【Nat. Nanotechnol.】突破0.62 Å定位精度！自发无限闪烁上转换纳米颗粒开启多色超分辨
文章标题：Spontaneous and indefinite blinking in upconverting nanoparticles for ångström-precision multicolour super-resolution imaging
通讯作者：Chunte Sam Peng
文章概要
研究团队成功开发出一类基于成分调控的小尺寸上转换纳米颗粒（~10 nm），其在单一近红外激光照射下能够展现出自发且无限度的荧光闪烁行为。该技术无需任何化学还原缓冲液、光开关试剂或复杂的双激光调制，极大地简化了光学成像系统。通过将荧光闪烁的占空比降低至约0.9%，并利用无限次重复定位消除了随机定位误差，研究人员在单颗粒定位中实现了0.62 Å（埃）的亚埃级定位精度。此外，团队成功构建了蓝色与红色双色上转换随机光学重建显微术（U-STORM）探针，并在单蛋白质分辨率下直接观测到了细胞膜上表皮生长因子受体（EGFR）的二聚化及多聚化过程，为生命科学和纳米技术提供了全新的高精度超分辨显微成像平台。
引言
光学显微术受制于光的衍射极限，传统光学显微镜的空间分辨率通常停留在200至300纳米之间，这使得观察10至100纳米尺度内的亚细胞结构（如蛋白质复合物、细胞骨架网络及受体簇）变得十分困难。单分子定位显微术（SMLM）通过在时间维度上随机激活并定位极稀疏的荧光团，将空间分辨率提升到了纳米级别。然而，传统荧光染料和有机荧光团存在严重的光漂白问题，每个发光体仅能释放有限的光子，导致单帧定位精度普遍限制在10至20纳米之间。虽然通过多次重复定位同一个荧光分子可以按定位次数开方的倒数比例降低不确定度，但常规荧光团往往在几秒或几分钟内就会彻底漂白，难以维持长期重复定位。
为了克服传统探针的这一固有缺陷，寻找一种不发生光漂白且能持续自发闪烁的纳米探针成为了超分辨成像领域的重要研究课题。镧系掺杂的上转换纳米颗粒（UCNPs） 因其卓越的光物理稳定性以及能在近红外光激发下发射可见光的特性而备受关注。然而，过去的上转换纳米颗粒通常表现出连续稳定的荧光发射而不发生闪烁，或者需要极高功率密度的激光调控与复杂的双波长激发过程，难以直接应用于低背景、高密度的多色生物超分辨成像。为此，研究团队通过精准的晶体工程与界面缺陷调控，首次实现了无需外部干预的自发性无限闪烁上转换纳米颗粒，并开创了U-STORM超分辨成像技术。
Fig. 1: U-STORM workflow and route to ångström-level precision.
主要实验及结论
如图1所示，U-STORM技术的基本原理依赖于小尺寸上转换纳米颗粒在单束近红外激光（976 nm）连续照射下的自发无限闪烁能力。传统荧光团由于光漂白限制了收集到的光子总数，使得紧密堆积的分子难以被准确定位。而新型U-STORM探针能够在无成像缓冲液、无光开关试剂的条件下自发切换于“开（ON）”与“关（OFF）”状态之间，并在多次成像帧中被反复高精度定位。通过将同一点阵的大量定位结果进行时间平均，定位中心聚类并收敛于颗粒的真实物理位置，从而成功将定位精度提升至亚埃（sub-ångström）级别。
为了获得具备低占空比（即发光“开”状态所占的时间比例）和高光子产率的理想探针，研究人员对纳米颗粒的元素组成进行了系统优化。如图2所示，研究团队合成了以β-NaYF4为基质、核壳结构设计的~10 nm纳米颗粒。在固定激活离子Tm3+浓度的前提下，逐步提高敏化剂Yb3+的掺杂比例。实验发现，当Yb3+浓度从20%提升至80%以上时，纳米颗粒自发展现出高度均匀且显著的闪烁行为，平均占空比骤降至1%以下，在99.5% Yb3+与0.5% Tm3+的组合下达到了约0.9%的最低占空比。连续10小时的长时间激光照射试验表明，该探针完全没有发生光漂白，且在长达3小时的统计老化测试中表现出极其稳定的亮灭循环次数与发光强度，证实其不存在类似量子点的统计老化现象。
Fig. 2: Characteristics of Tm-doped blue-emitting U-STORM probe.
