Localization-Based Super-Resolution Microscopy#

Super-Resolution Microscopy: An Introduction#

自人们知晓原子和分子的存在以来，对它们的检测、操控和控制一直是许多科学家的梦想。早在20世纪80年代，分子或原子与探针的近场相互作用就被应用于扫描隧道显微镜（STM），STM能够实现原子级别的表面成像。STM的发明者格尔德·宾宁（Gerd Binnig）和海因里希·罗厄（Heinrich Rohrer）因此获得了1986年的诺贝尔物理学奖，当时他们都在IBM苏黎世工作。与此同时，对复杂凝聚态物质中单分子的光学检测也引起了科学界的极大兴趣。单分子检测和表征的魅力在于能够研究单个原子或分子与其原始环境之间的相互作用，而不受探针的干扰，也不被集合平均所掩盖。如今，荧光显微镜已成为生物科学和生物医学领域不可或缺的工具，用于细胞和组织的三维非侵入性成像。大多数主要研究机构都在使用各种共聚焦和宽场光学荧光显微镜。除了具有高选择性外，荧光显微镜还表现出极高的灵敏度，能够检测和识别单个分子，并以高时间分辨率监测分子间和分子内的相互作用（见第12章和第13章）。

然而，传统的集合荧光显微镜和单分子荧光显微镜只能在两个相邻发光物体相隔约所用光的波长时实现空间分辨率。也就是说，空间分辨结构的能力存在物理极限，这是由光的波动性引起的。由于衍射，聚焦光总是会产生一个模糊的斑点，其大小决定了分辨率。早在19世纪末，阿贝（Abbe）就证明衍射极限与光的波长成正比，与观察到的光的角分布成反比 [1]。因此，任何基于透镜的显微镜都无法在成像平面上分辨出距离小于光波长一半的物体，即对于可见光来说，其范围约为200纳米。

光学显微镜的空间分辨率极限也可以用点扩散函数（PSF）来解释。由于光通过孔径时发生衍射，单个荧光团的荧光信号在荧光显微镜的成像平面上会产生艾里斑（Airy pattern）（第2章）。这种图像的尺寸比荧光团本身大得多，由光的波长和孔径的大小决定。通过将单个发射体的PSF近似为二维高斯函数，可以精确确定其质心（即x、y坐标），从而在空间中定位发射体。

由于定位精度主要取决于收集到的光子数量以及在背景噪声可忽略时PSF的标准差（见第12章，12.4.1节），能够发射数千个荧光光子的单个荧光团可以以纳米级精度进行定位。因此，具有纳米级精度的荧光成像（FIONA）是可能的，并已成功用于监测与肌球蛋白结合的单个荧光团沿肌动蛋白丝的迁移 [2]。然而，两个相距小于𝜆/2的相邻荧光团无法被区分开来，因此它们无法被定位为单个发射体。20世纪90年代初，人们开发了首个绕过这种“自然”衍射极限的概念，用于测量距离小于衍射极限的单个荧光团之间的距离。这些所谓的超高分辨率共定位研究利用了正交的光谱特性（如荧光发射波长或荧光寿命）来分离独立的荧光团。类似地，也可以利用荧光团的逐步光漂白来测定距离小于衍射极限的单个荧光团之间的距离。

在本章中，我们将专注于基于光可切换荧光团的单分子定位显微镜（SMLM）。我们将描述二维和三维超分辨率成像的历史发展和基本原理，包括活细胞成像、图像重建和定量分析。我们还将讨论该技术的优势和局限性。

The Principle of Single-Molecule Localization Microscopy#

在进行单分子定位显微镜（SMLM）实验时，通常会遇到荧光的开关切换和光漂白现象。即使持续受到激发，单个荧光团的发射行为也像随机电报信号一样，即在随机时间以随机时长进行开关切换，通常被称为闪烁。这一现象是单个量子系统的特征：两个或多个独立发光的荧光团无法在没有任何同步的情况下同时开关。

