STED Microscopy
Introduction
一个世纪以来的共识是，远场显微镜的分辨率根本上受到衍射的限制。恩斯特·阿贝的著名公式
被看作是分辨率的极限，其中𝜆是波长，n是介质的折射率，𝛼是物镜的半孔径角。公式(10.1)表示点扩散函数（PSF）的半高全宽（FWHM），通常用作远场光显微镜中分辨率的定量定义。如果相同的荧光发射体之间的距离小于Δr，通常约为200-250纳米，它们在图像中会合并为一个点，因此无法被分辨。
幸运的是，这个长期存在的障碍并没有阻止研究人员追求显著提高远场分辨率的新技术。在过去的二十年中，荧光成像领域已经看到了一系列的发展，这些发展将分辨率推到了衍射所施加的极限之外。斯蒂芬·黑尔在1994年首次引入的刺激发射耗尽（STED）显微镜的概念，证明了衍射障碍实际上可以被超越[1]。在STED显微镜中，通过利用荧光分子的固有光物理性质来减小激光扫描显微镜（LSM）的有效焦点体积，从而克服了衍射极限。
与其它超分辨率显微镜方法一起，STED显微镜目前正在革新生物医学成像领域，提供了以前仅限于电子显微镜领域的分辨率。STED显微镜对提高荧光成像的分辨能力的划时代影响（与单分子超分辨率显微镜一起）在2014年被授予诺贝尔化学奖[2]。
The Concepts behind STED Microscopy
Fundamental Concepts
Switching between Optical States
一般来说，光学显微镜中的图像生成涉及三个连续的步骤：
• 对样本进行照明；
• 照明光与样本的相互作用；
• 检测样本发出的光。
在荧光显微镜的远场中，照明和检测过程均受到衍射的限制，如公式（10.1）所述。实现衍射极限突破的关键在于光与样本的相互作用，更具体地说，是照明光子与探针分子之间的相互作用。如果能够独立地开启和关闭探针分子的群体，那么原本在检测中无法区分的分子就可以变得可区分。这一概念在过去二十年开发的不同超分辨率显微镜中得到了利用，其中STED显微镜是最早实现的一种。
STED显微镜与基于单分子定位的方法之间的区别在于开关的空间组织方式：STED显微镜有目的地关闭激发体积外层区域的分子，仅允许靠近焦点中心的分子发生荧光。相比之下，基于定位的技术利用随机开关过程，并依赖于依次成像单个分子以确定它们的位置（第8章）。STED中实现的这种有目标的光学开关过程，可以在饱和状态下创建任意小的荧光斑点，这一概念也被推广到其他可逆的饱和光学荧光跃迁（RESOLFT）[3]，例如可逆切换的荧光蛋白（FPs）。通过使用多个焦点并行扫描样本，图像记录速度可以提高几个数量级[4]，这对于活细胞超分辨率成像具有极大的应用前景。
Stimulated Emission Depletion
受激发射（SE）最早由爱因斯坦在1916年描述，并且是“LASER”（光通过受激发射放大）一词中的“SE”所代表的现象。它描述了一种量子力学现象：当荧光团处于电子激发态时，会在与特定波长的照明光共振时释放一个光子。照明光的光子能量与荧光团激发态和电子基态之间的能量差相匹配（见图10.1a）。发出的光与照明光具有相同的能量和相位，因此可以很容易地从自发荧光光的更宽光谱中分离出来（通常使用带通滤光片来阻挡受激发射的波长）。
STED显微镜利用受激发射，迫使荧光分子在自发荧光之前从激发态返回基态，从而实现局部“关闭”。这种对激发态的主动关闭——即耗尽——是通过使用适当波长的激光（称为STED激光）来实现的。
如果将基态和第一激发态分别记作S₀和S₁，那么荧光分子处于这两种状态的概率P𝑖由以下微分方程控制：