基于该探针极佳的光稳定性与无限闪烁特性，研究团队对其定位精度进行了严格验证。如图3所示，对单个蓝色U-STORM探针收集到的88,000个定位点进行高斯拟合分析，传统单帧定位精度（σ_SMLM）约为18 nm，而通过时间平均得到的有效定位精度（σ_UCNP）达到了惊人的0.62 Å。借助该亚埃级定位精度，研究团队在单个衍射极限光斑内成功解析出了8个紧密相连的纳米颗粒，其中相距最小仅为14 nm的二聚体结构被清晰辨识，其定位质心与扫描电子显微镜（SEM）下的真实物理位置展现出了高度一致性。
Fig. 3: Super-resolution imaging with high precision and accuracy using blue-emitting U-STORM probe.
在探究自发闪烁的物理机制方面，如图4所示，研究人员通过对比无壳层核心颗粒与不同外壳厚度的核壳颗粒发现，无壳层颗粒并不表现出闪烁现象，只有在包覆超薄惰性壳层（~0.36 nm）后才开始出现闪烁。微观速率方程模拟与机理分析揭示，在极高Yb3+掺杂下，吸收的能量在Yb3+亚晶格网络中发生高效的能量迁移并高度富集到Tm3+离子上；高激发态的电子会被核壳界面处的缺陷陷阱状态随机捕获与释放，这种连续的电子捕获与热释放过程直接驱动了纳米颗粒自发且无规律的“亮-灭”开关切换。
Fig. 4: Proposed blinking mechanism.
为了将该技术拓展至多色成像，如图5所示，研究团队将激活剂离子替换为Er3+，成功开发出红光发光探针（β-NaYb0.9975Er0.0025F4 @ β-NaY0.8Gd0.2F4）。该红光探针同样展现出约0.9%的低占空比以及0.93 Å的亚埃级定位精度。在同一近红外激光照射下，蓝色与红色U-STORM探针能够同步进行独立闪烁。在混合双色成像实验中，研究团队不仅成功重建出衍射极限点内的10个纳米颗粒，还利用光谱差异无损识别出了透射电镜下形态无法区分的蓝/红异质二聚体，展示了单激发源下无光谱串扰的多色超分辨成像能力。
Fig. 5: Engineering red-emitting U-STORM probe for multicolour super-resolution imaging.
最后，研究团队将U-STORM探针应用于复杂的生物活体成像场景。如图6所示，研究人员将表面修饰有HaloTag配体的蓝光与红光U-STORM探针应用于表达HaloTag-EGFR的U2OS细胞中。在没有添加任何化学还原缓冲液的生理条件下，仅使用单束近红外激光即完成了对细胞膜上EGFR受体的高特异性标记与双色超分辨成像。实验结果清晰地记录了表皮生长因子（EGF）刺激前后受体的空间分布变化，结合距离分布统计，证实刺激后EGFR受体形成了中心间距峰值为55 nm的经典二聚体结构及更高阶的多聚体簇，充分验证了该方法在单蛋白质水平探究细胞信号转导机制中的巨大实用价值。
Fig. 6: Multicolour super-resolution bioimaging with ångström precision.
总结及展望
本研究成功开发了一类具有自发且无限闪烁特性的~10 nm上转换纳米颗粒，突破了传统荧光超分辨成像对于光漂白、化学还原缓冲液以及复杂激光控制系统的依赖。通过将占空比降低至0.9% 并利用无限重复定位，实现了0.62 Å的亚埃级定位精度，并成功在单蛋白质分辨率下完成了细胞膜受体二聚化过程的双色成像。这一突破标志着超分辨显微探针从“仪器或试剂驱动开关”向“探针自身自发开关”的范式转变。
展望未来，进一步减小上转换纳米颗粒的物理尺寸将有助于降低空间位阻效应并提升标记密度，从而进一步拓展超分辨生物成像的极限。同时，优化发光量子产率以提高单帧光子计数，将大幅缩短数据采集时间，使该技术更完美地适用于活细胞动态过程的高时空分辨率追踪。此外，通过多元素共掺杂开发出更多光谱独立的闪烁探针，将构建起更丰富的多色U-STORM显微成像体系，为揭示复杂生物大分子复合体的微观结构与动态相互作用提供前所未有的强力工具。