然而，这些荧光间歇性可以被有利地利用，以在时间域内分离两个相邻荧光团的荧光发射，它们的点扩散函数（PSF）存在重叠。这一分辨率增强的关键要素（见附框8.1）于2005年被引入 [10]，利用了单个半导体纳米晶体（量子点）的闪烁特性。如果闪烁过程允许对单个PSF进行空间隔离拟合（定位），则可以重建一个由单独定位的点组成的人工“图像”，该图像展现出亚衍射空间分辨率，从而诞生了“点彩派”（Pointillism）这一术语 [10]。这一发现为所有SMLM概念奠定了基础。为了精确确定位置，即拟合理想的PSF以匹配测量到的光子分布，处于活跃（荧光）状态的荧光团必须相隔足够远，超过显微镜的分辨率。也就是说，在实验的任何时刻，只有一小部分荧光团是荧光的，而大多数荧光团必须处于非荧光的关闭状态。

因此，所有SMLM方法的基本原理是相同的：用荧光探针标记感兴趣的靶标，并使用宽场荧光显微镜（第3章）进行成像。通过适当波长的光照射，诱导荧光探针在荧光“开”和非荧光“关”状态之间随机转换，并记录通常包含数万张图像的序列（堆叠）。在这些同一样本的每张图像中，只有总荧光团群体中非常稀疏的子集被激活（荧光）并成像。因此，在堆叠的任何单张图像中都无法看到任何结构；然而，通过精确定位每张图像中每个荧光团的位置，并叠加所有荧光团的位置，可以重建出高分辨率图像（图8.1）。

为了确保在实验的任何时刻只有稀疏的荧光团子集发出荧光，需要使用光可切换、光可激活或光可转换的合成荧光团或荧光蛋白。理想情况下，处于活跃状态（即“开”状态）的荧光团浓度足够低，以确保它们之间的大多数间距超过分辨率极限。读取单个荧光团的荧光，并在下一批荧光团被激活之前，将荧光团光漂白或光切换到“关”状态。所有定位显微镜方法都采用这种操作方式，主要区别在于所使用的荧光团类型。dSTORM及其相关方法使用标准有机荧光团，而PALM则采用光可激活荧光蛋白（PA-FPs）。后者能够实现接近100%的化学计量比蛋白标记，但受限于每个荧光蛋白在漂白前只能发射几百个可检测光子。前者主要用于化学染色，其标记效率较低，但每个周期的亮度超过1000个光子，且光稳定性更高，从而允许更高的定位精度 [11]。

荧光发射的开关切换也可以根据其背后的物理或化学过程（例如，仅通过光的光切换与光结合化学添加剂的光切换）、可逆性以及涉及的暗态的性质（图8.2）来区分：

光可激活/光可转换荧光团：不可逆的光诱导激活，通常涉及化学键断裂。
光可切换荧光团：可逆的光诱导切换，通常源于顺反异构化步骤或质子转移。
反应诱导的光切换：非光切换荧光团可以通过涉及外源反应物（添加剂；例如，通过氧化还原化学）的化学反应作为光切换使用。

值得注意的是，最近开发了许多非常相似的超分辨率技术，这些技术也对单个发射体进行定位，但通过单个荧光团从溶液中的瞬态结合事件实现时间分离（附框8.2）。

Photoactivatable and Photoconvertible Probes#

在单分子定位显微镜（SMLM）中，荧光蛋白是一类重要且相关的荧光团，其中光可激活的绿色荧光蛋白（paGFP）是最早的代表 [12]。成熟后，paGFP在其天然状态下在约400纳米处表现出一个单一且强烈的吸收带，但荧光较弱。当用400纳米的光照射时，400纳米吸收带的振幅减小，同时出现了绿色荧光蛋白（GFP）的第二个且众所周知的吸收带，峰值在492纳米。从机制上讲，400纳米的光照射诱导了化学键的断裂，并导致paGFP中色团附近的谷氨酸残基发生脱羧反应。色团的纳米环境改变影响了paGFP的光物理特性，使其转变为荧光状态。其他荧光蛋白也可以经历光诱导的光转换，这是一种不可逆的转变，从一种荧光状态转变为另一种具有不同光谱特性（即不同颜色）的荧光状态。这类蛋白的例子包括Kaede、EosFP和IrisFP（第4章）。迄今为止，许多其他荧光蛋白已被改造为光可激活或光可转换的探针。

