生命科学中的单分子显微镜技术#

围绕问题展开#

最早的显微镜被用于探索生物样本，早期生物学中的关键发现——如细胞和细胞器的发现——都与显微镜技术的进步息息相关。随着放大倍数的增加，人们很快意识到分辨能力存在根本性的限制。阿贝[1]曾指出：“如果物体（或物体的特征）之间的距离太近，以至于零级和一级衍射光束无法同时进入物镜，那么显微镜就无法分辨这些物体。”他将经验性的“分辨率”概念与可量化的“衍射”术语联系起来，树立了里程碑。然而，在光学分辨率极限之下，还存在着巨大的生物复杂性。如今，接近并探索这个纳米世界——即可见光衍射极限以下长度尺度上的现象集合——已成为许多生命科学家的主要研究方向；事实上，这些努力已经取得了丰硕的成果。与此同时，我们已经知道，生物材料在所有长度尺度上，直至多分子复合物甚至单分子层面，都呈现出模块化的结构。

我们对预期的复杂性有了一些了解：人类细胞中存在约20,000至25,000个基因和相应的mRNA分子，由于选择性剪接和翻译后修饰，这些基因和分子可能转化为数量多得多的不同类型蛋白质（预计可达约10^6种）。细胞膜上可能存在着估计约10^5种不同的甘油磷脂和糖鞘脂类。因此，光学显微镜学家可能会担心，即使某种假设的技术能够显著提高分辨率，超越衍射极限，样本中的这些化合物之间是否仍能提供足够的对比度。更确切地说，分子生物学需要化学对比度，即识别并定位样本内不同种类的分子。

然而，目前光学显微镜无法仅凭生物分子自身的天然光物理对比度来区分任意两种生物分子。不过，可以通过使用荧光染料特异性地标记样本的一小部分，从而人为地引入对比度。荧光标记为现代细胞成像铺平了道路，因为它允许在复杂的生物样本中分离出单个组分。为此，显微镜学家需要荧光团足够明亮，而背景足够暗淡。“足够”一词应表明，不同的实验方法可能会施加不同的限制。事实证明，大多数生物样本对荧光标记相当耐受：一般来说，即使像绿色荧光蛋白（GFP）（一个直径约3纳米、高度约4纳米、分子量约27千道尔顿的β桶状结构）这样庞大的附着物，也几乎不会影响目标分子的功能。因此，在研究生物系统体内动力学时，荧光显微镜是首选方法。更重要的是，荧光标记允许以高精度定位目标分子。在经典的分子集合光学显微镜中，无法直接获取发射分子的位置：所获得的图像是由单个发射体分布和成像系统的点扩散函数的卷积给出的。本质上，来自各个发射体的光子被混淆，无法再归因于原始光源，从而导致了阿贝衍射极限。然而，如果发射体在样本中稀疏分布——即它们之间的距离远大于衍射极限——并且成像系统提供所需的灵敏度，那么我们可以直接测量它们的位置。

事实上，荧光团被证明是相当强的光源，因此可以实现单分子策略。单分子检测的历史可以追溯到20世纪60年代，当时鲍里斯·罗特曼通过生成荧光底物来测量单个酶的活性[2]。1976年，赫希菲尔德在荧光显微镜中实现了对单个蛋白质的成像[3]；在这个实验中，每个蛋白质被标记了约100个荧光素分子。检测方案和仪器灵敏度的改进使科学家们能够达到直接观察和成像单个染料分子的极限。这一过程中的里程碑包括在低温[4]和室温[5]下实现单分子检测、在流动膜中进行测量[6]以及在活细胞上进行研究[7, 8]。接下来，光子还可以被进一步利用；例如，它们还显示出颜色和偏振，并且可以用来获取发射体激发态寿命的信息。因此，每个标记的分子i都具有时间依赖的三维（3D）位置ri(t)以及额外的参数{ai(t), bi(t), …}，这些参数报告了局部环境、探针构象等信息。因此，光学显微镜的分辨率问题可以重新表述为：我们能在多大精度（在空间和时间上）上确定参数ri(t)或{ai(t), bi(t), …}？

在本章中，我们将介绍构建单分子显微镜时的一些基本考虑因素。接下来，我们将讨论从单分子测量中可获得的关键参数：位置、方向、颜色和亮度。最后，我们将这些参数置于生物实验的背景中进行讨论。我们将以概述单分子方法提供的特定优势作为本章的开头。

什么是独特信息？#

我们可能都有过这样的经历：走进一个大型舞厅，里面人声鼎沸，交谈声此起彼伏，形成一道声墙；无法辨别出任何个别的声音，也无法提取出不同交流的内容。有些人似乎正热烈地争论着，但几乎无法听清他们说的任何一个词。科学家们熟悉开场交流会或会议晚宴，知道如何在这种场合中与人交谈，从而将这些聚会变成有用的信息来源。然而，一个更加胆怯的同事，如果只是从旁观望，几乎无法从对话中捕捉到任何细节，可能只会留下噪音极大的印象而离开。我们可以将这一场景视为生物样本的隐喻。此外，众多不同步的参与者（分子）在移动、相互作用、组合，并在特定状态之间切换。现在，让我们来看看，与从旁观望所获得的总体概览相比，单分子混合实验能为我们提供哪些额外信息。

可直接解析动力学#

解析不同分子状态之间的转换已成为当前分子生物学中的关键问题。在实验上，可以通过同步样本并测量信号随时间的变化来接近这一目标。例如，可以通过光漂白或光激活来同步荧光报告分子，从而捕捉运输过程的动态。然而，将蛋白质样本制备成特定状态则更加困难，甚至不可能；我们可以想到离子通道的开放与关闭状态、酶的活性与非活性构象、分子马达做功冲程中的各种构象，或扩散受体的结合与非结合状态。在这种情况下，传统的基于总体的方法通常无法提供关于转换动力学的见解。相比之下，单分子测量能够单独直接解析随时间变化的转换序列，并量化特征转换速率常数。图12.1a显示了一个示例，即通过检测福斯特共振能量转移（FRET）效率EFRET的伴随变化，来监测蛋白质两种构象状态之间的转换，从而可以直接监测这些状态的寿命。

可测量完整的概率分布#

许多总体实验仅限于确定分子参数的平均值。相比之下，单分子实验能够直接获取完整的统计分布函数和完整的转换序列。以下，我们以通过FRET（福斯特共振能量转移）测量的蛋白质两个位点之间的距离为例（见图12.1b）。单分子实验会包含对EFRET（FRET效率）的多次观察，这些观察结果可以通过绘制概率分布p(EFRET)来进行分析；曲线的最大值表示最可能的构象。相比之下，相应的总体实验只能得出平均值（⟨EFRET⟩），该值本身没有进一步的结构意义。

