【Adv.Funct.Mater.】东华大学李静超|100%小鼠存活率！一种声动力前药激活剂，可诱导协同铁死亡-焦亡级联反应，从而增强胶质母细胞瘤的治疗效果#

文章标题：A Sonodynamic Dual‐Prodrug Semiconducting Nanoactivator Inducing Synergistic Ferroptosis‐Pyroptosis Cascade for Enhanced Glioblastoma Therapy

通讯作者：Anni Zhu, Jiansheng Liu, Jingchao Li

文章链接：https://doi.org/10.1002/adfm.77176

文章概要#

胶质母细胞瘤作为中枢神经系统最具侵袭性的恶性肿瘤，其极高的复发率和对传统疗法的耐受性一直是临床医学面临的巨大挑战。近期发表在著名学术期刊上的研究成果，开发出一种创新的声动力双前药半导体纳米激活剂（SPN FeD @Ang）。该项研究成功克服了血脑屏障对药物递送的阻碍，通过外源性超声波触发，在小鼠原位胶质母细胞瘤模型中完美实现了铁死亡与焦亡的协同级联放大治疗。实验结果极其惊人，接受该激活剂联合超声治疗的肿瘤小鼠不仅肿瘤生长受到显著抑制，而且在长达30天的观察期内维持了100%的存活率。这一策略不仅为深部颅内肿瘤的高效无创治疗提供了全新范式，更展示了重塑肿瘤免疫微环境、激活全身抗肿瘤免疫的巨大潜力。

引言#

胶质母细胞瘤的高侵袭性生长和强烈的异质性导致传统的手术切除、放疗和化疗往往难以根除病灶。一方面，绝大多数小分子化疗药物无法穿透结构致密的血脑屏障，导致颅内病灶处的有效药物浓度微乎其微。另一方面，现有的放化疗手段高度依赖诱导细胞凋亡，而胶质母细胞瘤细胞早已进化出极为顽固的抗凋亡机制。近年来，非凋亡形式的程序性细胞死亡方式引发了学术界的广泛关注。铁死亡作为一种依赖铁离子催化、由脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡方式，对代谢活跃的神经胶质瘤细胞展现出独特的杀伤优势。然而，肿瘤细胞内在的强大抗氧化系统往往会削弱单一铁死亡的治疗持久性。与此同时，焦亡作为一种高度促炎性的细胞程序性死亡，能够通过细胞破裂释放大量免疫原性信号。如果能将铁死亡释放的氧化应激转化为激活细胞焦亡的催化剂，将两者进行时间和空间上的精准协同，有望彻底打破胶质母细胞瘤的耐药壁垒。基于此，开发一种能够高效穿越血脑屏障、并在深部脑组织中接受无创外源信号精准触发的递送系统，成为攻克该科学问题的关键。

Design of dual-prodrug SPNFeD@Ang for enhanced GBM therapy. (a) Synthesis routes of SPNFeD@Ang. (b) Schematic illustration of the SPNFeD@Ang-mediated sono-activatable ferroptosis-pyroptosis cascade for synergistic orthotopic glioma therapy.#

主要实验及结论#

研究团队针对上述挑战，精心设计并合成了功能完备的声动力双前药半导体纳米激活剂，如图1所示。该纳米激活剂选择具有优异生物相容性和声动力效应的共轭聚合物PFODBT作为核心骨架，在其内部同时包裹了响应单线态氧断裂的二茂铁铁死亡前药与多柔比星基焦亡前药。为了赋予纳米颗粒主动靶向穿透血脑屏障的能力，激活剂外层通过化学键特异性修饰了血管紧张素类似肽-2（Angiopep-2）。在超声波精准照射下，纳米核心能够高效吸收声能并发生电子空穴分离，产生大量的单线态氧。这些活性氧分子不仅可以直接用于声动力治疗，还能作为分子剪刀精准剪断两种前药的响应键，从而在病灶区域实现按需的药物释放与细胞死亡级联放大。

SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang characterization. (a) Characterization of the morphology of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang by TEM. (b) Hydrodynamic diameters of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang. (c) Zeta potential analysis of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang (n = 3). (d) UV–vis absorbance spectra of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang. (e) Analysis of the fluorescence property of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang. (f) Sonodynamic property evaluation of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang using 1O2 probe after US treatment (n = 3). (g) Evaluation of SPNFeD@Ang-mediated ferroptosis-associated ·OH production using TMB (inserts are the photographs of solutions). (h) Cumulative DOX release percentages from SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang at pH 7.4 and 5.5 with or without US irradiation (n = 3). Data are presented as mean ± SD. Statistical comparisons were performed using two-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test, ***p < 0.001.#