其中，k₁₀和k₀₁分别是S₁ → S₀和S₀ → S₁的跃迁速率。弛豫过程包括自发过程和受激过程，可以总结为：
其中，k₁₀，spont是自发发射（包括荧光）的速率，𝜎是STED激光波长处的跃迁截面，ISTED是STED激光的光子通量密度。为了有效地关闭（“耗尽”）激发态的荧光团，受激发射必须在竞争中胜过激发态的自发弛豫过程（包括荧光和非辐射衰变）。
如果荧光团最初处于S₀态，那么在稍后的时间t，它处于S₁态的概率为：
当t远大于(k₁₀ + k₀₁)⁻¹时，达到平衡态：
这个方程表明，处于激发态的概率P₁取决于k₁₀/k₀₁的比值，而这个比值可以通过STED激光的强度来控制（见公式（10.3））。因此，增加STED激光的强度可以有效地减少激发态的分子数量（见图10.1b）。
Stimulated Emission Depletion Microscopy
STED显微镜的目标是产生小于衍射极限的有效焦点体积。这一目标是通过限制分子能够发射荧光的区域来实现的。荧光限制是通过使用甜甜圈形状的STED激光焦点来实现的，其强度分布ISTED在常规激发焦点的中心有一个局部零点（见图10.2a）。具体来说，ISTED(r) = Imax f(r)，其中Imax是STED光束的最大强度，f(r)是聚焦STED光束的径向分布，且在r = 0处f(r) = 0。由于f(r)受到衍射的限制，它是一个连续且可微的函数，仅在传统显微镜分辨率的尺度上逐渐变化。因此，受激发射（SE）导致的荧光耗尽在靠近r = 0的位置效率越来越低，荧光主要从中心附近发射。通过增加耗尽强度Imax，即使耗尽分布的振幅相对较低，也足以引起显著的SE效应，并减少荧光发射的区域（见图10.1b）。剩余有效荧光斑点的半高全宽（FWHM）（以及系统的分辨率）可以通过公式（10.1）的扩展形式很好地近似表示：
其中，Isat ≡ 1/(𝜏fl𝜎)被定义为特定荧光团的特征饱和强度，在该强度下，发射的荧光减少到1/e的因子，𝜏fl是激发态的荧光寿命，n、𝜆、𝛼和𝜎的定义如公式（10.1）和（10.3）中所述。对于典型的荧光团，Isat约为10 MW/cm²，这意味着要显著突破衍射极限，Imax需要达到或超过100 MW/cm²。图10.3展示了共聚焦显微镜和STED显微镜拍摄的小荧光珠的图像对比，STED图像的分辨率约为20纳米。
公式（10.6）表明，通过增加Imax，原则上可以实现任意小的ΔrSTED，从而打破衍射极限。因此，STED显微镜的分辨率不再受到衍射的限制，而是取决于实际实现公式（10.6）的理论条件的程度，以及样本能够承受的最大Imax值。
Key Parameters in STED Microscopy
在实际应用中，STED显微镜能够达到的分辨率是多少？要回答这个问题，我们需要理解多个关键参数的影响。从公式（10.6）可以看出，STED的分辨率不仅依赖于经典的光学参数（如波长、折射率和孔径角），还依赖于STED激光强度Imax与饱和强度Isat的比值，后者反映了荧光探针的特性。第一组参数代表了经典的衍射极限，而STED显微镜的分辨率也因此与显微镜传统点扩散函数（PSF）的大小成比例变化。Imax和Isat的依赖性则反映了这样一个现象：分辨率的提升是通过关闭荧光分子实现的，这是一个光物理过程。
在实际应用中，STED显微镜的分辨率还会受到成像条件不完美的影响，这可能导致实验结果与公式（10.6）所描述的理想情况存在显著差异。
Pulsed Lasers and Fluorophore Kinetics
当Imax远大于Isat时，公式（10.6）可以近似为：