不可逆光激活不仅限于荧光蛋白。许多研究团队已成功展示了有机荧光团的高效化学猝灭。在这些笼状荧光团中，猝灭基团可以通过适当波长（通常是紫外光）的光照射被裂解。

Intrinsically Photoswitchable Probes#

第二类荧光团通过光照射表现出固有的可逆开关特性。可逆光切换现象既存在于荧光蛋白（如EYFP或Dronpa）中，也存在于大量光致变色分子中（见第4章）。迄今为止，具有内在光切换特性的荧光蛋白在单分子定位显微镜（SMLM）中一直发挥着重要作用。通常，使用两种波长来实现荧光团在荧光“开启”和非荧光“关闭”状态之间的切换：第一种波长用于读取信号并将荧光团切换至非荧光状态（Dronpa为488纳米，EYFP为514纳米），第二种波长则用于重新激活荧光团（EYFP和Dronpa均为405纳米）。可逆光切换的潜在机制是分子内的过程，包括例如质子转移和/或顺反异构化。

Photoswitching of Organic Fluorophores by Chemical Reactions#

一种非常通用且因此极具吸引力的方法是使用标准有机荧光团，其荧光可以通过光诱导的化学反应在“开启”和“关闭”状态之间进行调节。通过这种方式，荧光团可以被“编程”并作为光开关使用，而光开关的特性则可以通过化学添加剂及其浓度进行调节。诱导合成有机荧光团光开关的常见方法是氧化还原化学，通常通过在样品缓冲液中添加适当浓度的还原剂来实现，例如硫醇（10-200 mM）、抗坏血酸（50-100 μM）或膦（25 mM）[11]。其中，利用毫摩尔浓度的硫醇在存在（STORM）[7]或不存在第二种较短波长荧光团的情况下（dSTORM）[8]实现有机荧光团的光开关是最成熟的技术。

通过对各类合成荧光团的研究，构建了基于硫醇诱导的氧化还原光开关机制，为dSTORM提供了理论基础（见图8.3）。研究发现，荧光团首先被还原，生成一个自由基阴离子（非荧光态），即使在水性样品缓冲液中，这种自由基阴离子也相当稳定，并代表了光开关的非荧光态。水性缓冲液中的氧气可能会使自由基阴离子重新氧化，从而恢复荧光团的荧光态[11]。根据荧光团的化学结构，光开关过程中还可能涉及其他非荧光态。例如，碳氰荧光团可以在长时间照射下与硫醇发生反应，攻击其聚甲撑桥而形成加合物；而氧杂蒽荧光团（如ATTO655）可以通过转移两个电子进入完全还原态。许多罗丹明荧光团（如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 568、ATTO488、ATTO532、ATTO565）会形成稳定的自由基物种，这一现象可以通过电子顺磁共振（EPR）和紫外-可见光谱进行观察。这些自由基离子在水溶液中的稳定性可达数分钟甚至数小时。与paGFP类似，用合适波长的光照射自由基离子，可以使荧光团重新恢复到荧光态。

Experimental Setup for Localization Microscopy#

精确定位单个荧光团的位置需要高荧光信号和极低的背景信号。通常，倒置荧光显微镜会配备高数值孔径（NA）的物镜（见第2章）。由于具有更高的信噪比（SNR），数值孔径（NA）≥1.45的油浸物镜常用于全内反射荧光（TIRF）显微镜（详细信息见附录12.2），该技术通过将荧光团的激发限制在靠近表面的薄层渐逝场（100-200纳米）内，从而最大限度地减少背景光。通过采用宽场配置，该方案可以扩展到三维或全细胞成像，尽管这会以降低信噪比为代价，进而导致定位精度和最终图像分辨率降低。对于细胞内超分辨率成像，通常使用水浸物镜。