为了验证该纳米平台的物理化学性质与刺激响应能力，研究人员进行了系统的表征实验，如图2所示。在透射电镜下可以清晰地观察到，所构建的各种纳米颗粒均呈现规则的球形形貌。水动力粒径测试结果表明，功能完备的完全体纳米激活剂其平均粒径约为56.5纳米，这一尺寸非常有利于其在体内的长循环与靶向富集。在存储长达14天后，其粒径和多分散指数几乎没有发生变化，证明其具备优异的胶体稳定性。同时，溶血实验证实其溶血率远低于安全阈值5%，展现出良好的血液相容性。在至关重要的催化性能测试中，随着超声照射时间的延长，SOSG探针的荧光强度呈线性增强，证实了该半导体聚合物极佳的单线态氧生成效率。更重要的是，在过氧化氢存在下，含有二茂铁前药的组分在超声催化下展现出显著的羟基自由基释放，成功触发了芬顿样氧化反应。药物释放动力学表明，在模拟肿瘤微环境的酸性及超声刺激下，焦亡前药的累积释放率可超过90%，而在无刺激的正常生理条件下则保持高度稳定。

在细胞层面的作用机制研究中，研究团队深入探讨了该系统在体外的抗肿瘤协同效应，如图3所示。流式细胞术与微观成像表明，由于Angiopep-2与胶质瘤细胞表面低密度 lipoproteor 受体相关蛋白-1（LRP-1）的特异性结合，纳米激活剂在细胞内的富集量相比未修饰组显著提升，这种高效的内吞靶向性在竞争抑制实验中得到了进一步证实。当给予超声照射后，联合治疗组的GL261胶质瘤细胞活性急剧下降至26.1%，显著优于各单前药对照组。机制探索表明，细胞内的活性氧水平在声动力和芬顿反应的双重作用下飙升了14.3倍。通过对铁死亡关键指标的定量检测发现，细胞内谷胱甘肽（GSH）被剧烈消耗，脂质过氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）水平大幅度升高，且免疫印迹结果显示GPX4蛋白表达显著下调而ACSL4蛋白显著上调，确证了铁死亡的成功诱导。在焦亡层面，联合治疗组观察到全长GSDME蛋白被特异性切割，产生了大量具有成孔活性的N端断裂片段，细胞呈现出明显的肿胀、出泡及膜破裂等典型焦亡形态。令人兴奋的是，当加入铁死亡抑制剂后，焦亡关键蛋白的表达受到了明显抑制，这有力地证明了铁死亡所诱导的强烈氧化应激可以作为上游放大器正向激活并增强细胞焦亡通路。此外，这种强烈的级联死亡引发了显著的免疫原性细胞死亡（ICD），表现为ATP的大量分泌、HMGB1的释放以及细胞膜表面钙网蛋白（CRT）的强烈易位。

Assessment of BBB crossing efficacy and orthotopic glioma accumulation. (a) Fluorescence images showing the uptake of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang by GL261 cells. (b) Analysis of cellular uptake for bEnd.3 cells. (c) Fluorescence signal quantification in bEnd.3 cells following incubation with SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang (n = 5). (d) Schematic illustration of the transwell system for the BBB crossing evaluation. (e) Analysis of fluorescence signals in GL261 cells in the lower chamber. (f) Assessment of GL261 cells in the lower chamber treated with SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang using flow cytometry. (g) Evaluation of the nanoactivator accumulation in orthotopic gliomas after injection of SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang (tumor regions indicated by black dashed circles). (h) Quantification of fluorescence signals in gliomas at different post-administration time points (n = 5). (i) Representative fluorescence images and corresponding signal quantification of harvested brain tissues in orthotopic glioma-bearing C57BL/6 mice (n = 5). Data are presented as mean ± SD. Statistical comparisons were performed using one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test, *** p < 0.001.#

随后，研究人员对该激活剂跨越血脑屏障及在体内肿瘤部位的富集能力进行了阶梯式验证，如图4所示。在脑内内皮细胞与胶质瘤细胞共培养的Transwell体外血脑屏障模型中，Angiopep-2修饰组展现出极强的穿透跨膜能力，下层细胞的荧光捕获强度提高了1.5倍。在活体原位胶质母细胞瘤小鼠模型中，通过小鼠在体荧光成像系统进行了长时间的人体器官追踪。结果清晰显示，静脉注射纳米激活剂后，颅内肿瘤区域的荧光信号随时间推移持续增强，并在24小时达到峰值，其荧光强度显著超越了无靶向肽的对照组。离体器官的荧光定量分析进一步证实了其在脑部肿瘤组织的特异性靶向和高效富集。

Evaluation of anti-glioma performance in orthotopic GBM-bearing mice. (a) Schematic illustration of orthotopic glioma inoculation and the treatment regimen involving nanoactivator administration and US irradiation. (b) BL imaging analysis of orthotopic glioma-bearing mouse models at days 0, 7, and 14 after undergoing different treatments (n = 5). (c) BL signal quantification in orthotopic gliomas (n = 5). (d) Variations in body weight of treated mice bearing orthotopic gliomas (n = 5). (e) Cumulative survival rates of mice bearing orthotopic gliomas (n = 5). (f) Examination of H&E-stained tumor tissues in glioma-bearing mice (tumor regions indicated by black circles). Data are presented as mean ± SD. Statistical comparisons were performed using one-way or two-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. Survival differences were analyzed using the Kaplan-Meier method with the log-rank test. p < 0.01, * p < 0.001.#