这表明STED分辨率与Imax/Isat比值的平方根成反比。因此，在理想条件下，将STED激光强度增加四倍（或Isat减少四倍）可以将STED分辨率提高两倍。增加Imax相对直接，主要受限于可用激光功率和成像样本能够承受的强度水平。另一方面，达到Isat所需的平均功率Psat取决于许多光物理因素。
如公式（10.3）所示，受激发射（SE）与荧光的自发发射相互竞争。后者对分辨率提升没有贡献，反而会抵消其效果。因此，当STED激光光集中在激发后立即且短于荧光寿命的时间间隔内时，受激发射最为有效（从而降低Psat）。这可以通过使用激光束实现，即荧光团首先被激发激光脉冲照射，随后立即被STED激光脉冲照射。除了荧光寿命𝜏fl（通常约为2纳秒）外，在此背景下还需要考虑振动弛豫寿命𝜏vib（通常小于1皮秒）以及在高强度峰值下发生的非线性吸收。STED脉冲长度𝜏STED应显著短于𝜏fl，以主导荧光过程，但要远长于𝜏vib。后者的理由是：荧光分子在受激发射后仍处于激发振动态，且其回到S1态的能量差与STED光子能量匹配，因此分子容易被STED光重新激发（这会抵消耗尽效应）。只有在振动弛豫发生后，分子才会因与S1态的能量差增大而免受STED激光的重新激发（见图10.1a）。将STED脉冲拉长至𝜏STED ≫ 𝜏vib可以降低SE后分子立即与另一个STED光子相互作用的可能性。此外，较长的𝜏STED还可以避免不必要的多光子过程，例如需要每平方厘米吉瓦级峰值强度的双光子激发。在实际应用中，STED显微镜中𝜏STED值在几百皮秒到1纳秒之间已被证明效果良好。由于激发脉冲的强度远低于STED脉冲，只要激发脉冲长度𝜏exc显著短于𝜏fl，其作用就不那么重要。
然而，使用脉冲激光源并不是成功实现STED显微镜的绝对必要条件。使用脉冲激光可以将可用功率集中在激发后的时间间隔内，提高峰值功率，因为此时耗尽过程最为高效，但使用连续波（CW）激光以更高的平均功率也能实现类似的耗尽效果。
另一个需要考虑的因素是激光脉冲之间的时间间隔：通常约为12.5纳秒，因为市场上可用的激光器重复频率约为80兆赫兹。然而，这意味着例如𝜏fl = 2纳秒的荧光团，实际上只在可用时间的大约六分之一内发挥作用。因此，重复频率会影响单位时间内能够记录的荧光量，进而影响成像速度。从这个角度来看，理想的STED激光系统应具备高强度激光脉冲，且重复频率约为1/𝜏fl。
然而，染料的光物理特性更为复杂，因为还可能存在其他跃迁过程。特别值得关注的是跃迁到三重态的系间穿越。尽管系间穿越速率较低，但三重态的相对较长寿命会导致该态上的分子积累，从而减少单重态系统中的荧光团数量，相应地降低荧光信号。此外，处于三重态的分子光漂白速度会加快。因此，使用脉冲重复频率较低（约1兆赫兹范围）的激光不仅可以显著降低Psat值，还可以大大减少光漂白，尽管这会以增加图像记录时间为代价。
一种优雅但技术上具有挑战性的替代方案是：在不降低成像速度的前提下，通过快速扫描（CW或高重复频率）激光束，使同一分子在光束移动前只能被少数几个连续脉冲击中，从而避免分子进入三重态。为了在每个像素处积累足够的信号，可以多次扫描视场，并将多次记录的图像数据相加。
在讨论了仪器参数之后，需要指出的是，选择合适的荧光探针或改进其特性，对于提高STED成像质量具有很大潜力。例如，发现金刚石中的色心（氮空位）是非常适合的STED探针，已实现了低于10纳米的STED分辨率。
Wavelength Effects