为了进行说明，图12.1b比较了两种极端情况，这两种情况得出的平均FRET效率相同。浅灰色曲线显示了仅采用单一构象（在其周围可以略有波动）的蛋白质的EFRET分布。在这种情况下，平均值将等于最大值；因此，总体实验的结果将是最可能构象的EFRET。深灰色曲线显示了具有两种数量相等的构象的蛋白质的EFRET分布。通过单分子实验，可以区分这两种构象。然而，平均EFRET位于曲线的两个峰值之间；因此，总体实验将描述一种蛋白质并未采用的构象。除了可能导致误导性结果的风险外，总体实验还无法区分这两种情况：相同的EFRET值可能来源于同质分布（一种构象）或异质分布（多种构象）。除了FRET效率外，单分子方法还经常使用其他参数进行统计分析：迁移率或各向异性分析可以识别瞬时结合，而亮度分析可以得出分子复合物的化学计量学。总之，使用单分子工具记录分布函数具有多重优势：

• 可以在异质样本中识别亚群的微小差异，例如DNA上的单个碱基对差异。 • 可以解析少数群体。在许多关于纯化蛋白质的实验中，由于纯化过程中和表面固定过程中的部分变性，只有少数蛋白质保持功能性。然而，即使在活细胞环境中，活性蛋白质也经常被非活性蛋白质所掩盖。在总体实验中，少数群体的信号会被多数群体的信号所掩盖，但在单分子水平上可以较容易地检测到。 • 可以区分遍历性和非遍历性行为。生物学中经常观察到遍历性破缺，这表明探针并不一定会探索整个相空间。例如，某种蛋白质可能从其产生到降解一直保持相同的构象，而另一个分子可能会经历多种构象和功能转换。单分子实验可以检测到分子行为中的异质性，但总体研究则不能。

结构可与功能状态相关联#

最新的分子生物学、生物化学和生物物理学研究为理解生物分子功能的机制奠定了基础。许多蛋白质（或多分子复合物）表现出明确定义的功能状态，以及状态之间的特征性转换。在这里，“功能”一词表示任何可区分且可量化的感兴趣行为：酶的活性与非活性状态、离子通道的开放与关闭状态、受体的高结合亲和力与低结合亲和力状态。任务是将结构特征与功能状态相关联。乍一看，考虑到蛋白质构象的巨大相空间，这似乎并非易事。为了简化，通常假设蛋白质仅采用一组有限的稳定构象，并且这些构象与其功能状态有直接映射关系。研究人员的主要目标是制备处于某些功能状态的蛋白质，以便通过X射线晶体学获得每种状态的高分辨率结构。然而，研究经常表明，实际情况更为复杂，功能转换过程中伴随着多个结构中间态。通常，很难制备每种状态并确保没有遗漏任何状态。单分子方法允许同时记录结构和功能转换的序列，从而能够直接关联这两个数据集。例如，可以通过单分子FRET询问离子通道的构象，并通过同时进行的电生理测量确定其功能状态（见图12.1c）。

可实现超分辨率成像#

光学显微镜受到衍射的限制：波长为𝜆的平面波通过具有一定数值孔径（NA）的物镜聚焦成一个光斑，其半高全宽（FWHM）≥ 0.51𝜆/NA。如果样本与激发光按照线性数学关系相互作用，则FWHM设定了显微镜分辨率的实际极限。如果该关系是非线性的（例如，由于荧光团的饱和效应），则也可以实现更高的分辨率。单分子工具开辟了替代成像概念。这些概念基于利用先验知识：荧光团的位置由光子分布的质心编码，并且可以通过点扩展函数拟合确定到远低于衍射极限的精度[9]。在下文中，我们假设单分子的光子分布为高斯分布；为简单起见，假设分子位于与成像系统的焦平面相同的平面表面上。那么，图像由以下公式给出：

其中Fi和ri表示第i个荧光团的荧光亮度和位置，𝜎表示分布的标准偏差（FWHM = 2.35𝜎）。如果没有噪声且信号强度高，则可以进行明确的反卷积，并且可以直接计算出所有荧光团的精确坐标。然而，背景噪声和光子发射波动使得这种直接反卷积成为不可能。尽管如此，仍有方法可以使用单分子方法获取样本空间组织的信息。埃里克·贝齐格（Eric Betzig）在这些方法实施之前很早就对其进行了总结：“我们可以通过首先根据n ≥ 1个独特的光学特性将焦区域内的多个离散特征分离开来，然后测量它们的相对空间坐标，从而解决m维空间焦区域内的多个离散特征。”[10]这样的特性可以是荧光团的颜色，也可以是其发射状态。在框12.1中，我们总结了使用单分子显微镜进行超分辨率成像的概念（有关更详细的描述，请参见第8章）。

生物分析可扩展至单分子水平#

检测和鉴定最小样本量（最终为单分子）已成为最新生物分析领域的核心关注点。mRNA或蛋白质表达谱的全局分析通常使用微阵列进行。然而，其当前的应用受到所需大量样本的限制。特别是，当从小的临床样本中分离出的亚群细胞数量极少时，在处理以进行全局分析方面仍然存在重大问题；最终，只有少数分子将结合到生物芯片上的不同位点。实际上，对于最低样本量的生物分析，可以通过单分子检测测定来稳健地进行，例如用于mRNA表达谱分析或荧光连接免疫吸附测定。此外，还可以获得单个DNA分子的完整序列。单分子检测还将细胞术提升到了新的灵敏度水平，即使表达量极低的细胞也可以进行分析。

构建单分子显微镜#

在过去20年里，各个实验室已经开发出用于检测和连续观察单个染料分子发出信号的设备。这些设备的设计各不相同，反映了各研究团队在科学研究重点上的差异，从低温和室温下的纯粹光谱学研究，到流体系统中的测量，再到活细胞中单分子的研究。对于生物学应用而言，大自然本身决定了实施单分子显微镜所需满足的要求。活细胞中的主动运输速度可达每秒数微米；细胞组分的布朗运动范围从溶液中蛋白质的扩散常数约100微米²每秒，到膜中脂质的约1微米²每秒，再到固定化蛋白质的扩散常数小于10^-4微米²每秒。在所有这些情况下，为了分辨亚微米级的位移，都需要毫秒级的时间分辨率。此外，许多分子转变过程，如离子通道的开关或低亲和力蛋白质-蛋白质相互作用，也正好发生在这一时间尺度内。

显微镜/物镜#

在最初的开创性单分子光谱学研究中，研究人员从零开始搭建实验装置，主要是为了实现在低温下的操作。随着室温单分子显微镜的出现，商用显微镜配置变得越来越具有吸引力。通常使用的是倒置落射荧光显微镜。

