAD(P)H可以在约710纳米处高效地被双光子激发，且光毒性显著降低。NAD(P)H在其氧化态具有荧光特性（它是紫外激发自荧光的主要成分之一），但其还原态NAD(P)+不具有荧光。因此，通过测量NAD(P)H水平，可以检测细胞内的氧化还原状态。这一检测方法已被用于阐明胰岛中的代谢途径，如图6.18所示。NAD(P)H在许多代谢过程中由NAD+产生，例如糖酵解（发生在细胞质中）和三羧酸循环代谢（发生在线粒体中）[9]。因此，随着胰岛细胞代谢葡萄糖，代谢活动水平可以通过NAD(P)H荧光进行观察。此外，NADH水平的2PM成像还被用于区分正常组织、癌前组织和侵袭性癌组织，研究氧化还原状态如何调控转录，以及在活体中连接星形胶质细胞的代谢活动和电活动。

与成像NAD(P)H类似，2PM还可以用于成像其他需要紫外激发的荧光团，具有出色的三维空间分辨率和整体降低的光毒性。另一个有用的紫外激发荧光团是Laurdan，它是一种用于标记膜流动性的探针。通过2PM对Laurdan进行成像，研究人员已经研究了膜序在细胞黏附到细胞外基质中的重要性，以及膜序如何促进突触后膜中乙酰胆碱受体的聚集。

Localized Photoactivation of “Caged” Compounds#

双光子激发显微镜（2PM）最初被构想为一种用于高度局域化光激活“笼状”化合物的方法，例如笼状钙或笼状谷氨酸（一种神经递质）。这些笼状化合物最初处于非活性状态，但可以通过光照射（通常在紫外区域）被激活。前面已经讨论了紫外激发的局限性，但使用紫外光进行解笼无法仅在明确定义的位置释放笼状化合物，因为焦外光会在整个样本中光激活该化合物。而使用2PM时，解笼被限制在焦点处，并且使用红光和红外光激发可以显著降低光毒性。

2PM已在多个光激活领域证明了其价值。其中最简单的应用之一是笼状荧光团的光激活。这些分子附有一个光敏化学基团，该基团会猝灭荧光，但在刺激该基团后，化学键会断裂并释放出荧光团。通常，这些笼状化合物是基于强荧光分子（如荧光素和罗丹明）构建的，因此光释放的信号明亮且稳定。荧光团的解笼可用于多种目的，例如细胞耦合和流动测量、通过逆荧光恢复后光漂白（FRAP）方法测量细胞内扩散（最初在一个点光释放荧光，然后测量其扩散），以及细胞生长和发育中的细胞系谱追踪。图6.19给出了后者的应用实例，展示了通过双光子激发光束扫描一个八细胞海胆（Lytechinus variegatus）胚胎的一个细胞后获得的图像堆栈的三维重建。该胚胎来自一个被注射了笼状荧光素-10kDa葡聚糖的卵子，其中一个细胞被双光子激发光束扫描。在发育中的胚胎中，来自单个光标记细胞的所有后代细胞都具有荧光，而其他细胞则没有。如两个单独切片所示，胚胎上半部分的一个象限中的细胞具有荧光，而下半部分的细胞则没有荧光。双光子激发的特异性和其深入组织的能力使得这种方法可以以完全非侵入性的方式对样本中任何位置的单个细胞或细胞群进行操作 [11]。

2PM还在光可切换荧光蛋白的应用中发挥了重要作用，例如PA-绿色荧光蛋白（PA-GFP），它可以通过800纳米的双光子激发高效地转化为明亮的绿色荧光，以及表现出复杂光激活动力学的PAmCherry。对于这些遗传编码的标记物，光激活通常是通过荧光蛋白内荧光团的顺反异构化产生的。通常情况下，双光子激活过程较为复杂，因为激光光可能会导致荧光团在多个羧基化和质子化状态之间发生跃迁，而不仅仅是异构化。此外，激活激光可以在脱羧状态下触发去质子化，而光激活荧光的激发同时会使荧光团在其顺反形式之间切换并触发质子化。

与荧光光激活不同，2PM光激活最初被用于解笼氨基甲酰胆碱，以结合电生理学绘制细胞表面配体门控离子通道的分布图，神经科学领域一直在利用这种方法。图6.20展示了一个将笼状谷氨酸的双光子光释放与2PM神经结构成像相结合的例子 [12]。该研究利用2PM在脑片培养中单个树突棘上明确定义的位置激活兴奋性电位。2PM提供的精确光激活使得动作电位强度与棘长度之间的定量相关性得以实现。这项工作扩展了以往众多使用2PM成像和解笼的研究，这些研究定义了单个树突棘和轴突网络如何处理兴奋性输入，包括膜电位的总和和滤波。读者可以参考如[13]等综述文章，了解双光子解笼在神经科学中的应用。

2PM的独特能力在光遗传学领域非常有用，光遗传学利用光可激活的离子通道来操纵细胞膜电位。图6.21展示了一个优雅的光遗传学应用实例 [14]。来自光遗传学转基因小鼠的脑片中的锥体细胞可以在原位进行膜片钳记录和成像。通过双光子刺激光遗传学通道，可以触发并用电生理学观察到动作电位。如图所示，只有当2PM扫描在X、Y和Z三个维度上与细胞重叠时，才能观察到动作电位。没有其他光学方法能够提供如此精确的特异性。因此，双光子光遗传学预计在未来几年将是一个快速发展的领域。更多细节可在如[15]等综述文章中找到。