STED激光束对特定荧光团的影响不仅取决于其强度，还取决于其波长。受激发射（SE）对激发波长非常敏感，因为相应的能量必须与所需态跃迁的能量差相匹配（即从激发态到基态）。然而，STED波长也可能诱导其他跃迁。其中，STED激光直接从电子基态激发荧光团的情况尤其值得关注。尽管STED光束的波长并不与激发光谱的峰值重叠，但其高强度可能会补偿该波长下较低的激发截面，从而导致图像中出现背景信号，进而危及分辨率的提升。这种效应在激发强度较低时尤为明显。因此，STED波长通常尽可能向红光方向移动，以在最小化激发和最大化受激发射之间找到平衡（见图10.2c）。另一方面，最近的研究表明，如果从STED图像中减去反斯托克斯背景信号（即由STED激光激发产生的不希望的荧光），则可以使用更接近发射光谱峰值的STED波长来恢复仅由激发激光生成的期望信号。
PSF Shape and Quality
正如前面所述，STED分辨率的提升通常是通过在甜甜圈形状的强度分布中耗尽激发态的荧光团来实现的，这种分布允许位于甜甜圈中心的分子仍然能够发射荧光（见图10.2a）。当这种耗尽分布达到饱和时，未耗尽区域会变得更加锐利，从而将分辨率推至衍射极限之外（见图10.1b）。目前已经报道了多种STED点扩散函数（PSF）的形状，而且还可以设想出更多。STED PSF的中心最小值是通过在物镜前方光路中使用相位滤波器（见图10.2b）来修改聚焦波的干涉而产生的。STED PSF可以是环形的（如图10.2a和10.4a所示），也可以在其上方和下方增加额外的光瓣，以在轴向上猝灭荧光，从而在所有三个维度上提高分辨率（见图10.4b）。在这两种情况下，STED PSF最小值的宽度——不考虑饱和效应——在最佳情况下仍然是受到衍射限制的。
分辨率的提升受到STED PSF不完美性的强烈影响，即STED PSF最小值处的“零”并不完美。即使在PSF最小值处的强度仅为峰值强度的百分之几，当Imax远大于Isat时，这一强度也可能显著增加，并导致不希望的荧光抑制。因此，在实验中生成STED PSF时需要格外小心。特别是，必须考虑偏振效应。例如，当两个平行的y偏振光束以𝜋相位差分别从物镜后孔径的正负x方向边缘进入时，它们会在焦点中心相互抵消（见图10.5a）。然而，即使是少量的额外x偏振分量（具有相同的相位差）也会产生z偏振分量，这些分量会相互干涉增强（见图10.5b），从而在PSF中心的预期“零”点处增加强度。类似地，入射STED光束的非旋转对称强度分布等畸变也会导致焦点中心的不完美干涉。此外，由仪器本身或具有不均匀折射率的样本引起的光束像差可能会为入射光束的不同部分引入不同的相位延迟，从而扭曲波前，并导致不完美的STED焦点。研究表明，自适应光学技术可以用于校正这些波前畸变。
Experimental Setup
STED显微镜通常基于激光扫描显微镜（LSM），在其激发光路和检测光路的基础上增加了第三条用于STED光束的光路（见图10.2a）。在典型的STED装置中，一个呈涡旋状的相位掩模被放置在STED激光的光路中，并被成像到物镜的后孔径上。该相位掩模的相位延迟随旋转角度线性变化，从0到2𝜋（见图10.2b和10.4a）。经过修改的STED激光束在样本中产生一个甜甜圈形状的焦点，其中心的强度为零，如前所述。这个强度零点与激发激光的强度最大值精确对齐。
Light Sources and Synchronization
