【Small】大连理工彭孝军院士团队|基于新型分子框架构建近红外聚集诱导发光材料，用于帕金森病小鼠脑内脂滴积累成像
文章标题：Constructing a NIR AIEgen Based on the Novel Molecular Framework for Imaging Lipid Droplet Accumulation in Parkinson’s Disease Mouse Brain
通讯作者：Haidong Li, Jiangli Fan
文章概要
神经退行性疾病的病理机制复杂，其中帕金森病（PD）的发生与脑内脂质滴（LDs）的异常积聚密切相关。为了能够实时、特异性地监测这一动态过程，研究团队通过严谨的逐步分子设计策略，首次构建了一款基于新型香豆素衍生物骨架的近红外聚集诱导发光（AIE）荧光探针QCN-TP。该探针展现出极高的极性敏感性、高达150至280纳米的斯托克斯位移以及出色的血脑屏障渗透能力，不仅成功在细胞模型中实现了对脂质滴变化的实时捕获，更在活体帕金森病模型小鼠的脑组织中清晰可视化了脂质滴的异常积聚现象，为帕金森病的病理研究及早期药物筛选提供了极具价值的分子影像学工具。
引言
帕金森病作为全球第二大类神经退行性疾病，严重影响着老年群体的生活质量，其病理特征主要表现为黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失。尽管其确切病因尚不完全明晰，但越来越多的科学证据表明，神经炎症、氧化应激以及脂质代谢功能障碍在疾病的发生发展中扮演了关键角色。大脑是哺乳动物体内脂质含量仅次于脂肪组织的器官，脂质代谢的稳态直接影响着神经元的生理功能。当线粒体功能受损或细胞面临氧化应激时，细胞内的脂质滴会发生异常积聚，进而恶化神经毒性并加速帕金森病的进程。因此，在活体或深层组织中实时追踪脂质滴的动态变化具有极其重要的临床前研究意义。然而，现有的脂质滴荧光染料常常受限于短发射波长、高背景噪音、聚集淬灭效应（ACQ）以及极弱的血脑屏障穿透力。针对这一科学瓶颈，开发一种能够高效跨越血脑屏障且兼具近红外发射与AIE特性的专用探针显得尤为迫切。
(A) Step-by-step design strategy for the construction of molecular probe, QCN-TP. (B) Accumulation of lipid droplets in the brain of Parkinson’s disease. (C) Construction and validation of a Parkinson’s disease mouse model using probe QCN-TP.
主要实验及结论
本研究的核心成果围绕探针的分子构筑、光物理特性验证以及多级生物成像展开，各项结论在图表中得到了严密的互证。为了获得理想的近红外发光和优异的亲脂性，研究人员首先在香豆素骨架上引入氰基以增强其电子受体能力，并通过氮原子取代构筑了D-π-A型分子结构。为了克服传统染料在高浓度下的淬灭效应，团队通过引入乙基以及具有强电子供体能力的三苯胺片段，不仅显著拉大了空间位阻以诱导AIE效应，还进一步赋予了分子针对脂质滴的靶向特性，最终成功合成了目标探针QCN-TP。这一分子的核心设计逻辑与光谱响应规律如Scheme 1所示，清晰展示了从分子剪裁到成功应用于帕金森小鼠脑部成像的完整链条。
(A) Absorption spectra of QCN-TP (10 µM) in the different solvents. (B) Fluorescence spectra of QCN-TP (10 µM) in the different solvents. (C) Fluorescence lifetime of QCN-TP (10 µM) in a mixture of MeOH/1, 4-dioxane with different MeOH volume fractions. (D) Absorption and fluorescence (E) spectra of QCN-TP (10 µM) in a mixture of MeOH/1, 4-dioxane with different MeOH volume fractions. (F) Fluorescence spectra of QCN-TP (10 µM) in a mixture of MeOH/glycerin with different glycerin fractions. (G) Absorption spectra of QCN-TP (10 µM) a mixture of MeCN and water. λex = 450, λem = 400–900, slit widths:5 nm. (H) Fluorescence intensity of QCN-TP (10 µM) in a mixture of MeCN/water with different water fractions. (I) Frontier molecular orbitals and relative energies of QCN-TP.