双视图#

在标准配置中，显微镜可以记录图像的时间序列。在连续的两幅图像之间，可以改变激发或发射路径（例如，通过改变偏振和插入滤光片），以便顺序地询问不同的参数。为了同时实现这种询问，可以根据特定属性（例如，通过插入偏振分光棱镜来分偏振，或使用二色镜来分色）在发射路径中分割图像，并在不同的探测器上记录所得图像。现在，各种设计的更高效版本已经商用（图12.3a）：在这种双视图系统中，使用平行光束路径中的二色镜根据颜色分割图像；或者使用镜子将两幅图像以轻微可调的位移叠加，以便它们可以在同一相机的相邻位置定位。这种配置提供了对两个光束路径的完全访问，因此可以单独插入额外的光学元件（例如，滤光片和透镜）。另外，也可以在无限远空间中插入沃拉斯顿棱镜或二色楔，以分别生成两幅正交偏振或不同颜色的图像。

物镜#

物镜是主要的成像工具，因此也是显微镜中的关键元件之一。在选择物镜时，应考虑以下性能指标：

• 放大倍数/分辨率：点扩散函数的大小以及物镜的分辨能力由其数值孔径（NA）决定；图像平面中的半高全宽（FWHM）由FWHM = M(0.51𝜆/NA)给出，其中M表示放大倍数。为了优化单分子的定位精度（LP），此数值必须与探测器的像素大小相匹配（有关最佳像素大小的讨论，请参见第12.3.3.1节）。

• 许多研究人员使用NA > nsample的物镜，因为它们允许进行物镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜[11]（框12.2和图12.4a）。

• 收集效率：我们在此将收集效率定义为通过物镜的发射光子所占的比例。因此，它是获得信号亮度的关键数值。一般来说，物镜收集在角度𝜗的锥体内发射的所有光线，该角度由关系式NA = n × sin 𝜗指定。如果发射是各向同性的，并且光子在样本中不散射（“弹道光”），则我们可以根据接受锥的体积分数和物镜的透射率𝜂trans来估计收集效率𝜂obj（图12.3b）。

对于大NA（NA/n → 1），收集效率近似为𝜂obj ≈ 0.5𝜂trans，因为可以收集整个半球。对于小NA（NA/n → 0），我们得到𝜂obj ≈ (NA/2n)2 × 𝜂trans。高质量的物镜显示出约𝜂trans ≈ 0.9的透射率。如果发射体位于距界面几纳米的范围内，它们会优先在临界全反射角向高折射率介质（通常是玻璃盖玻片）中发射。使用为TIRF显微镜设计的物镜可以收集这种超临界角荧光；通过这种方法，可以实现高达~80%的收集效率。

• 如果在距盖玻片表面数微米的溶液中观察样本，使用油浸物镜会产生点扩散函数的球差和焦点偏移，这在3D成像时需要考虑。

光源#

理想情况下，在荧光显微镜中，感兴趣区域在给定时间内被均匀照射，且具有明确的偏振、波长和激发强度I。这些参数的选择对实验结果至关重要，在选择光源时需要考虑。

均匀性#

柯勒照明可被视为现代光学显微镜的基石：通过将光源成像到聚光镜的后焦平面，可以实现视场的均匀照明，且几乎不受光源本身结构的影响。使用低相干光源（如弧灯或白炽灯）可获得最佳性能。然而，柯勒照明既不包括光源的整个表面，也不包括其完整的角度分布，因此效率较低。另一种激发方式是临界照明，其中光源直接成像到样本平面。这种操作模式效率很高，但光源的所有非均匀性都会直接显现。以TEM00模式运行的激光器可以用高斯分布照射样本，其焦点大小可任意调整，仅受聚光镜数值孔径（在落射式配置中，聚光镜与物镜相同）的限制。然而，在实践中，激光器等高相干光源经常会产生由各种光学元件反射的光线干扰所产生的斑点。减少斑点的一种实用方法是使用光扰频器（如光纤导光管、快速旋转扩散器或空间滤波器）。

强度#

激发强度限制了荧光团可以发射的光子数量。为了估算单分子成像所需的激发强度，我们首先引入一些基本的光谱学考虑。荧光染料可以很好地近似为三能级系统，具有单重态基态（S0）、单重态激发态（S1）和三重态激发态（T1；见图12.5a）。通过吸收单个光子，从S0激发到S1，然后从S1自发发射一个红移光子回到S0，这一过程以特征速率𝜏−1进行。向三重态的系间窜跃是自旋禁阻的，因此发生的可能性很低，其速率常数为kisc（表示T1的布居）和kT（表示T1的去布居）。在时间平衡状态下，用单色光（强度为I）激发单个染料分子时，检测到的光子数F由下式给出：

其中，till表示照明时间，Φ表示量子产率，𝜂表示装置的检测效率。激发截面𝜎与消光系数𝜀的关系为𝜎 = 𝜀 × ln(10)/NA，其中NA为阿伏伽德罗常数。在低照明强度I下，当激发光子击中染料分子的吸收截面𝜎时，染料分子很可能处于其基态。在这种情况下，单分子的亮度主要由吸收特性决定，与I呈线性关系，根据下式确定激发速率。对于高照明强度I，染料分子在受到光子撞击时已经处于激发状态的概率很高；此时，信号达到饱和并趋近于最大值f∞ × till（图12.5b）。例如，罗丹明的饱和强度为Is ∼ 7 kW cm−2，而Alexa647的饱和强度为Is ∼ 19 kW cm−2。良好的有机荧光团在I = 1 kW cm−2时的激发速率约为106 s−1。因此，增加激发强度可以提高单分子的亮度，但超过Is后，效果趋于平稳。由于亮度是决定单分子在探测器读出噪声中可见性的关键因素，因此可能建议使用高激发强度。然而，大多数生物样本不仅包含特定信号，还包含来自细胞自荧光的非饱和非特异性背景。当激发强度超过Is时，这种背景信号变得越来越占主导地位，最终降低了单分子的可见性（图12.5c）；另见框12.3关于信噪比的讨论。此外，一些荧光团表现出光诱导的闪烁或漂白。在GFP的情况下，随着激发强度的增加，检测到分子处于开启状态的概率降低：在强度约为1.5 kW cm−2时，发现开启和关闭时间相等。暗态寿命与激发强度无关，且相当长，典型的关闭时间约为1.6秒。光诱导闪烁有两个后果：首先，它影响追踪，因为在暗期后很难重新识别移动的分子；其次，对多个开启和关闭周期进行积分会降低平均信号的亮度。这两种效应在图12.6中清晰可见：将GFP融合到Orai1通道中，在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中以10 kW cm−2和1 kW cm−2（照明时间增加10倍）进行成像；因此，在这两种情况下，总激发能量是相同的。在低激发功率下的测量获得了更长且略亮的轨迹。

总之，选择合适的激发强度对于单分子成像至关重要。例如，通过将10 mW激光聚焦到宽度𝜎 = 12.5 μm，可以获得约1 kW cm−2的峰值激发强度。然而，需要注意的是，TEM00激光的强度呈高斯分布，因此在𝜎范围内降低至约66%，使得激发分布相当不均匀。因此，可以通过增加照明区域和功率来获得均匀照明的视场，并通过场阑将其限制在高斯分布的中央部分：在𝜎 = 25 μm和功率为40 mW时，可以获得相同的激发强度，但此时在半径为12.5 μm的中心圆内，信号仅降低了10%。还可以通过用倏逝波照射样本来获得更高的激发强度：在玻璃/水界面处，照明强度可增加至五倍（见框12.2）[11]。