在STED显微镜中，最佳分辨率提升通常通过脉冲激光系统实现。然而，与使用连续波（CW）激光的STED显微镜相比，这些系统相对复杂，因为它们需要在激发激光脉冲和STED激光脉冲之间进行同步，并且通常需要额外的组件将激光源提供的典型亚皮秒脉冲展宽至超过100皮秒（第10.2.2.1节）。脉冲激光二极管或锁模钛宝石激光器是最常用的，但它们正越来越多地被脉冲光纤激光器所取代，后者直接发射几百皮秒长度的脉冲，无需脉冲展宽。像钛宝石激光器这样产生短脉冲（即飞秒脉冲）的激光器需要脉冲展宽，通常通过衍射光栅或更简单地利用长单模光纤中的色散来实现。脉冲同步需要在激发和STED激光源之间进行触发（例如，通过电子触发脉冲激光二极管与锁模钛宝石激光器的脉冲同步），或者使用固有同步的光源（例如，通过用锁模钛宝石激光器泵浦的光子晶体产生的白光光谱生成激发光，或者使用商业化的超连续光源）。同步脉冲还需要调整每个脉冲到达样本的时序，以确保耗尽脉冲紧随激发脉冲之后。这种调整可以通过电子触发激光源之间的电子延迟，或者通过光学延迟台改变光路的相对长度来实现。
使用连续波激光的STED显微镜极大地简化了实验装置，因为它无需脉冲展宽和同步。然而，为了达到与脉冲激光相似的分辨率，使用连续波激光需要将耗尽强度提高三到五倍。除了将激发激光和STED激光相互同步外，还可以将检测窗口与激光脉冲同步。这限制了检测范围，使其仅限于在STED激光对激发态荧光分子作用足够长时间后发出的荧光，并抑制了来自甜甜圈零点之外分子的背景光——这些分子在被耗尽之前已经发出了荧光。时间门控检测既增强了图像对比度，又减少了背景信号的收集，因此它越来越多地被应用于连续波和脉冲STED配置中（包括商业STED系统）[9]。在选择理想的激光源时，还需要考虑可用的波长。由于光物理限制（第10.2.2.2节），STED波长尤其需要与所使用的荧光团匹配。然而，在实际应用中，通常会选择与可用STED波长兼容的荧光团。
Scanning and Speed
STED显微镜通常采用逐点扫描的方式实现，因此图像像素是通过扫描激光焦点（使用振镜）或样品（使用压电平台）生成的。虽然采用样品扫描的装置在光学设计上更为简单，但这种扫描方式通常对于活细胞成像来说速度太慢。相比之下，通过扫描镜移动激光焦点穿过样品可以实现更快的成像速度。为了满足香农/奈奎斯特采样频率的要求，共聚焦显微镜中的像素大小必须小于系统分辨率的一半。需要注意的是，STED显微镜中使用的有效点扩散函数（PSF）本质上要求更小的像素尺寸，这在给定扫描速度下会导致每个像素的停留时间缩短。因此，对于比衍射极限分辨率提高了m倍的STED图像，为了保持与衍射受限成像相同的像素停留时间，需要将帧率降低到原来的m²倍。为了弥补成像速度的损失，可以在一定程度上增加激发激光的强度；然而，荧光团发射的饱和度最终会限制在给定时间间隔内能够检测到的光子数量。无论如何，可以通过减小扫描视场的大小来提高成像速度。
由于STED点扩散函数更锐利，导致在任何给定时间只有目标的一部分可能发出荧光，因此STED图像可能会比传统显微镜图像显得更暗。然而，需要注意的是，这种信号的损失并不对应于结构信息的损失（见图10.6）。实际上，小于STED分辨率的小目标在STED显微镜下成像时，与常规共聚焦图像相比，只会略微变暗，但会显得更清晰（见图10.6e和i）。另一方面，这些小目标的大型聚集簇在传统图像中可能因为每个簇成分的荧光图像重叠而显得更亮，但在STED显微镜下即使信号显著下降（从聚集簇的总信号水平降至单个目标的信号水平），也能够被分辨出来（见图10.6f和j）。在这两种情况下，尽管在后一种情况下图像亮度显著降低，STED图像的结构信息含量仍比传统图像有了显著提升。
Multicolor STED Imaging