荧光团通过激光激发，激光的波长位于其吸收光谱范围内（例如488纳米、514纳米、532纳米、568纳米或640纳米），以诱导荧光；同时，405纳米的激光用于将荧光团从“关闭”状态切换到“开启”状态。激发光强度在0.5-50千瓦/平方厘米范围内变化，而用于从“关闭”到“开启”状态的光切换、光激活或光转换的光强度则低于0.1千瓦/平方厘米。在检测路径中，荧光信号通过合适的带通滤光片进行过滤，并通过灵敏的相机成像，例如量子效率在可见光范围内为80%-90%的电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机，或者科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机。为了在保留荧光信号数据中的大部分位置信息的同时将散粒噪声降至最低，通常会使用约为光学系统阿贝分辨率极限0.4倍的像素尺寸。因此，典型的图像像素大小约为100纳米，这是通过物镜与管镜组合，以及可能在检测路径中的第二级放大实现的。图8.4展示了一张哺乳动物COS-7细胞中微管网络的dSTORM图像。该图像使用sCMOS相机拍摄，目前这种相机是最有希望用于高帧率、高分辨率全细胞成像的检测设备。

尽管使用光激活荧光蛋白（PA-FP）或有机荧光团的单分子定位显微镜（SMLM）实验基于相同的基本原理，但实验的初始情况却大不相同。在实验开始时，光激活荧光蛋白通常是非荧光的，这使得通过用于光激活的激光（通常为405纳米）的照射强度可以精确控制荧光分子的密度。相比之下，使用有机荧光团进行SMLM实验需要在实验开始时高效地将荧光团转移到一个可逆且相对稳定的“关闭”状态，同时避免对样本造成光损伤以及荧光团的光漂白。因此，对于合成荧光团而言，一个高度可靠且可逆的光切换机制、稳定的“关闭”状态以及适当的光切换速率至关重要。

Optical Resolution and Imaging Artifacts#

需要牢记的是，从单分子定位显微镜（SMLM）数据中提取的结构信息不仅取决于定位精度，还取决于标记密度。根据信息论，荧光探针的密度必须足够高，以满足奈奎斯特-香农采样定理[17]。简而言之，该定理指出，相邻荧光团之间的平均距离（采样间隔）必须至少是期望的结构分辨率的两倍。例如，要解析一维中20纳米的结构特征，荧光团的定位间隔至少需要为10纳米。对于二维结构，需要的标记密度约为每平方微米1万（10⁴）个荧光团，或者在衍射受限区域内约有600个荧光团。为了检测单个荧光团，同一时间应只有一个荧光团处于荧光状态（见图8.5）。

这意味着“关闭”状态的寿命必须显著长于“开启”状态的寿命，换句话说，光切换比值 r = koff/kon 必须足够高，以最大限度减少错误的多荧光团定位（见图8.5）。如果荧光团沿单根纤维排列，错误定位不会影响与纤维延伸方向垂直的结构分辨率。然而，如果两个相邻荧光团位于交叉纤维上，错误定位将影响对这两根纤维的独立解析能力。因此，由于光切换速率不合适或荧光团密度过高而产生的错误定位，可能会导致荧光团聚集的假象，而不是清晰地揭示出可能携带囊泡的交叉细胞骨架纤维（见图8.5）。

在实际操作中，荧光斑点的密度应远低于每平方微米1个发射体，以便可靠地检测和拟合斑点。如果由于某种原因（例如为了在活细胞实验中提高时间分辨率）增加了发射体密度，那么重叠的点扩散函数（PSF）数量也会增加。这些定位误差会以伪影的形式出现在重建的超分辨率图像中，可能导致特征无法解析和误判。一种可能的解决方案是采用如daoSTORM和压缩感知等算法，这些算法可以在每平方微米最多10个发射体的密度下，以可接受的误差率进行处理。