照明时间#

增加照明时间（till）是提高单分子亮度的另一种方法。然而，必须确保till短于要测量的分子动力学时间和光漂白时间（对暗期进行积分只会增加背景信号）。特别地，长的照明时间可以平均掉闪烁荧光团的暗中间态，从而提高可追溯性（图12.6）。

偏振#

弧灯或白炽灯的辐射是非偏振的（更准确地说，它包含垂直于波矢的各种不同偏振角），而激光器发射的是偏振光。荧光团与电磁辐射的相互作用就像偶极吸收器一样。因此，激发速率需要修改为(𝜆ill𝜎/hc)I cos2 𝜑，这与分子偶极矩和电磁偏振之间的角度𝜑有关。在角度𝜑 = 0°时获得最佳激发。自由旋转的荧光团将以降低的速率被激发，该速率由cos2 𝜑的平均值决定（在三维自由旋转时，cos2 𝜑 = 1/3；在与光轴垂直的二维平面内自由旋转时，cos2 𝜑 = 1/2）。在这种情况下，任何偏振方向都可以用于激发。然而，如果荧光团的取向受到限制，则需要更详细地考虑激发光的偏振。例如，两亲性碳菁染料DiI整合在脂质膜中，使得发色团偶极平行于膜表面；因此，它可以在膜平面内旋转，但平面外的运动受阻。因此，线性偏振光（其偏振方向垂直于膜表面）无法激发DiI。为了捕获更多荧光团取向，研究人员经常在激发路径中插入四分之一波片，以转换为圆偏振光。反过来，这些效应可以用于深入了解膜拓扑结构。一般来说，柯勒照明不是激发偶极矩平行于光学z轴的荧光团的有效方法。然而，有些照明配置在z方向具有显著的电场分量：在全内反射（TIR）配置中，如果使用p偏振光进行激发，倏逝场包含z分量（见框12.2）[11]；聚焦激光束（如共聚焦显微镜中使用的）包含纵向场分量，这些分量可以通过环形照明等方式进一步增强。从锥形光纤尖端发出的光（如近场扫描光学显微镜（NSOM）中使用的）包含沿光纤轴的分量。

波长#

激光光是单色的，因此能在所需的光谱区域提供功率，而灯是多色的，因此只有一小部分光在所需的光谱区域发射。目前，在整个可见光谱范围内都有足够功率（数百毫瓦）且价格合理的激光器可供使用。因此，所使用的波长主要由科学问题决定。例如，在细胞生物学应用中，必须将目标分子与内源性自荧光区分开来。已经从光谱特性、寿命和空间分布等方面对细胞自荧光进行了表征。在可见光范围内，黄素和脂褐素被视为主要来源。黄素主要位于线粒体中，而脂褐素主要位于溶酶体中。在荧光图像中，这两种细胞器均表现为随机分布在细胞质中的斑点。这些斑点的荧光强度即使在单个细胞内也有很大的变化，这使得明确区分荧光团和自荧光成为一项具有挑战性的任务。

通常来说，自荧光结构的亮度随着波长的增加而降低，因此选择600 nm以上的红光激发是一种务实的选择。然而，通常情况下，生物学问题决定了要使用的激发波长。在这种情况下，最有前景的策略是通过其特征颜色将所使用的标记与自荧光区分开来。或者，可以使用光开关荧光团作为标记，这允许使用锁定技术来特异性地识别探针。

准直#

与灯相比，激光器另一个主要优点是光束高度准直。一方面，这允许将激发光聚焦到小至衍射极限的区域。因此，照明可以限制在感兴趣的区域，而无需在使用灯结合场阑时不可避免的损失。另一方面，柯勒照明可以实现极高质量的平面波；换句话说，波矢的范围极窄。这是设置高质量全内反射荧光（TIRF）显微镜的重要要求（见框12.2）。

探测器#

一个优质的相机对于成像系统的最佳性能至关重要。像素大小和噪声是决定单分子图像质量和信息含量的关键参数。本文将讨论单分子实验对像素大小的特定要求，并简要描述典型相机类型的噪声特性。

像素大小#

相机将图像划分为称为像素的小方块，每个像素被分配特定的强度数值。制造商提供的相机像素大小范围广泛，约在5至30微米之间；以下我们定义物平面上的像素大小为s，因此我们将物理像素大小除以放大倍数M。在标准显微镜应用中，像素大小通常根据奈奎斯特定理选择，该定理指出，要以采样频率≥2f实现频率为f的周期正弦波的忠实重建。应用于显微镜时，该标准定义了最大像素大小s≈FWHM/2：使用更大的像素（“欠采样”）会限制所获得的分辨率。反之，使用更小的像素（“过采样”）并不会产生额外的结构信息。当光子数量有限时，过采样甚至是有害的：从衍射极限点发出的光会分布在多个像素上，从而增加散粒噪声并降低点的可见度。

单分子应用为探测器像素大小的适当选择增加了额外的限制。最显著的变体是利用低于衍射极限的精度对单个荧光团进行定位（见12.2.4节和第8章）。Thompson等人给出了一个公式，用于计算实现点发射器最佳定位精度（LP）所需的像素大小：(s/FWHM)4 = 3000𝜋(N2/F)，其中N表示背景噪声，F表示检测到的光子数（注意，我们此处通过FWHM指定光斑大小，因此得出的前置因子与Thompson等人的不同）[9]。图12.7显示，最小值相当宽泛，向更小和更大像素的倾斜陡峭：过小的像素会增加光子噪声，而过大的像素基本上只会产生一个明亮的像素，无法提供关于分子的亚像素位置的更多信息。

单个荧光团是电偶极发射器，当置于具有不同折射率的两种介质的界面附近时，会与反射回来的电磁场相互作用。因此，根据偶极矩相对于样品表面的倾斜角度和离焦情况，所获得的单分子图像可能会与高斯分布大相径庭。特别是，倾斜角度约为45°时会产生不对称图案，质心位置发生偏移[12]（图12.8）。只有过采样才能捕捉到这种效应。

CCD相机#

单分子领域的大多数研究人员使用最先进的电荷耦合器件（CCD）相机。高量子产率和低读出噪声是获得最佳图像质量的前提条件。通过薄蚀刻CCD芯片，使光穿过背层（背照式），可以实现高量子产率；制造商规定的量子产率可达90%。图像质量严重依赖于噪声水平，而噪声水平主要由特定信号（Nsignal）和非特定背景（Nbackground）的散粒噪声、暗信号（Ndark）和读出噪声（Nreadout）决定：Ntotal = √N2 signal + N2 background + N2 dark + N2 readout。通过深度冷却探测器可以将暗电流降至最低，并且通常可以忽略不计。读出噪声主要由探测器的数字化速率决定，即每秒可读出的像素数量。低读出噪声难以实现，只有在低数字化速率（通常为50–100千赫）下才可能实现，这使得此类设备相当缓慢。系统的读出噪声在50千赫读出速率下约为每像素两个电子。对于此类探测器，读出噪声可以忽略不计，信号和背景的散粒噪声将占主导地位。