在任何现代荧光显微镜技术中，多色成像的需求都非常强烈，因为只有通过多色成像，才能研究不同样本组分之间的空间关系。遗憾的是，将STED显微镜技术扩展到双色成像时，会受到每个染色需要两种激光波长的限制。例如，传统的双色成像方案使用两种染料时，需要复杂的激光系统，并且需要精确对准四束激光[10]。此外，由于用于耗尽蓝移染料的高功率STED激光也会高效激发红移染料，因此这种方法需要依次对每个通道进行成像。结果，在对蓝移通道成像时，红移染料会被严重漂白。如果先对红移通道进行成像，虽然可以记录该通道的单次图像，但在记录另一个通道后，便无法再对该通道进行重复成像。双色成像还可以仅使用一个STED激光器来耗尽两种染料。这种方法简化了实验装置，但必须考虑到两种染料的发射光谱至少部分重叠。通过优化激发波长和光谱检测范围，并依次对两个通道进行成像（显微镜快速切换两种激发波长），可以将两个检测通道之间的串扰降低到几乎可以忽略不计的水平[11]。图10.7展示了一个采用这种方法拍摄的双色STED图像。超连续谱激光器的出现为双色STED提供了前所未有的灵活性。另一种选择是通过不同荧光团的荧光寿命来区分它们[12]。在这种情况下，技术上只需要一个激光器用于激发，另一个用于受激发射耗尽，这大大简化了装置。
Improving Axial Resolution in STED Microscopy
如上所述，使用环形耗尽光束提高横向分辨率，并不能限制焦体积在轴向上的范围。在典型的共聚焦几何结构中，STED显微技术本身具有光学切片能力。然而，如果不额外采取措施来限制焦体积的轴向范围，这种切片能力通常只能达到传统共聚焦的分辨率水平，即大于500纳米。
要提高STED显微镜的轴向分辨率，需要通过适当调制耗尽激光的相位来限制焦体积的轴向范围。例如，在耗尽激光的中心区域引入一个π相位偏移，会在焦平面上方和下方产生高强度区域，而焦点中心的强度则为零，从而将有效点扩散函数（PSF）的轴向范围缩小到衍射极限以下的尺寸[13]（图10.4b）。这种耗尽模式可以与典型的环形耗尽光束结合使用，从而在所有方向上有效地将有效PSF的尺寸缩小到衍射极限以下[14]。为了进一步提高轴向分辨率，STED显微镜可以在4Pi几何结构中实现（即使用两个相对的物镜）。这种方法已在所谓的isoSTED配置中被证明可以产生直径小于45纳米的球形焦体积[15]。
作为一种替代方法，可以通过将单个STED光束提供的横向分辨率提升与渐逝场激发相结合，来限制焦体积的轴向范围，从而增强STED显微镜的光学切片能力[16]。虽然这种方法无需使用多个耗尽光束或物镜即可提高轴向分辨率，但它仅限于对样品与基底界面处的结构进行成像。
Applications
任何一种新型显微镜技术的实用性，都以其解答科学问题的能力来衡量。在生物学应用方面，受激发射损耗（STED）显微镜是最成功的超分辨率技术之一，但在应用这项技术时，必须考虑几个因素。特别是，在规划STED显微镜实验时，荧光团的选择（见10.4.1节）和标记策略（见10.4.2节）至关重要。
Choice of Fluorophore
在为STED显微镜选择荧光染料时，必须考虑几个染料特性。首先，荧光染料的发射光谱需与所用STED激光的波长相匹配。通常，STED激光应位于染料发射光谱的红移尾部范围内（图10.2c）。如果发射光谱与STED波长匹配不佳，分辨率的提升将受到影响，因为受激发辐射（SE）效率不高或由STED波长引发的背景荧光会降低成像质量（第10.2.2.2节）。其次，希望使用具有相对长荧光寿命的荧光染料，因为这允许更有效地激发辐射。理想的用于STED显微镜的荧光染料应该具备：与仪器使用的STED波长相匹配的发射光谱、较长的荧光寿命、高的量子产率以及强的抗光漂白能力。