Fluorescence Labeling for Super-Resolution Microscopy#

Label Size versus Structural Resolution#

由于荧光标记在第4章中已有详细讨论，以下讨论将专注于与单分子定位显微镜（SMLM）相关的方面。由于荧光团的密度决定了可实现的结构分辨率，因此高效且特异性地使用小荧光探针进行标记是超分辨率成像的另一个关键因素。光激活荧光蛋白（PA-FPs）无疑是活细胞SMLM的首选标记物，因为它们可以与目标蛋白进行遗传融合。在理想情况下，每个蛋白携带一个荧光团，并且保持野生型的功能。然而，荧光蛋白的质量约为27千道尔顿，呈桶状结构，尺寸为2-5纳米（见图8.6），可能会干扰蛋白的功能。此外，除了少数例外情况外，它们无法直接扩展到其他生物分子类别，包括脂质、核酸、糖类和次级代谢产物，且其荧光特性并非最优。

有机荧光团，例如罗丹明或碳氰染料，尺寸要小得多（约1纳米）（见图8.6）。它们具有更高的荧光量子产率和更好的光稳定性，但需要进行化学标记程序（详见第4章）。对于固定细胞，免疫荧光是首选方法，使用一抗和二抗进行标记。然而，常用的免疫球蛋白G抗体尺寸约为10纳米（见图8.6），这可能会降低表位识别的准确性，并增加实际结构的表观尺寸。为了减小标记物的尺寸，可以使用直接标记一抗的方法，或者使用针对GFP的小型荧光团标记的骆驼抗体（纳米抗体）。某些细胞结构可以使用小而特异性的标记物进行靶向，例如，使用鬼笔环肽标记肌动蛋白，或使用紫杉醇标记微管（见图8.6）。

Live-Cell Labeling#

活细胞单分子定位显微镜（SMLM）需要一种能够在活细胞中对蛋白质进行特异性且定量标记的方法，所用的有机荧光团需要能够在细胞的氧化还原环境中实现“开启”和“关闭”状态之间的切换。由于活细胞的细胞质中天然存在毫摩尔浓度的还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG），因此许多Alexa Fluor和ATTO染料可以用于dSTORM定位显微镜[11]。通过结合遗传编码的多肽标签和有机荧光团配体，可以在活细胞中实现蛋白质的翻译后标记[20]。然而，这些方法大多仍使用与荧光蛋白大小相当的大蛋白标签，可能会因空间位阻而干扰蛋白质的功能。例如，HaloTag的质量为35 kDa，SNAP/CLIP标签的质量为20 kDa，DHFR/TMP标签的质量为18 kDa[20]。迄今为止，SNAP、Halo、TMP、CLIP标签与有机荧光团的不同组合已成功与光激活荧光蛋白（PA-FPs）结合，用于多色活细胞定位显微镜。

Click Chemistry#

另一种正在兴起的标记方法非常适合用于高密度标记目标结构，它利用细胞自身的生物合成机制将独特的化学功能嵌入目标分子中[21]。这种所谓的生物正交“点击化学”引发了人们对细胞和生物体中分子选择性共价标记的极大兴趣。最初，点击化学依赖于铜催化的叠氮-炔烃环加成反应，但如今也有无铜的方法可供选择（见图8.6）。由于叠氮和炔烃标签的尺寸较小，修饰后的氨基酸、单糖、核苷酸或脂肪酸可以被活细胞或生物体以高效率代谢性地整合。需要注意的是，点击化学与其他合成标记方法一样，存在标记效率可能未知的缺点。尽管如此，点击化学已成功应用于细胞表面糖链的dSTORM成像[22]（见图8.7）以及新生DNA和RNA的标记[23]。

对于蛋白质的点击化学特异性标记，可以使用一种基于酶促探针连接的方法，称为酶促探针整合（PRIME）[24]。PRIME方法的核心是一种经过改造的大肠杆菌脂酰辅酶A连接酶（LplA），它可以催化将所需的探针共价连接到一个13个氨基酸的识别序列——脂酰辅酶A受体肽（LAP）。在第一步中，通过遗传融合的LAP在细胞中与10-叠氮癸酸特异性连接；在第二步中，荧光团修饰的环辛炔与叠氮基团反应，形成相应的三氮杂双苯环辛炔（ADIBO）。此外，也可以通过整合遗传编码的非天然氨基酸（UAAs）[25]，利用荧光团-四氮杂卓衍生物对细胞内蛋白质进行特异性标记。