在低数字化速度（低于100千赫）下，全帧读出需要几秒钟。即使读出100×100像素的子区域（足以成像一个小的单细胞），也至少需要200毫秒。尽管这一时间分辨率足以观察细胞内运输等现象，但分子水平上的重组过程通常发生在更快的时间尺度上。为了解析这种快速动力学，一些制造商提供了基于多帧传输的特殊操作模式。在此模式下，仅使用nx×ny像素的子区域进行观察。在照明时，该子区域会快速移动到芯片上的遮蔽区域，并暂时存储在那里；光电子可以在每行几微秒内转移到相机芯片上。读出过程在几个照明/移动周期后执行，并且与此定时协议无关。

电子倍增CCD相机#

自20世纪90年代以来，通过使用图像增强相机实现了连续和快速成像；然而，这类设备的缺点是量子效率较低、分辨率较差，并且存在额外的自发增强器噪声，使得这类图像的量化变得困难。最近推出的电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机在快速读出前利用片上电子放大：在读出寄存器之后增加了一个额外的串行倍增寄存器，在电荷-电压转换前提供低噪声增益。使用EM-CCD，可以在高量子产率（≤90%）和最佳分辨率下实现快速和连续读出，有效读出噪声<每像素1个电子。然而，由于放大作用，任何检测到的信号的有效噪声也会增加。倍增寄存器由n个级组成，每个级以概率𝛼≈0.01放大光电子，产生总增益G=(1+𝛼)n；在以下计算中，我们使用n=536。EM-CCD的荧光信号F和噪声N通常参考到图像平面，以便与非放大探测器进行比较（F→F/G，N→N/G）；以下我们将使用这些参考值。统计分析和实验数据显示，由于放大作用，噪声增加了2倍（N2 EM-CCD=2N2 CCD）。因此，EM-CCD的特性为Ntotal=√2(N2 signal+N2 background+N2 dark)+(Nreadout∕G)2。与非放大CCD相比，存在两个主要差异：可以通过增加增益（最后一项）来有意降低读出噪声，但特定和非特定信号噪声更大（前两项）；同样，暗噪声不太重要，因为可以通过冷却芯片来基本上消除它。

与非放大CCD相比，其优势在于可以以极高的速率和低读出噪声读出芯片：5兆赫的芯片可能以每像素50电子的读出噪声运行；因此，对于通常应用的增益高达G~1000，最后一项噪声将消失（有效读出噪声≪每像素1个电子），因此该设备可以在散粒噪声限制下工作。然而，请注意，与慢扫描CCD相比，由于额外的放大噪声，图像质量会降低。如果检测分子是主要目标，并且没有额外的背景影响图像，这可能是可以接受的。但是，当需要从非特定均匀背景中区分特定信号时，降低的可见度就会变得相关（图12.9）。

在图12.9b中，我们通过模拟成像过程来比较CCD和EM-CCD的性能。不同亮度的单个发射体被安排在背景梯度上。对于CCD成像，我们添加了读出噪声Nreadout=2电子，对于EM-CCD成像，我们模拟了增益G=1000的倍增，并添加了Nreadout=50电子。请注意，为CCD相机推导的定位和亮度误差的分析表达式（下文讨论）不能直接应用于EM-CCD；然而，将检测到的信号替换为F∕√2G可以提供合理的估计。此外，请注意，由于未知的绝对增益设置，可能会妨碍不同设备获得的数据的比较。相机制造商试图通过提供增益校准选项来解决这个问题。

CMOS探测器#

虽然基于互补金属氧化物半导体（CMOS）的成像器具有大规模并行读出的可能性，能够实现极高的帧率，但迄今为止，其较差的噪声特性使得单分子应用不可行。新型科学CMOS相机以极低的读出噪声（约2–3电子）运行，显示出极高的前景。

单分子信号分析：位置、方向、颜色和亮度

可用于表征染料分子i的参数有多种，例如，其随时间变化的位置[xi(t), yi(t), zi(t)]、激发或发射偶极子的方向[𝜗i(t), 𝜑i(t)]、吸收和发射光谱[Abi(t), Emi(t)]，以及亮度Fi(t)。若将染料分子视为报告分子，则可利用这些参数来深入了解其局部环境，例如，局部黏度𝜂(x, y, z, t)、运动类型（定向运输、随机扩散、受阻扩散等）、空间排列、与其他分子的局部邻近程度、结合程度或构象变化。

二维定位

我们可以将单个分子的定位精度提高到远低于实际信号宽度的水平；在信噪比高的情况下，甚至可以达到亚纳米级的精度。在估计分子位置时，需要关注两个问题：• 在将已知函数拟合到图像上时，横向坐标的误差是多少？• 拟合函数是什么？

文献中存在多种方法，其中许多源自单颗粒追踪研究。实际上，自由旋转染料的信号分布可以用高斯函数（式（12.1））很好地近似[13]；因此，这些算法和相应的表征也适用于单分子追踪。在最早的方法之一中，Bobroff基于卡方拟合进行处理，并计算了高斯点扩展函数的定位精度（LP）；他发现信噪比是决定误差的主要因素[14]。随后，人们引入并比较了更多用于定位单分子信号的方法：与质心估计相比，对高斯函数进行非线性最小二乘拟合产生的偏差更小、精度更高。Thompson等人测试了一种高斯掩模算法，其表现有趣的是，仅略差于非线性最小二乘拟合[9]。

此外，Thompson等人还非常详细地探讨了探测器上像素大小为s的高斯信号的定位精度，得出了每个维度的总定位精度为（另见图12.7及上文关于像素大小的讨论）[9]；其中，F和N分别表示总荧光光子数和背景噪声，FWHM是高斯函数的全宽半最大值。第一项主要考虑了光子计数噪声和像素化噪声：即使在无噪声背景（N=0）的情况下，单个荧光团的定位也存在极限，这源于信号本身的泊松波动。Ober进一步探讨了这一特定方面，他计算了高斯形信号分布定位精度的基本极限[15]。方程中的第二项考虑了背景噪声；在高噪声水平N下，定位误差与信噪比的倒数成正比。