在光物理性质测试中，QCN-TP表现出了极其独特的极性敏感性与聚集诱导发光特性。如图1所示，探针在不同极性溶剂中的吸收波长保持相对稳定，但其荧光发射光谱却对环境极性变化产生了剧烈响应，发射峰随极性降低显著蓝移且强度激增。在甲醇与1,4-二氧六环的混合体系中，随着低极性组分增加，荧光强度实现了惊人的88倍增长，发光寿命也由0.15纳秒大幅延长至1.47纳秒，这证实了其在疏水性脂质环境中的强发光优势。同时，在乙腈和水的混合溶液中，当水体积分数超过60%时，由于分子在不良溶剂中发生聚集，其荧光强度在经历短暂的极性淬灭后表现出了典型的AIE增强回升，且伴随着吸收光谱的明显红移，充分证明了聚集体的形成。此外，高达150至280纳米的超大斯托克斯位移有效规避了荧光自吸收现象，保障了生物成像的高信噪比。
(A) Cellular uptake of QCN-TP (20 µM) and its fluorescence intensity in (A) SH-SY5Y cells, (B) 4T1 cells, and (C) NIH 3T3 cells. (λex: 488 nm, λem: 600–720 nm, scale bars: 20 µm). (D) SH-SY5Y cells co-stained with QCN-TP and BODIPY 493/503 (5 µM, λex: 488 nm, λem: 503–590 nm) (Pearson Correlation Coefficient: 0.83) scale bars: 20 µm. (t-tests, n = 5, mean ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
随后，研究团队在细胞层面上验证了探针的生物相容性与靶向精准度。如图2所示，细胞毒性试验表明，即使在高达80微摩尔的浓度下孵育，三种测试细胞系的存活率依然接近百分之百，展现出极低的细胞毒性。在共聚焦显微成像中，QCN-TP能够高效进入神经细胞，并与商用脂质滴特定染料BODIPY 493/503呈现出高度的重合性，皮尔逊相关系数高达0.83，而与线粒体或溶酶体染料的重合度极低，这无可辩驳地证实了其对细胞内脂质滴的高度选择性特异性识别能力。
(A) Schematic diagram of QCN-TP for imaging intracellular LDs. (B) Blank group: fluorescence imaging of SH-SY5Y cells pre-treated with PBS, and add QCN-TP (10 µM). (C) Fluorescence imaging of SH-SY5Y cells pre-treated with LPS (50 µg/ml) and add QCN-TP (10 µM). (D) Fluorescence imaging of SH-SY5Y cells pre-treated with OA (50 µM), and add QCN-TP (10 µM). (E) Fluorescence imaging of SH-SY5Y cells pre-treated with MPP+ (200 µM) for, and add QCN-TP (10 µM). (F) Relative fluorescence intensity analysis of QCN-TP (10 µM) in SH-SY5Y cells after pre-treated with PBS, OA (50 µM, 6 h), and MPP+ (200 µM, 24 h), respectively. (λex: 488 nm, λem: 600–720 nm, scale bars: 20 µm). (t-tests, n = 5, mean ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
为了进一步模拟病理状态下脂质滴的动态演变，研究者利用不同试剂对细胞进行了干预处理。如图3所示，相较于对照组，利用油酸处理诱导脂质积聚的细胞或利用脂多糖引发炎症反应的细胞，其内部的红色荧光信号均出现了显著的增强，脂质滴的数量和体积明显上升。更重要的是，在利用帕金森病细胞诱导剂MPP+处理的神经细胞模型中，探针捕捉到了强烈的荧光信号回馈，定量分析证实其荧光响应与细胞内的脂质失衡积聚程度完全正相关，表明该探针具备优秀的实时疾病诊断诊断潜力。
(A) Overall process: PD mice modeling and imaging. (B) In vivo imaging of different groups after tails intravenous injection of QCN-TP (150, λex: 450 nm, λem: 700 nm). (C) Fluorescence intensity changes of brain over time. (D) Fluorescence imaging of brain slices in different groups (the slices incubated with 50 µM QCN-TP, λex: 488 nm, λem: 600–720 nm), scale bar = 100 µm. (E) Relative fluorescence intensities of images shown in (D). (F) Fluorescence imaging of brains in different groups (the brains incubated with 200 µM QCN-TP, λex: 450 nm, λem: 700 nm). (G) Relative luminescence intensities of images shown in (F). (H) Behavioral experiment: movement track, distance and speed in open field experiment; Pole climbing test time; Balance beam test time. (t-tests, n = 3, mean ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
最终，研究推进至要求苛刻的活体小鼠实验阶段。研究人员利用神经毒素MPTP构建了高仿真度的帕金森病小鼠模型，并通过一系列行为学测试以及多巴胺能神经元丢失特异性染色确认了模型的成功建立。如图4所示，在通过尾静脉注射探针QCN-TP后，活体成像系统在小鼠头部捕捉到了清晰的荧光信号，结合其1.92的经典辛醇-水分配系数（logP）以及脑组织匀浆的液相色谱分析，证实该分子凭借适当的分子量和缺乏多余氢键供体的物理特性，成功突破了血脑屏障（BBB）并富集于脑实质中。在活体头骨成像、离体脑组织整体成像以及精细的脑切片共聚焦观察中，帕金森病模型组的脑部荧光强度均显著高于正常野生型对照组，切片的荧光定量分析显示有4至5倍的显著增幅。这一系列确凿的在体数据表明，QCN-TP能够在活体水平上精准映射出帕金森病引起的脑内脂质代谢紊乱。
总结及展望
综上所述，本研究成功开发出一种合成路线简便、光物理性能优异的近红外AIE荧光探针QCN-TP。该探针凭借出色的血脑屏障穿透性以及对疏水非极性环境的敏感特异性，攻克了以往无法在活体深层脑组织中跨尺度可视化脂质滴动态变化的难题，有力地印证了帕金森病发生发展过程中黑质及纹状体区域的脂质失衡表型。这一成果不仅为神经退行性疾病的脂质组学病理研究开辟了全新视角，也为未来的临床前药物评价提供了高效的活体影像学平台。在未来的研究中，团队将继续优化该分子骨架，致力于进一步提升成像的空间分辨率与极限穿透深度，以期在脑实质深区实现单细胞乃至亚细胞分辨率下的脂质动力学完美追踪。