【Nat.Methods】用双光子高效看清脑深部神经元电信号：侧向-时间复用成像技术解读#

论文针对双光子神经元电压成像中信号弱、易光褪色、成像范围小以及难以兼顾速度与深度的难题，开发了一种名为 FlatMux 的侧向-时间复用成像平台。研究团队通过巧妙的光学腔设计，实现了 28 倍的时间复用，在保证单脉冲单像素激发、降低光毒性与光褪色的同时，成功实现了在千赫兹/数百赫兹高帧率下对活体小鼠皮层进行大视野、深层（可达 500 微米深度）及双平面（如皮层 L2/3 与 L4 层）的神经元电信号与动作电位记录。

活体神经元电压成像面临的三大资源瓶颈#

了解神经元网络如何处理信息，需要同时记录大群神经元的电活动。基因编码电压指示剂能够直接反映细胞膜电位变化，时间响应比钙指示剂快数十倍，但这种技术在活体双光子成像中遇到了严苛的光物理限制。

为了捕捉毫秒级的动作电位，成像帧率通常需要达到千赫兹水平。然而，指示剂只分布在薄薄的细胞膜上，荧光分子数量少且亮度低，在极短的像素停留时间内能够收集到的光子数非常有限。传统双光子显微镜使用约80兆赫兹重复频率的激光器配合机械扫描，导致脉冲在样品上的空间间隔过密。这种空间过采样浪费了视野资源。由于单个脉冲能量很低，通常需要累加多个相邻脉冲的光子才能获得可用的信号，但这种方式获得的总荧光效率远低于将等量能量集中在单个脉冲中的效率，浪费了能量资源。

此外，当指示剂分子以高于1兆赫兹的频率被重复激发时，分子在通过长寿命暗态回到基态的过程中容易吸收第二个光子，从而显著加速光褪色。而在时间资源上，典型荧光分子的寿命约在数纳秒，80兆赫兹脉冲之间12.5纳秒的时间间隔并未被充分利用。低信噪比、快速光褪色以及深部组织散射导致的信号衰减，使得双光子电压成像长期局限于浅层皮层或极少数神经元。

Fig. 1: FlatMux schematics for generating 28-fold lateral temporally multiplexed light beads.#

重构光物理资源的侧向-时间复用架构#

研究团队从光物理过程的第一性原理出发，提出了光学采集效率的优化条件：脉冲在样品上的空间间隔应与细胞膜结构相匹配（约1.4微米），且大于焦斑尺寸，实现单脉冲激发单像素；单个脉冲能量接近但低于饱和与褪色阈值；单个分子的激发频率控制在1兆赫兹以下；脉冲间的时间间隔与荧光寿命（约7纳秒）相匹配，以消除像素间的交叉串扰。

基于这一逻辑，研究者开发了名为 FlatMux 的侧向-时间复用成像平台。系统采用4.93兆赫兹重复频率的高能量激光源，首先通过衍射光学元件将单束激光拆分为14束，并在定制的8f光学谐振腔内循环。每循环一周产生13.3纳秒的时间延迟，同时保持束间位置平行偏移，从而在出口处输出时间上按序排列的14个光珠。随后，光线进入翻倍模块，利用偏振光束调节与额外6.7纳秒的光程差延迟，将光珠数量扩充至28个，实现了7纳秒间隔的侧向时间复用。

Fig. 2: Large-FOV neuronal voltage population imaging.#

为了解决扫描过程中焦斑大小与光束间距的耦合问题，研究者在腔体后引入微透镜阵列，独立缩减每个光珠的焦斑尺寸，同时维持整体扫过范围。这种设计既保证了单脉冲激发单像素的物理条件，又将分光产生的多个焦点通过高速振镜同步扫过样品，在不依赖过采样的情况下大幅拓展了单次扫描的物理面积。

Fig. 3: High-speed neuronal population voltage imaging at 2 kHz.#

Fig. 4: Deep-tissue neuronal population voltage imaging at of spontaneous cortical activity at 500 μm depth.#

Fig. 5: Simultaneous dual-plane neuronal population voltage imaging of mouse cortical L2/3 and L4 neurons.#

多工作模式下的实验证据链评估#

研究团队在活体小鼠皮层开展了多维度的验证，提供了互相印证的实验数据。

在大视野模式下，28个光珠在侧向平铺，对小鼠桶状皮层和后顶叶皮层 $590 \times 400$ 平方微米区域进行 750 赫兹帧率的连续记录。在200微米深度下，系统单次记录到了106个表达 JEDI3sub 的神经元，对胡须刺激的动作电位响应做出了高灵敏度提取，对刺激诱发的起始与偏移时间常数给出了毫秒级测定。跨神经元交叉相关分析表明，相距超过150微米的神经元对在自发活动中依然保持显著的电信号同步性。对比实验显示，单脉冲单像素激发模式在连续成像90秒内的光褪色程度比传统脉冲重叠模式降低了约50%。

在高速模式下，研究者将翻倍模块的输出光珠在扫描轴上交错重叠，结合振镜转向算法优化，在 $375 \times 200$ 平方微米视野内实现了 2000 赫兹的成像帧率，成功捕捉到表达 FORCE1f 指示剂的神经元发出的间隔仅3毫秒的连发动作电位。

针对深层组织散射问题，研究团队通过关闭翻倍模块的单侧通道，将单脉冲能量提升一倍，在保持总平均功率不超过175毫瓦安全阈值的前提下，实现了对小鼠皮层 500 微米深度（第5层）43个神经元电活动的连续记录，提取出了深部神经元对之间的时域相关特性。

Fig. 6: High-SNR in vivo population voltage imaging in an awake mouse.#

在双平面模式下，利用不同偏振通道的束流发散度差异，系统将28个焦点聚焦在深度相差150微米的两个平面（皮层 L2/3 与 L4 层）。在对180个神经元的同步记录中，清晰揭示了感觉刺激下 L2/3 层神经元相比 L4 层存在 $2.7 \pm 0.5$ 毫秒的响应延迟，与皮层层级信息传递的电生理已知规律完全一致。

系统的适用边界与技术拓展空间#

FlatMux 平台展示了在能量、时间和空间三要素上的调控能力，通过优化光子利用率，打破了双光子电压成像在群体规模和组织深度上的限制。该方法不需要提高总激光功率，避免了高功率照射引发的组织发热与免疫毒性反应，组织学切片验证显示其表达的星形胶质细胞与小胶质细胞激活标志物与对照组无异。

不过，该技术目前依然存在若干客观局限。首先，系统的灵敏度高度依赖荧光指示剂的性能，尽管在配合新型 FORCE1s 传感器时能获得高达9.0的动作电位信噪比，但在低亮度指示剂下对亚阈值膜电位波动的识别能力仍然有限。其次，当前扫描模式中振镜的回转转向占用了约20%的时间开销，这部分时间资源尚未完全转化为有效数据。再者，500微米深度的记录建立在关闭半数复用通道、牺牲一半视野面积的折衷之上，深层散射对光子收集效率的物理衰减依然是无法绕过的障碍。未来若结合选择性区域扫描与自适应光学技术，该架构在深部大群体记录上的表现仍有继续优化的空间。

参考文献：Guo, J., Barber, K., Frechou, M.A. et al. A versatile platform for two-photon neuronal population voltage imaging across cortical depths. Nat Methods (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03158-y