Fluolab【JACS】近红外二区荧光探针的信噪比如何提升，激发态电荷转移动力学的变化率成为新的标准！
这项研究旨在解决开发具有高信号“开启”比率的可激活近红外二区（NIR-II）荧光探针（AFPs）所面临的挑战。尽管近红外二区荧光成像因其散射减少和自发荧光降低的优势，能实现更深的组织穿透和更高的时空分辨率，非常适合生物病理过程的研究，但开发响应生物标志物的可激活探针仍然具有挑战性。特别是基于共轭小分子（CSMs）的探针，其亮度与电荷转移能力之间的矛盾限制了它们的激活比率。高亮度的CSMs通常具有扭曲结构，激发态空穴-电子对重叠小，限制了电荷转移，从而削弱了预激活的荧光“笼罩”效果。而平面CSMs虽然有利于电荷转移，但易发生分子间紧密堆积，抑制了辐射跃迁并导致荧光猝灭。
研究人员提出一个假说：可激活近红外二区荧光探针（AFPs）及其去笼罩对应物（uAFPs）之间激发态电荷转移（ESCT）动力学的变化率（定义为 δ）是决定这些探针荧光“开启”比率的关键因素。δ 可以通过公式 (1) 定义，该公式表达了 AFP 和 uAFP 之间 ESCT 特性或动力学参数的变化率。
为了验证这一假说，研究人员设计并合成了一系列基于 CSM 的 AFP 和 uAFP 探针。他们选择了丹参酮缀合苯并噻唑衍生物作为 NIR-II 荧光骨架，因其窄带隙、卓越的光稳定性以及易于化学修饰的特点。响应 H2S 的苯磺酸基团被选作荧光猝灭（笼罩）部分。通过在丹参酮的 3'- 或 4'- 位置引入不同长度烷基链的取代基，他们获得了一系列具有不同构象的 AFPs（AFP1、AFP2 和 AFP3）及其对应的去笼罩产物 uAFPs（uAFP1、uAFP2 和 uAFP3）。
研究主要通过以下方法分析了这些探针的 ESCT 动力学和响应性：
计算分析：
在合成探针之前，研究人员利用密度泛函理论（DFT）和时域 DFT（TD-DFT）对 AFPs 和 uAFPs 的 ESCT 动力学进行了计算分析。他们计算了 AFP 和 uAFP 之间的 δ 值（记作 δC）。结果显示，在气相和水溶液中，AFP2/uAFP2 对的 δC 值最大（分别为 0.18 和 0.16），其次是 AFP1/uAFP1 对（分别为 0.15 和 0.13），而 AFP3/uAFP3 对的 δC 值最小（分别为 0.05 和 0.06）。这表明 AFP2 和 uAFP2 探针对应物表现出最显著的 ESCT 动力学变化。
飞秒瞬态吸收（fs-TA）光谱测量
研究人员合成了 AFPs 和 uAFPs，并使用 fs-TA 光谱测量了它们激发态动力学的实验 δ 值（记作 δτ2 和 δτ3）。fs-TA 分析提取了三个时间常数：τ1（本地激发态特征）、τ2（从本地激发态向最低发射 CT 态转换的时间，反映 CT 态形成速率）和 τ3（发射 CT 态向基态衰减的时间，反映 CT 态寿命）。他们发现，AFP2/uAFP2 对的实验 δτ2（0.30）和 δτ3（0.78）值均大于 AFP1/uAFP1 对的 δτ2（0.13）和 δτ3（0.75）值。这与计算分析的结果一致，表明 AFP2/uAFP2 表现出最显著的 ESCT 动力学变化。AFP3 和 uAFP3 表现出快速非辐射复合，基本不发荧光。计算和实验结果的良好相关性验证了理论方法预测 ESCT 动力学变化的可靠性和准确性。δ 值作为激发态电荷转移重组的定性描述符，其变化与电子耦合和重组能的调节直接相关，与实验观察到的瞬态寿命（τ2 和 τ3）之间存在明确的机制联系。
稳态荧光光谱和滴定实验
通过稳态荧光光谱测量 AFP 和 uAFP 对的荧光强度变化。uAFP1、uAFP2 和 uAFP3 的荧光量子产率（QYs）分别为 4.39%、4.11% 和 3.37%。AFP1 到 uAFP1 的荧光强度增加了 7.68 倍，而 AFP2 到 uAFP2 的荧光强度增加了 17.54 倍。AFP3 和 uAFP3 则没有检测到荧光变化。虽然 uAFP1 亮度最高，但 AFP1 较高的初始背景荧光导致其荧光强度变化比率低于 AFP2/uAFP2 对。因此，AFP2/uAFP2 对表现出最显著的荧光强度变化比率。通过 AFP 对 H2S 的荧光滴定实验，AFP1 的 NIR-II 荧光信号增加了 4.91 倍，而 AFP2 增加了 11.87 倍。AFP3 对 H2S 响应后荧光反而降低。这些结果表明，探针的响应能力与 ESCT 动力学变化率的计算和 fs-TA 分析结果吻合。