然而，当偶极发射器在方向自由度上被固定或受到某种约束时，可能会显著偏离高斯函数。例如，目标分子经常在水/玻璃界面附近进行测量，并使用高数值孔径（NA）物镜进行全内反射（TIR）激发。如第12.3.3节所述，表面邻近偶极子的发射具有高度各向异性，在全反射的临界角处有一个明显的最大值。由于数值孔径高，TIR物镜甚至可以捕获超临界角的电磁辐射。计算了包括轻微像差或离焦图像在内的不同场景下的发射模式。特别是，对于相对于光轴倾斜的发射偶极子，可以观察到中央最大值的不对称性。在这种情况下，使用对称高斯函数进行拟合会导致位置产生显著偏差，高达10纳米[12]（图12.8）。

Mortensen等人提出了最全面的单分子定位理论，他们将单个发射器视为偶极子[13]。他们提供了框架来分析在TIR配置下激发的固定或自由旋转偶极子。基于最大似然估计器，推导出了x和y位置（以及对于固定发射器的情况下的方位角和极角）的估计值。比较了不同的拟合方法，结果显示，与最大似然估计器相比，最小二乘估计器的不确定性高出了约70%。最后，提供了公式来估计最大似然拟合和最小二乘拟合的定位误差。Smith等人展示了如何在视频卡的图形处理单元上实现这样的最大似然估计器，计算速度提高了约80倍[16]。许多研究人员优化了数学拟合过程以提高定位精度。然而，最终人们关注的并不是绝对坐标，而是相对距离，例如移动粒子的位移或作为单个斑点可分辨的不同附近荧光团之间的距离（例如，闪烁分子或不同颜色通道中的分子）。在校正漂移后，发现相机芯片上不同像素的光响应并不均匀，这限制了纳米尺度下单分子定位的最终精度。

沿光轴的定位#

在二维平面上定位点发射源在概念上是直观的，但确定其在光轴上的位置则更具挑战性，因为发射图案的质心不受z坐标的影响。以下，我们将介绍两种方法。

点扩散函数形状的分析#

一个离焦的点发射源会产生一个特征图像，该图像由显微镜的点扩散函数描述，并编码了染料沿光轴的位置（若要详细分析，还需考虑染料的偶极取向，但对于快速旋转的分子，这一点可以忽略不计）。通常，离焦信号的横向宽度会根据位置z0按以下方式变化：

其中，𝛿z表示离焦距离，FWHM0是聚焦图像的点扩散函数宽度，DOF = π𝜎²₀/𝜆是焦深；在焦深（DOF）以下的小幅离焦情况下，它呈现出抛物线行为，而在DOF以上的离焦情况下，则呈现线性关系。可以通过记录不同焦平面的多个图像来获得z坐标。这可以通过使用z向压电陶瓷快速移动物镜来实现。或者，也可以通过将发射光分成多个路径，每个路径的焦平面略有偏移，从而同时记录多个平面。通过在显微镜的发射路径中插入一个长焦距（~1米）的圆柱透镜，可以进一步强调点扩散函数的z依赖性，从而产生人为的像散[17]（图12.10）。假设圆柱透镜与横向坐标系对齐；因此会产生两个焦点，一个用于沿圆柱透镜轴（例如x轴）的分量，另一个用于垂直分量（y轴）。两个焦点之间的距离为2𝛾，其中𝛾称为像散，是圆柱透镜焦距的函数。在这种配置下，强度分布呈椭圆形扭曲，与exp{−[(x − x0)²/2𝜎²x] − [(y − y0)²/2𝜎²y]}成正比（回顾FWHMx,y = 2.35𝜎x,y），在聚焦过程中，扭曲从x轴转换到y轴。因此，扭曲程度表明了分子是位于当前焦平面的上方还是下方，以及距离该平面的距离。可以通过单个焦平面的记录，通过椭圆扭曲计算z位置：当𝜎x > 𝜎y时，z0 = (DOF/𝜎0) √(FWHM²x − FWHM²0 − 𝛾)；当FWHMx < FWHMy时，z0 = (DOF/𝜎0) √(FWHM²y − FWHM²0 − 𝛾)。这种方法实现了固定细胞中的三维超分辨率成像。请注意，使用油浸物镜可能会产生额外的球差，在重建三维图像之前需要对其进行校正。

W. E. Moerner团队最近引入了一种对点扩散函数的更强修改（图12.11）：他们使用空间光调制器生成了双螺旋点扩散函数[18]。在这种配置下，一个点发射源被成像为两个相邻的斑点，斑点之间的角度编码了z位置。沿z维度可以指定低至20纳米的单分子定位误差（在x和y维度上获得了约12纳米的误差）。双螺旋方法在定位不完全位于焦平面上的物体时表现尤为优越。通常，沿光轴的单分子定位精度低于沿径向的定位精度。要实现各向同性分辨率，需要记录物体的侧视图，这可以通过在发射源附近使用倾斜镜来实现；在这种情况下，可以在同一探测器上同时获得前视图和侧视图。

沿光轴的强度图案#

或者，也可以通过利用激发强度或检测效率的变化，通过亮度来编码z坐标。如果样本位于玻璃载玻片附近的界面上，倏逝场的指数衰减会使得染料随着与表面距离的减小而变得越来越亮，并且——对于已知的衰减长度——提供了相对距离测量。请注意，在物镜型全内反射（TIR）配置中，不仅激发强度会随z坐标变化，检测效率也会变化，因此最好对单分子亮度的z依赖性进行独立校准。

亮度#

在单分子显微镜中，从单个点光源检测到的光子数F是一个重要参数，因为它是研究各种分子特性（如分子缔合、染料取向或颜色，详见下文讨论）的基础。在实际操作中，它是给定焦平面上点扩散函数在背景上的积分（见式（12.1））。然而，亮度本身并没有一个明确的定义，因为它取决于实验性质，如光学系统的检测效率和激发强度。不过，在给定设置下，亮度在对比实验中可能是一个有价值的特性。基本上，单点中的光子数可以通过与计算其横向位置相同的数学方法来计算。

在进行亮度分析时，研究人员会遇到两个主要问题：1. 从单点发射器捕获的光子数是多少？Thompson等人使用最小二乘法对高斯函数进行拟合[9]。他们提供了关于F（作为检测到的总光子数的函数）的误差分析，在高信噪比下，该误差近似于计数误差的平方N²F≈F。高斯拟合在背景信号围绕零波动且不显示空间变化的情况下效果很好。然而，在活细胞实验中，数据通常包含大量的自体荧光贡献。在这种情况下，一些科学家更倾向于计算所有像素的光子计数总和减去局部背景。2. 先验相同的分子的计算亮度是否存在差异，这些差异是否会增加误差？例如，激发强度或跃迁偶极子取向的横向或时间变化会导致亮度变化增加。与猝灭剂的距离变化可能会进一步加剧亮度波动。因此，细胞内移动分子的单分子亮度显示出比散粒噪声预期的更强烈的波动。

