一个世纪以来的共识是，远场显微镜的分辨率根本上受到衍射的限制。恩斯特·阿贝的著名公式

20世纪60年代，人们普遍认为生物膜由脂质双层构成，其两侧表面均覆盖着未折叠的蛋白质单层（戴维森-丹尼利-罗伯逊模型）。20世纪70年代初，这一观点被流动镶嵌模型所取代[1]。基于热力学考虑、膜的蛋白质-脂质比例、电子显微镜研究以及细胞融合实验[2]，流动镶嵌模型假设流体脂质双层构成细胞膜的基础，而膜蛋白则以其自然折叠的构象存在，并附着或嵌入到双层结构中。此外，流动镶嵌模型还暗示膜是流体而非固体，且膜中的脂质和蛋白质在膜平面内具有流动性。膜侧向流动性的深远影响激发了人们寻找验证这一假设的方法。科恩（Cone）将闪光光解与显微吸收测量相结合，以确定视紫红质在感光细胞膜中的旋转和侧向流动性[3]。同时，彼得斯（Peters）等人[4]建立了如今被称为荧光漂白恢复（FRAP）或荧光光漂白恢复（FPR）的方法。在最初的FRAP方法中，使用强光束快速漂白限定膜区域（例如，重新封闭的红细胞膜的半球区域或培养细胞质膜的圆形斑点）的荧光。通过荧光测量记录膜中荧光不均匀性的消散，并据此推导出扩散系数。在接下来的几十年里，FRAP经历了深刻的发展，并衍生出一系列广泛应用于生物医学和物理科学的方法。值得注意的是，最近的一些FRAP相关技术既不再依赖于光漂白，也不再依赖于荧光恢复。

最早的显微镜被用于探索生物样本，早期生物学中的关键发现——如细胞和细胞器的发现——都与显微镜技术的进步息息相关。随着放大倍数的增加，人们很快意识到分辨能力存在根本性的限制。阿贝[1]曾指出：“如果物体（或物体的特征）之间的距离太近，以至于零级和一级衍射光束无法同时进入物镜，那么显微镜就无法分辨这些物体。”他将经验性的“分辨率”概念与可量化的“衍射”术语联系起来，树立了里程碑。然而，在光学分辨率极限之下，还存在着巨大的生物复杂性。如今，接近并探索这个纳米世界——即可见光衍射极限以下长度尺度上的现象集合——已成为许多生命科学家的主要研究方向；事实上，这些努力已经取得了丰硕的成果。与此同时，我们已经知道，生物材料在所有长度尺度上，直至多分子复合物甚至单分子层面，都呈现出模块化的结构。

分子生理学，即对介导复杂细胞反应的分子机器工作原理的理解，需要高光学分辨率来确定事件和反应的位置，高时间分辨率来描绘其动态行为，以及最重要的是，需要一种方法来识别事件或反应本身。现代成像设备和最近的位点特异性染色技术，结合遗传和合成染料，满足了这些时空需求。通过选择研究对象所携带的荧光标记，可以编码其身份。然而，仅从探针的身份难以轻易推断出这些组分在特定反应中的参与方式，即它们的作用。为了获取这一信息，标记荧光必须根据作用于探针的反应改变其特性。所有荧光特性都可用于编码传感功能，并且已经使用了许多基于荧光发射产量、波长或偏振变化的“功能性”染料。另一个可用于感知染料直接分子环境变化（即感知正在发生的反应）的荧光指标是荧光寿命。荧光寿命描述的是激发态的持续时间，即激发与光子发射之间的延迟。下文将描述其优势和特性。测量和映射荧光寿命的成像技术称为荧光寿命成像显微镜（FLIM）。荧光寿命最有用的特性之一是它能够提供荧光探针衰减动力学的视角。这一特性可用于检测和量化生命科学家们极为关注且广泛应用的一种光物理现象：弗斯特共振能量转移（FRET），即能量从一种荧光团的激发态转移到第二种合适的受体荧光团。这种能量转移可以通过观察耦合系统中荧光团激发态跃迁速率的变化，以及耦合荧光团之间荧光产量的重新分布来观测。本章将概述FRET在生命科学中的起源、结果、测量方法及意义。

外源性荧光探针的种类繁多，各具特色。本节将重点介绍在生命科学研究中应用最广泛的三大主流探针类别：有机小分子染料、荧光蛋白和量子点，并简要介绍一些新兴的探针技术。

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通常，实验程序的成功取决于一种电子书中未详细阐释的操作技术。这往往是因为这类技术过于基础普遍，以至于编写者默认有经验的化学家已熟练掌握。