Imaging Electrical Activity in Deep Tissue#

双光子激发显微镜（2PM）的主要优势在于其在厚组织成像中的深度穿透能力。2PM最早的应用之一是在神经科学领域，通过成像细胞内钙离子动态变化来绘制脑切片中神经元的电活动图谱。如今，2PM已成为神经科学中不可或缺的工具，用于研究脑切片以及活体动物大脑中的神经元电活动和神经元结构图谱。在活体小鼠大脑中，成像深度已超过1毫米，这使得研究人员能够接触到大脑信息处理区域的大部分区域。图6.22展示了一个出色的深度穿透实例，其中一组经过遗传标记的小鼠神经元被成像至大脑深处超过800微米 [16]。为了在整个深度范围内获得有用的图像，随着显微镜聚焦到大脑更深处，激光强度被增加了数倍。然而，如前所述，这种强度的增加并不会损害分辨率，而是可以用来补偿激发光散射和荧光吸收所导致的信号损失。

2PM还被应用于研究心脏的电活动，心脏组织比脑组织更致密，且其运动也使得成像更具挑战性。通过钙离子（[Ca²⁺]）成像来研究电活动，已经在离体心脏中进行了电同步化的研究。2PM能够实现对离体心脏深处的亚细胞功能研究，例如，使用膜电位荧光指示剂来测量线粒体对缺血的反应。

Light Sheet Microscopy Using Two-Photon Excitation#

正如引言中所述，光片显微镜是共聚焦显微镜的一个很有前景的替代方案，但由于使用了单光子激发，其深度穿透能力可能受到限制。这一问题可以通过使用双光子激发光片部分得到改善，非线性激发与光片显微镜的正交照明相结合，能够为厚生物样本的三维成像提供出色的性能。这一优势在图6.23中得到了展示，对比图像表明，双光子光片能够比单光子光片显微镜深入成像多达两倍的深度 [17]。

然而，由于光片显微镜的几何结构限制，无法使用非反扫描探测（NDD），因此其深度提升仅约为2倍。尽管如此，双光子激发显微镜（2PM）的标志性优势在对比度的提升以及避免单光子光片图像中常见的背景雾化方面表现得十分明显。重要的是，光片显微镜的成像速度被证明比逐点扫描的2PM快10倍，同时不损害生物样本的活性。

Other Applications of 2PM#

双光子激发显微镜（2PM）的应用广泛且不断增加。以下简要介绍了一些成功的活体2PM成像实验，包括对血流、肾功能、免疫细胞动态和胚胎发育的研究。

功能性活体双光子成像被广泛用于研究血流。这些研究与功能性磁共振成像（fMRI）相互补充，后者能够检测局部血氧水平的增加，但缺乏足够的时空分辨率来解析单个细胞事件。双光子成像能够在活体小鼠中解析单个毛细血管，通过荧光标记的红细胞和血浆非侵入性地研究血流并定量测量流速。例如，这种方法已被用于测量多种生理参数，如在不同气味激活特定神经单元时嗅球小球中的血流变化，以及根据血糖状态在胰岛中的血流变化。此外，通过2PM实现的靶向消融血管，揭示了三维血流结构，其中单个毛细血管的消融通过双光子激发的固有局域化特性实现了最小的附带损伤。

双光子成像在血流测量方面的应用自然延伸到了对肾组织功能的研究。肾脏包含复杂的血管网络，尤其是在发生过滤作用的肾小球中。使用不同大小和净电荷的荧光团进行2PM成像，可用于定量评估肾小球通透性，这在研究肾脏疾病中尤为重要。

双光子显微镜提供的增强成像深度还使得用于观察活体动态过程的四维成像（x、y、z、t）得到了显著改进。已有大量研究使用双光子显微镜动态成像免疫细胞的运动、相互作用和聚集。这些研究大多涉及对淋巴结和骨髓的活体成像，均需要高时空分辨率、100微米的成像深度，并且能够在数小时内进行最小侵入性成像，这些需求均由双光子显微镜满足。

在活体胚胎发育成像中，双光子显微镜具有诸多优势。一个重要的例证是利用时间序列三维成像研究仓鼠胚胎发育 [18]。由于哺乳动物胚胎对培养条件以及光暴露极为敏感，胚胎能够存活并正常发育至出生，清晰地证明了双光子显微镜的非侵入性。另一种用于研究胚胎发育的2PM策略是靶向消融技术。例如，这种方法已被用于果蝇胚胎，以产生特定组织模式的靶向变形。对这些形态变化的量化为研究机械敏感组织发育和基因表达的机制提供了见解。

最后，活体双光子成像还被用于为肿瘤病理学和生理学提供新的见解，因为它能够揭示在共聚焦显微镜无法到达的肿瘤深处的基因表达和生理功能。

这种方法可用于定量解析血管结构，为肿瘤中的血管生成机制提供见解，并测量肿瘤细胞中突变的生长和定位，例如那些对缺氧诱导的凋亡具有耐受性的突变。利用荧光半导体纳米晶体（称为量子点）的双光子成像也可用于肿瘤成像。量子点非常明亮且耐光损伤，与双光子显微镜结合使用时，已被证明能够增强对高度散射组织（如皮肤和脂肪组织）的成像，成像深度可达100微米。