紧接着，研究团队在活体动物体内开展了决定性的抗肿瘤疗效评估，如图5所示。他们建立了原位荷瘤小鼠模型，并将其随机分为十个治疗组。通过活体生物发光成像技术密切追踪颅内肿瘤的生长动态。结果显示，在长达14天的常规疗程内，未经有效治疗的对照组小鼠颅内肿瘤呈指数级恶性膨胀。与之形成鲜明对比的是，完全体纳米激活剂配合超声照射的治疗组，其生物发光信号被极其显著地压制，肿瘤体积缩减至对照组的数十分之一。在生存期指标上，联合治疗组展现出了极其震撼的突破：在长达30天的整个生存期监测窗口内，该组小鼠的存活率高达100%，而其余所有对照组小鼠均在早期相继因肿瘤压迫死亡。组织学切片进一步证实，该治疗导致了颅内肿瘤大范围的细胞坏死与组织崩解。

In vivo evaluation of anti-glioma mechanisms. (a) ROS generation fluorescence signals in orthotopic glioma mice after inoculation with SPNFe@Ang, SPND@Ang, SPNFeD, and SPNFeD@Ang with and without US irradiation. (b) ATP level analysis in orthotopic gliomas (n = 5). (c) CRT fluorescence images in orthotopic glioma tissues. (d) Evaluation of CRT fluorescence intensity in orthotopic gliomas (n = 5). (e) HMGB1 staining images of orthotopic gliomas. (f) Fluorescence intensity of HMGB1 in orthotopic glioma mice (n = 5). (g) GSH level analysis of glioma (n = 5). (h) Relative MDA levels in gliomas (n = 5). (i) Representative WB analysis of the expression of GPX4, ACSL4, GSDME-FL, and GSDME-N in orthotopic gliomas. Data are presented as mean ± SD. Statistical comparisons were performed using one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test, p < 0.01, * p < 0.001.#

为了揭示其在活体体内层面的协同杀伤与免疫激活机制，研究人员进行了深度的组织化学检测，如图6所示。活体肿瘤组织荧光染色证实，超声照射在瘤体内部精准激发了极其强烈的绿色活性氧荧光。体内的谷胱甘肽水平被消耗至基线，而脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的含量则飙升了数倍。组织蛋白印迹结果高度吻合体外机制，完美重现了体内GPX4下调、ACSL4上调以及GSDME向N端活性片段转化的高效催化过程。与此同时，体内肿瘤区域的ATP、CRT及HMGB1等免疫原性信号荧光均达到各组最高点，表明级联治疗在小鼠颅内成功点燃了强烈的免疫火种。

In vivo assessment of immune response. (a) Flow cytometric analysis of mature DCs in tumor-draining lymph nodes (TDLNs) following various treatments. (b) Analysis of CD3+CD4+ T cells in the spleen of orthotopic glioma mice. (c) Quantification of CD3+CD8+ T cells in spleen. (d) Evaluation of splenic Treg cell proportions after different treatments. (e) Immunofluorescence assessment of tumor sections with CD4 staining. (f) Evaluation of CD8 levels in gliomas via immunofluorescence images. (g) Fluorescence intensity of CD4 staining in orthotopic gliomas after different treatments (n = 5). (h) Quantification of CD8 fluorescence intensity in glioma tissues (n = 5). (i) Representative images of orthotopic gliomas stained for Foxp3. Data are presented as mean ± SD. Statistical comparisons were performed using one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test, p < 0.01, * p < 0.001.#

这种局部的免疫原性释放成功转化为全身性的抗肿瘤免疫应答，相关免疫微环境重塑的定量考核如图7所示。流式细胞术分析表明，肿瘤引流淋巴结中的成熟树突状细胞（DCs）比例显著飙升至30.2%，极大增强了抗原递呈效率。同时，小鼠脾脏中的外周效应CD4+ T细胞与CD8+ T细胞比例显著升高，分别达到了52.3%和39.1%，而具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Treg）的比例则被剧烈压缩至12.5%。更关键的是，脑部免疫荧光切片清晰表明，外周被激活的CD4+和CD8+ T细胞跨越血脑屏障，大量浸润至颅内肿瘤核心部位，而局部的Treg细胞几乎消失，成功将胶质母细胞瘤标志性的免疫“冷肿瘤”彻底转化为对免疫治疗高度敏感的“热肿瘤”。

总结及展望#

综上所述，该项研究成功构筑了一种具备极强血脑屏障穿透能力和声氧双重响应的纳米激活剂，开创了声动力治疗联合铁死亡与焦亡级联放大的抗肿瘤新策略。该系统不仅在原位胶质母细胞瘤小鼠模型中实现了100%的长期存活率，更展现出了完美的生物安全性。常规血常规、血生化指标以及主要脏器的TUNEL和神经炎症荧光染色均未见任何异常，确保了该方案的临床转化潜力。未来，这一无创、高效且能深度唤醒全身免疫微环境的纳米平台，有望进一步拓展至其他临床难以手术切除的深部恶性固体肿瘤的精准治疗中，为突破现代肿瘤医学的耐药与递送瓶颈提供全新的理论依据与技术支撑。