Three-Dimensional SMLM#

为了揭示细胞内细胞结构和分子构架的三维信息，单分子定位显微镜（SMLM）中点扩散函数（PSF）的轴对称性必须被打破。在传统显微镜中（假设不存在像差），一个荧光团稍微高于或低于成像平面时，其PSF看起来同样模糊，这阻碍了对荧光团精确轴向位置的提取。为了使成像平面上方和下方的PSF看起来不同，已经开发出多种方法对信号进行调整。其中一些方法已经在单颗粒跟踪中成功应用。由于荧光团发射的时间分离，每次只能成像定义高密度标记结构的少数几个荧光团，因此将这些已建立的方法应用于定位显微镜也是顺理成章的。用于推断信号轴向来源信息的方法大致可以分为四类：（1）散光法，（2）双平面法，（3）PSF分裂为多个瓣，以及（4）干涉法[26]。

Astigmatic Imaging#

散光法通过在显微镜系统的检测路径中引入一个柱面透镜来实现。这种方法会使点扩散函数（PSF）在一个侧向维度上发生拉伸，因为只有一个空间方向被紧密聚焦，而另一个方向则处于失焦状态。在实际应用中，存在一个PSF宽度相等的点（可以设定为z = 0 nm），而来自上方或下方的PSF则分别在x方向和y方向上被拉伸。PSF的取向可以提供大致的轴向位置信息，而通过校准x和y方向上的宽度，可以得到精确的z坐标。这种方法最初用于单颗粒跟踪，后来已广泛应用于单分子定位显微镜（SMLM）。

为了校准失焦行为，通常会将单个荧光团、量子点或小荧光珠吸附在干净的盖玻片上，并在z方向上移动它们，同时记录它们的PSF。在不同轴向位置上获得的x和y方向的PSF宽度会被拟合到一个二阶模型多项式中，该多项式代表一个物理推导模型，或者拟合到一个四阶多项式中，以考虑光学系统的不完美性。为了避免将一个或多或少基于物理的函数拟合到校准数据上，可以创建一个查找表，用于提取实际的轴向位置。

在ImageJ的开源插件QuickPALM中，会确定校准PSF在x和y方向上的标准差，并将已知的z位置与σx - σy绘制出来。得到的直线可用于在测量过程中查找z坐标。

Biplane Imaging#

在双平面成像方法中，检测到的信号被分成两部分，其中一部分信号会引入光学延迟。这两个信号路径可以同时成像在同一相机上，或者如果配备第二个相机，则可以分别检测这两个信号。在后一种方案中，可以保留完整的视场。在这两种方法中，都需要在两个成像平面之间实现轴向位置的相对偏移。轴向位置可以通过比较两个成像平面的清晰度比值来提取。在探测器A和B上检测到的点扩散函数（PSF）宽度编码了z坐标，这与使用散光法时通过x和y方向PSF宽度比值来确定z坐标的方式类似。

Double Helix PSF#

另一种三维单分子定位显微镜（3D SMLM）的方法通过额外的光学元件将荧光团的点扩散函数（PSF）分裂为两个相互旋转的瓣，这种旋转与发光体的轴向位置相关。这种方法最初通过引入一个相位掩模将PSF设计成双螺旋形状，该相位掩模由对偏振敏感的空间光调制器（SLM）创建。由此产生的两个瓣以双螺旋点扩散函数（DH-PSF）的形式相互旋转，这也为该技术命名。随后，有研究提出了一种简化方法，即在物镜孔径中加入相位斜坡，而不是在光路中使用SLM，仅对一半的信号进行处理。这种方法被称为相位斜坡成像定位显微镜（PRILM）。与DH-PSF不同，在PRILM中，一个瓣保持固定，而另一个瓣围绕它旋转。这两种技术的共同点是，它们的可用轴向范围比散光法或双平面成像更大。