取向#

有机染料是具有特定取向的偶极子，因此可用于获取与其连接的基团的取向信息。可以研究构象变化或旋转。获取单分子偶极取向信息的标准方法有两种。

偏振显微镜#

荧光团对光的吸收取决于激发光的偏振方向与染料吸收偶极取向之间的夹角。使用线偏振光进行激发，可以通过测量荧光信号的调制来确定单个荧光染料的取向，这相当于测量单个染料分子的线性二向色性。此外，通过在显微镜的发射路径中引入偏振分束器，可以确定荧光团发出的荧光信号的偏振状态。将偏振激发与发射偏振的确定相结合，可以对单个分子进行稳态各向异性测量，从而为探测单个分子的重新取向提供了纳秒时间尺度的可能性。标准偏振显微镜的基本局限性在于它仅限于研究染料分子取向的面内分量。然而，全内反射（TIR）配置下的照明包含沿z轴的强分量，这可用于获取方位角和仰角的信息。

离焦成像#

如前所述，通过高数值孔径（NA）物镜对表面上的单个分子进行离焦成像（通常约为500纳米），会产生包含发射偶极三维取向信息的特征侧瓣。

颜色#

多色显微镜技术已在活细胞生物学，以及相应的单分子显微镜和光谱学领域成为常规手段。其基本思想是通过不同荧光团的特征激发或发射光谱来区分它们（进而区分它们所附着的生物分子）。理想情况下，我们希望能够同时记录多个荧光团的分隔良好的信号。然而，典型的激发和发射光谱通常较宽，导致不同染料之间存在显著的重叠。如果假设发射体之间不相互作用，那么每个像素上检测到的总信号Ftot就是各个荧光团光谱贡献的线性组合，即Ftotal(𝜆ex, 𝜆em) = ∑i𝛼iFi(𝜆ex, 𝜆em)，其中𝛼i表示第i个荧光团的贡献。这些信号取决于所选的激发波长𝜆ex和发射滤光片的设置𝜆em。线性解混是确定系数𝛼i的标准程序。在单分子水平上，同样可以获取光谱信息。然而，单分子方法还提供了额外的优势。让我们考虑一个用多种颜色标记的样本。

首先，如果所用染料的激发或发射光谱分离良好，以至于可以单独寻址不同的染料种类而不发生串扰，那么就可以实现超分辨率显微镜[10]（见框12.1和图12.2）。概念上最简单的例子是两个不同颜色发射体之间的距离测量。在低温下，van Oijen等人利用极窄的均匀线宽，在光谱上选择并定位了许多单个并五苯分子[19]。

其次，可以通过在两个检测通道中测量的计数比率来确定单个荧光团的发射特征，例如使用双视场系统。这样，即使发射体高度相似，仍然可以根据它们发射光谱中的细微差异来区分[20]（见图12.12）。

从单分子信号中学习#

记录的单分子参数可进一步处理，以深入了解生物样本。在此，我们将基于实际场景，讨论单分子方法的优势及潜在陷阱。

分子结合状态的确定#

乍一看，利用单分子测定技术进行相互作用研究似乎很有吸引力。其原理很简单：如果能检测到单个分子，那么就应该可以量化共定位情况。实际上，自超灵敏生物分析技术问世以来，为每个观察到的荧光斑点确定其实际组成就一直是一个关键目标。根据所研究的问题，可以选择不同的方法：

观察到的信号是否源自单个分子发射体？单分子发射体最显著且独特的特征是其在单一步骤中的不可逆消失。如果在明确定义的亮态和暗态之间存在任何量子跃迁，也进一步表明观察到了单个发射体分子。为了区分单个发射体和发射体集合，还可以利用光子反聚束效应——即在荧光寿命内光子的反相关发射。通过实时反馈对量子点进行三维追踪，甚至可以测量自由扩散粒子的反聚束效应。最后，还可以通过旋转激发偏振来测量染料分子的吸收偶极子。然而，由于需要记录多张图像，这种方法仅适用于缓慢旋转的分子。
在一个孤立的、受衍射极限限制的斑点中，有多少发射体共定位？在寡聚体结构的光漂白曲线中，通常可以区分出明确定义的亮度水平[21]（图12.13a）。亮度水平的数量直接给出了簇的大小。这种方法特别适用于表征固定分子，其中信号和背景变化是可管理的。

在高度荧光环境中（例如，细胞膜中扩散的蛋白质）表征移动簇时，可能难以明确分配亮度水平。原因是移动分子会遇到不同的环境，这些环境可能会影响亮度水平F：非特异性背景可能在细胞的不同区域之间有所变化，从而使得难以准确估计特定信号，且容易出错；如果使用全内反射（TIR）激发，目标分子沿光轴的运动将导致激发强度发生变化；此外，由于激光散斑的存在，激发强度还可能存在其他不均匀性。在这种情况下，可以回归分析亮度直方图，以估计单体、二聚体等的存在及其比例。假设从单个斑点记录的亮度水平的概率分布由𝜌(F)表征，且单个染料分子的亮度由𝜌1(F)给出。如果染料独立发射，则n个共定位发射体的分布可以通过卷积𝜌n(F) = ∫𝜌1(F′)𝜌n−1(F − F′)dF′数值计算得出。然后，可以用n聚体信号分布𝜌(F) = ∑n=1nmax𝛼n •𝜌n(F)的线性组合来拟合𝜌(F)[22]（图12.13b）。最后，当可以使用两种不同的颜色时，可以通过共定位测量以高精度和高灵敏度检测到二聚体的存在。

通过荧光共振能量转移（FRET）确定分子构象#

通常，大型生物分子（如蛋白质或核酸）并不会采用由明确能量最小值所决定的单一构象；相反，大多数大分子在不同构象之间表现出高度动态的转变，其中一些构象转变直接与其功能相关。表征构象状态和转变，并将其与生物分子功能联系起来，是研究的核心兴趣所在。

FRET是首批用于在溶剂中获得生物分子结构见解的方法之一（见第13章）。人们很快意识到，FRET非常适合作为单分子实验中的读出参数：它能够捕获异质样本中的静态或动态中间体[23]。理想情况下，我们希望（i）精确地；（ii）定量地；（iii）随时间地；（iv）直接在自然环境中；以及（v）非侵入性地记录构象。然而，生化和光学方面的实验限制使得这些目标的兼容性受到限制。

精确测量：大多数研究人员通过敏化受体发射来计算表观FRET效率：

其中，FAem Dex和FDem Dex分别表示在供体激发时检测到的受体和供体荧光。例如，可以使用第12.3.1节中描述的双视系统来记录数据，该系统允许同时测量FDem Dex和FAem Dex。𝛾 = ΦA𝜂A/ΦD𝜂D是一个检测校正因子，取决于供体和受体的量子产率（ΦD, ΦA）以及检测效率（𝜂D, 𝜂A）[24]；通常，0.5 < 𝛾 < 2。在许多情况下，这种分析提供了足够的信息来识别不同的分子构象以及随时间发生的相应转变（图12.14a）。然而，存在一些生化和光物理限制，使得这种直接的比率方法容易出错：每个目标分子必须以1:1的化学计量比标记上供体和受体；每种染料必须处于活性状态，即未发生光漂白且不在瞬态暗态；量子产率必须稳定，以便𝛾和Förster半径r0保持不变。因此，在单分子FRET实验中，随后用单独的激光激发受体已成为常见做法[24]。这样的数据集提供了每个目标分子中活性荧光基团的数量信息，并允许计算𝛾。在二维直方图中，可以将EFRET绘制为S = (FDex∕FDex) + FAex的函数，其中FDex和FAex分别是基于供体和受体激发的发射总和（图12.14b）。这样的图例如允许区分构象亚群；此外，可以识别和拒绝来自不包含活性供体和受体荧光基团的分子的数据。