由于STED显微镜的分辨率依赖于荧光染料的特征饱和强度（方程10.6）及其在不同光学状态之间切换的能力，因此所用荧光染料的光漂白行为和光稳定性对于实现最佳STED成像是至关重要的（第10.2.2.1节）。特别是那些从单线态到三线态的系间窜越速率较小的荧光染料非常适合用于STED显微镜，因为这一特性有助于避免探针的光漂白，而光漂白往往与三线态群体有关。此外，还原和氧化系统（ROXSs）也可以用来帮助减少易导致光漂白的三线态的数量，从而增加荧光染料的光稳定性和允许使用更高强度的STED束[17]。可用于STED显微镜的两大类荧光染料分别是荧光蛋白（FPs）和小分子有机染料。尽管荧光蛋白通常不如有机染料明亮或光稳定，但绿色荧光蛋白（GFP）和黄色荧光蛋白（YFP）变体已在STED显微镜实验中成功应用[18]。小分子有机染料（尤其是ATTO、DY和Abberior STAR染料）因具有与常用STED波长兼容的发射光谱、极高的亮度、良好的光稳定性和较长的荧光寿命而在STED显微镜中得到了更广泛的应用。例如，ATTO647N不易衰变为导致光漂白的三线态，使其成为STED显微镜中最受欢迎的荧光染料之一。虽然大多数有机荧光染料不适用于细胞内结构的活细胞STED成像，但已鉴定出一些可穿透细胞且具有最小非特异性结合的小分子染料。例如，ATTO590和SiR染料可以标记细胞内部深处的结构，并已被用于利用775 nm STED激光进行的活细胞STED成像[11]。在远红外区域使用高强度STED光束进行成像对样品造成的光损伤较小；因此，对于活细胞应用而言，一般优选在此区域进行成像。一个成功用于STED显微镜的荧光染料列表及其相应的参考文献可以在马克斯普朗克生物物理化学研究所Hell实验室的以下网站上找到：http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/。
Labeling Strategies
在生物成像应用中实施STED显微镜技术要求STED探针能够特异性地标记感兴趣的蛋白质。实现STED探针靶向的主要策略有三种：荧光蛋白（FPs）、蛋白质介导的标记和免疫荧光。荧光蛋白和蛋白质介导的标记标签由于可以进行基因编码，因此可以与感兴趣的蛋白质融合。尽管这些标签适用于活细胞成像，但它们较大的体积可能会干扰目标蛋白质的定位和功能。另一方面，免疫荧光通常不适用于活细胞成像，除非是在标记细胞外的目标时。荧光蛋白容易发生光漂白，因为它们通常不像用于蛋白质介导的标记和免疫荧光的小分子有机染料那样具有光稳定性。蛋白质介导的标记策略，如SNAP、CLIP和Halo标签，结合了有机染料的稳定性与基因可编码标签的活细胞兼容性。这些标记方法已与细胞渗透性染料一起使用，实现了对细胞内目标的活细胞STED成像[11]。以上所有标记技术在第4章中有详细讨论，它们在STED显微镜实验中的优缺点总结于表10.1中。
Table 10.1
Summary
衍射极限不再限制远场荧光显微镜的分辨率。突破衍射极限的关键在于光与荧光团之间的相互作用。通过受激发射（SE），荧光团的定向开关能够有效地产生不再受衍射限制的焦斑体积。受激发射损耗（STED）显微镜的分辨率仅受限于其理论基础能否有效地付诸实践。在最佳条件下，已有报道实现了纳米级的分辨率[6]。
近年来，STED显微镜技术已扩展到三维、多色和活细胞成像领域。这些创新已经证明是细胞生物学中不可或缺的工具。使用可逆转换荧光蛋白（FPs）或其他需要低光强即可实现开/关转换的荧光团的可逆可饱和光学跃迁（RESOLFT）显微镜，是STED显微镜的一个极具吸引力的替代方案。鉴于这种超分辨率成像模式在成像速度方面的最新进展，以较低的光毒性成像亚细胞动态的能力应具有广泛的吸引力。未来，针对定向开关优化的激光器和荧光团的可用性进一步发展，必将推动这些技术在解答生物学问题方面取得更大进展。