Interferometric Imaging#

在干涉型iPALM方法中，样品被放置在两个物镜之间，因此单个荧光团发出的荧光会沿着两条不同的光路传播。利用光的波粒二象性，通过一个三路分束器将这些信号叠加时，每一个光子都会与自身发生干涉。根据荧光团的轴向位置，即它更靠近物镜A还是物镜B，会产生独特的干涉模式，从而提供关于z坐标的精确信息。与亚波长灵敏度相一致，干涉测量法目前能够实现最佳的轴向定位精度，但其轴向测量范围受限于荧光波长的一半左右。

Measures for Improving Imaging Contrast#

大多数三维单分子定位显微镜（3D SMLM）方法使用高数值孔径（NA）的油浸物镜进行表面限制的全内反射（TIRF）照射。另一种非常流行的用于细胞内成像的照射模式，仅适用于油浸物镜，是高度倾斜且层状的光学（HILO）片层显微镜[27]。在HILO技术中，样品被一束高度倾斜且薄的光束照亮，即使在细胞内部，也能实现高照射强度与高信噪比（SNR）的结合。

使用油浸物镜在水性缓冲液中进行成像时，由于折射率的不同，会产生像差。因此，样品的体积图像会沿着光轴方向出现拉伸，这种现象在共聚焦显微镜和单分子定位显微镜中都有很好的描述。可以通过实验或分析方法，通过因子 𝑛buffer/𝑛immersion 对图像进行重新缩放来校正这种拉伸效应。此外，折射率的不匹配还会导致沿z轴的球差，这种像差更难以校正。通过调整成像缓冲液的折射率[28]，或者使用与折射率匹配的浸没介质的物镜（例如，用于组织成像的甘油浸物镜或用于贴壁细胞的水浸物镜），可以避免这两种类型的像差。

对一个较大的三维体积进行完整成像所需的时间明显长于单次二维快照，因为需要对多个层面进行成像。随着成像时间的延长，装置更容易受到样品的热漂移或机械漂移的影响，这会影响数据的解释。可以通过在样品腔中添加标记物来补偿样品漂移。这些标记物的位置可以在每张单独的图像中记录下来，通过在实验过程中跟踪它们的位置，可以校正样品漂移。三维漂移校正需要标记物在样品的三维空间内固定不动。这可以通过使用折射率接近水的水凝胶来实现，研究表明，100纳米的标记物可以在这种水凝胶中稳定固定，并在三维空间中均匀分布，即使在细胞附近也能保持稳定[29]。多色单分子定位显微镜实验还可以从使用多光谱标记物中受益，这些标记物作为不同光谱图像配准的参考信号。

SMLM Software#

与其他超分辨率技术不同，单分子定位显微镜（SMLM）需要对原始图像数据进行处理，以生成最终的图像。图像处理的第一步旨在识别单个荧光团的发射模式，并以高精度确定它们的位置。SMLM方法提供的便捷和快速的数据采集增加了对快速、可靠的数据处理和图像重建的计算需求。处理随机SMLM数据的普遍问题特征在于数据量巨大，通常在吉字节范围内；点扩散函数（PSF）的确切大小存在不确定性；单分子实验中常见的高背景噪声；以及同时发射的荧光团之间随机出现的空间分离不足。尽管在SMLM的早期阶段，高效的数据分析软件是大多数实验室的瓶颈，但目前已有多种高效的软件包可供选择（见附录8.4）。

Reference Structures for SMLM#

为了评估定位显微镜数据的合理性，近年来引入了一些具有明确分子结构和组成的稳健测试样本。这些测试样本还可用于校准超分辨率成像设备以及优化实验中的光切换条件（例如，照射波长和强度、成像缓冲液以及溶剂的pH值）[30]。在各种天然生物样本中，具有明确对称性和分子组成、尺寸以及在核膜中高密度分布的核孔复合体（NPC）具有特殊地位。因此，NPC不仅可以用于校准显微镜，还可以通过解析NPC的中央通道（直径约40纳米）来测试不同超分辨率成像方法所能达到的分辨率。