研究发现，理论和实验 δ 值与激活探针的荧光“开启”比率之间存在密切关联。δ 值较高的 AFP2 表现出最优的 H2S 响应性。为了进一步验证 δ 参数作为响应性能预测指标的普适性，研究人员还设计了两个超氧阴离子激活的 NIR-II 荧光探针 AFPS1 和 AFPS2。计算和实验结果同样显示 δ 值较高的 AFPS2 表现出更好的超氧阴离子响应能力。对于 D-A 型可激活 NIR-II 荧光探针，其荧光开启机制受 ICT 效应控制，引入吸电子可裂解部分会扰乱轨道能级，抑制电子从施主转移，从而抑制荧光发射。激活后，施主电子特性的恢复重新激活 ICT 过程。ESCT 动力学变化率（δ）有效地量化了这种变化，捕捉了探针激活时电荷再分布的程度。因此，δ 参数作为荧光响应效率的预测指标表现出通用性。
基于其卓越的响应能力，AFP2 被选作概念验证的体内 NIR-II 生物成像应用。
药物性肝损伤（DILI）的早期诊断
研究人员将 AFP2 与肝细胞靶向配体 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联的聚合物共沉淀，制备了靶向纳米探针 AFP2G。GalNAc 是一种高效的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）配体，该受体特异性表达在肝细胞中。体外实验证实 AFP2G 具有出色的肝细胞靶向能力。体内研究显示，静脉注射 AFP2G 后，在健康小鼠肝脏中积累更高，肝脏/脾脏比率也显著高于非靶向探针 uAFP2。在二甲双胍诱导的 DILI 小鼠模型中，AFP2G 在用药仅 3 天后就能检测到肝脏 H2S 水平的升高引起的荧光信号增加。这比传统的血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）检测（需要 7 天才显示显著升高）和组织学分析（需要 7 天才显示明显变化）早得多。这证明了 AFP2G 诊断 DILI 的高敏感性和早期诊断能力。
图像引导癌症手术
研究人员在腹膜癌病 CT26 荷瘤小鼠模型中评估了 AFP2 用于实时图像引导癌症手术的可行性。H2S 在 CT26 结肠肿瘤中选择性上调。静脉注射 AFP2 后，探针有效勾勒出肿瘤边界，肿瘤/正常组织（T/N）比率在 8-48 小时内保持稳定，约为 6.51。这使得 AFP2 能够进行准确的 NIR-II 荧光成像引导手术。AFP2 实现了超灵敏检测微小残留肿瘤灶（直径小于 2 mm），这些肿瘤灶肉眼不可见，但 T/N 比率均高于 6.74。在 AFP2 引导下进行的第二次手术成功切除了这些微小病灶，直到检测不到荧光信号。组织学分析也证实，荧光成像精确识别了肿瘤和正常组织边界。这表明 AFP2 是一种高响应性可激活 NIR-II 荧光探针，为癌症检测提供了出色的敏感性，并帮助外科医生在癌症手术中进行更精确的肿瘤切除。
此外，AFP2 具有良好的 H2S 浓度线性相关性（0-240 μM），检测限（LOD）低至 0.075 μM（75 nM）。它能快速（15 分钟内达到饱和）且稳定地响应 H2S。在存在其他潜在干扰物质（如 RSS、ROS、RNS 和金属离子）时，AFP2 的荧光强度几乎没有变化，显示出优异的化学稳定性和高特异性。与其他报道的 NIR-II 可激活荧光探针相比，AFP2 在 LOD 和稳定性方面表现优异。
结论
这项研究首次报道了 δ 作为可激活 NIR-II 探针荧光“开启”比率的预测因子。通过计算和实验分析 δ 值，可以有效预测和调控探针的响应性能。这种策略简化了 NIR-II 荧光探针的优化过程，避免了耗时费力的合成工作。这种精简的设计流程有望加速 NIR-II 探针的开发，扩大探针库，同时提高探针的敏感性和成像性能。这些改进将为 NIR-II 可激活探针在基础研究和临床转化中开辟新途径，并有可能与人工智能结合，激发更多创新分子设计。AFP2 作为经 δ 值预测的最优探针，成功应用于早期诊断 DILI 和超灵敏检测微小肿瘤转移灶，进一步证实了 δ 作为探针响应性能可靠指标的有效性。