定量测量：目前大多数可用的蛋白质构象都是基于高分辨率X射线晶体学数据。然而，这些数据是在静态实验（柔性结构域不产生可分析的信号）和非天然环境中获得的。因此，用单分子FRET研究来补充晶体学数据显得很有吸引力。原则上，可以从记录的FRET效率直接计算出供体-受体距离。因此，可以设想一个实验，其中蛋白质的两个位置被特定位点标记上供体和受体染料，并计算出染料间的距离；通过对多个位点进行实验，可以获得蛋白质构象的信息。Muschielok等人通过测量大分子复合物上特定结构域（标记有FRET供体）与复合物上明确定义位置上的受体之间的距离，定位了该结构域，从而很好地演示了这一想法[25]；他们使用三角测量法来计算供体位置的概率分布。在将这种方法应用于其他目标分子之前，还需要考虑一些因素：首先，必须确保标记不会影响蛋白质结构。其次，FRET效率不是供体-受体距离的直接度量，而是取决于多个其他参数（见框12.4和第13章）。特别是，很难考虑供体相对于受体的方向；因此，大多数研究人员尝试通过柔性间隔基将染料连接到蛋白质上（以便可以假设𝜅2 = 2/3）。这带来的不利影响是，每种染料的位置不够明确，从而导致距离确定时出现误差。
动力学测量：FRET允许直接观察影响供体和受体之间距离的大分子的构象变化。基于相机的系统与全内反射荧光（TIRF）显微镜结合使用，可以捕获包含单个状态之间一系列转变的单分子轨迹，从而确定动力学速率常数[23]。快速相机的引入提高了时间分辨率，因此如今可以在20毫秒的时间分辨率下检测到低至ΔEapp = 0.08的FRET变化。此外，在共焦配置中，可以利用单光子雪崩二极管（SPAD）的皮秒时间分辨率，使得探测器的采集时间不再限制构象转变的解析。实际上，共焦检测方案甚至允许捕获溶液中分子的FRET变化；但这些变化必须发生在分子在激光光斑中的停留时间内。
体内/体外测量：到目前为止，单分子FRET显微镜的大多数应用都是在体外进行的，即在背景低且含有防止光漂白添加剂的明确缓冲液环境中。除了环境更具问题性外，在活细胞环境中标记生物分子也并非易事。使用融合蛋白的标准分子生物学方法在单分子水平上几乎不适用，因为特别是可用蓝色生色团的光物理特性不合适。一种方法是纯化感兴趣的蛋白质，在体外用有机染料对其进行标记，然后将其微注射到细胞中。
非侵入性测量：确保感兴趣分子在实验过程中保持其构象是很重要的；特别是，与表面的相互作用可能会暂时稳定底物或影响染料的光物理特性，从而调节转变动力学。固定单个生物分子的另一种方法是将其封装在表面锚定的囊泡中，这可以避免与玻璃盖玻片的相互作用。作为一个小缺点，这种方法使得改变生物分子的环境变得困难。引入孔（无论是蛋白质孔还是内在脂质孔）有助于促进小分子的交换。

单分子追踪#

在确定时间t记录的帧中所有分子的坐标后，我们希望能够将图像关联起来，并随时间追踪单个分子。最近邻算法常用于自动重建单分子轨迹。我们最近描述了一种算法，该算法即使在表面密度较高时也能稳健工作[26]：

• 追踪：比较连续图像中拟合的单分子位置。为此，我们测试是否在图像i+1中能找到一个分子，该分子与图像i中识别的任一分子之间的距离r小于Rmax。换句话说，图像i中的所有分子都被一个半径为Rmax的圆所包围；如果图像i+1中恰好有一个分子位于这个圆内，则将其与图像i中的相应分子连接起来（图12.15a）。如果一个圆内包含多个分子，则轨迹在特定的图像i处终止。整个过程贯穿整个序列，从而得到单分子轨迹。需要注意的是，在表面密度较高时，一些轨迹可能会被切成两个或多个片段，或者被删除。

• 追踪算法测试：通过分析不同时间滞后tlag下的位移r来分析轨迹。根据均方位移（msd）随tlag的增加，可以通过msd = 4Desttlag估计扩散常数。Dest是圆半径Rmax的函数，根据

显然，对于较小的Rmax值，Dest趋近于零，因为此时长步长被排除在分析之外。对于较大的Rmax，Dest在扩散常数的正确值处显示出平台期（图12.15b，c）。已经引入了多种额外的基于最近邻的追踪算法，这些算法明确考虑了闪烁和高荧光团密度。还引入了一种基于模糊逻辑的方法用于囊泡追踪，该方法量化图像相似性。有关不同算法的客观比较，请参阅[27]。最后，应该指出的是，单分子流动性的确定——即使在不同移动组分的情况下——并不需要重建轨迹，因为分子位置的相关性已经提供了所需的信息[28]。

检测转变#

通过识别不同状态之间的转变，可以进一步分析单分子轨迹。这些转变可以是示踪剂流动性的变化、亮度、颜色或任何其他记录参数的变化。Saxton[29]首次尝试了空间分析，即识别单个轨迹内的瞬时受限区域，他计算了流动性为D的随机行走者在时间t内意外被限制在半径为R的圆内的概率：log 𝜓 = 0.2048 − 2.5117(Dt/R2)。反过来，这个公式可以用来确定瞬时受限的概率分布，其特征参数为L = −log(𝜓) − 1。轨迹中高于某个阈值（L > 3.16）的片段通常被归类为受限，而轨迹的其余部分被归类为自由扩散。该算法在检测假阳性事件方面相当稳健；然而，容易遗漏受限情况。最近，Montiel等人介绍了一种基于测试的方法，用于识别两个不同扩散常数之间的转变点[30]。最后，对轨迹进行分段允许对每个段进行局部均方位移分析，以识别例如受限扩散的区域。此外，检测固定点亮度变化也很有趣，例如用于分析由于FRET效率转变引起的构象变化、用于关联分析中的光漂白步数计数，或用于光漂白定位显微镜中确定n个活性荧光团的片段。除了不同研究小组开发的大量即兴解决方案外，还有基于最大似然估计或贝叶斯统计的相当通用的方法可用。