中心体也可作为天然生物校准样本，它由两个相互垂直排列的中心粒组成，每个中心粒包含九组三联微管；或者由突触前和突触后蛋白组成，它们被突触间隙分隔。用于二维和三维定位显微镜的人工校准样本包括DNA折纸技术、通过剪切-粘贴技术（SMCP）生成的单分子组装图案以及DNA砖。

其他细胞参考结构包括微管纤维，其结构高度保守，组装成直径约25纳米的管状结构。此外，用于微管标记的特异性抗体在商业上也有供应。在超分辨率显微镜的早期，正是这些细胞纤维的宽度被用来展示分辨率的提升。然而，由于应用阈值（对于确定性超分辨率方法，如SIM、STED）或定位统计量较低（对于随机超分辨率方法，即SMLM），这种测量方法容易出现误差。一个更好的衡量标准是观察标记纤维的投影：由于其管状结构，微管纤维在垂直于光轴（在成像平面内）成像时，靠近纤维壁的位置会显示出更高的强度（见图8.8）。当空间分辨率足够高时，可以观察到这些强度最大值之间的距离，研究表明该距离在抗体标记时约为40纳米[18]，而在直接标记微管单体时则小于20纳米[31]。

Quantification of SMLM Data#

由于单分子定位显微镜（SMLM）是通过单分子定位事件构建图像的，因此它本身就包含了关于某一区域内分子数量的内在信息。如果每个目标分子都被一个完整的荧光团标记，并且该荧光团被检测到，那么每个单独荧光团的定位数量是可以获取的。因此，SMLM不仅有可能以接近分子级别的分辨率解析细胞结构，还能够通过计数来进行定量分析。相关的应用包括，例如，计数受体多聚体的亚基数量[38]，或者确定蛋白质簇的化学计量比。定量SMLM利用单个荧光团的发射特性，荧光团作为一个单量子系统表现出数字式、一步光漂白等特性。理论上，在SMLM实验中记录的图像序列中出现的每一个荧光斑点都可以被计为一个单独的荧光团；然而，由于光物理特性（如可逆闪烁）的存在，需要对发射模式进行仔细校正，并且需要进行校准测量。

对于光激活荧光蛋白（PA-FP），情况看起来更直观、更简单：单步光激活应该只使荧光团被点亮一次，并且可以通过遗传工具实现对目标蛋白的化学计量标记。通过使用低光激活率，理想情况下只有一个荧光蛋白被光激活，荧光信号被读取，然后分子发生光漂白。然而，与合成荧光团相比，闪烁现象的发生频率要低得多。由于闪烁会导致多次检测事件和过度计数，因此开发了多种算法来校正这种现象。定量PALM能够实现蛋白质计数，例如，它被用于定量大肠杆菌细胞中RNA聚合酶的数量及其簇分布[39]。

有机荧光团由于实验挑战（如化学计量标记和由于可逆光切换而导致的每个荧光团的多次检测事件）而肯定是蛋白质定量的次优选择。另一方面，它们通常比荧光蛋白更亮、更稳定，因此被检测到的荧光团比例更高。由于荧光团的光物理特性依赖于其纳米环境的化学性质，因此需要进行参考实验，以便校正多次检测事件[40]。

Summary#

单分子定位显微镜（SMLM）在固定细胞和活细胞中实现了最高的空间分辨率，但代价是时间，即与STED和SIM相比，SMLM的速度较慢。可实现的分辨率主要由光子统计学决定。目前已经开发出多种三维单分子定位显微镜（3D SMLM）方法，其轴向分辨率可达几纳米到几十纳米。为了验证SMLM的可靠性，引入了如核孔复合体（NPC）等不同的参考结构，这些结构可用于检查分辨率、标记效率以及色差校正。SMLM能够提供内在的单分子信息，并可对蛋白质拷贝数、簇以及相互作用进行定量分析。