Fluolab化学从业者生存指南——快速柱层析色谱
可以肯定地说，大多数合成有机化学家都会花费大量时间，同时使用薄层色谱法和快速柱色谱法来分析反应并纯化化合物。同样可以肯定的是，当这些技术失效时，人们也会经历数小时的挫败。本文收集了相关信息与建议，旨在帮助新手和资深合成有机化学家应对色谱分析中的各类挑战。
固定相
- 二氧化硅： 微酸性介质。最适合普通化合物，实现良好分离。
- Florisil： 温和、中性的培养基。200目可以有效地轻松分离。小于200目最适合通过过滤提纯。一些化合物粘在florisil上，首先测试。
- 氧化铝： 碱性或中性介质。可以有效地分离和纯化胺。
- Triethylamine-Deactivated二氧化硅：一种减弱硅胶酸度的方法，可用于对酸敏感的化合物的纯化。
- 反相二氧化硅： 大极性的化合物洗脱最快，小极性的最慢。
- 硝酸银浸渍硅胶： 用于分离E/Z几何异构体：参见J. Med. Chem. 2009，52,117。
快速柱色谱的溶剂体系
最常见的双组分溶剂体系（按极性从低到高排列）：
- 乙醚/石油醚、乙醚/己烷、乙醚/戊烷： 烃类组分的选择取决于其可得性和对沸程的要求。戊烷价格昂贵且沸点低，石油醚可实现低沸点，己烷则易于获取。
- 乙酸乙酯/正己烷： 这是标准溶剂，适用于普通化合物，对难分离物质效果最佳。
- 甲醇/二氯甲烷： 适用于极性化合物。
- 甲醇溶液/二氯甲烷中的10%氨溶液： 有时能将顽固的胺类物质从基线处洗脱下来。
良好的起始配比
- 极性化合物：100% 乙酸乙酯或 5% 甲醇/二氯甲烷
- 普通化合物：10-50% 乙酸乙酯/己烷
- 非极性化合物：5% 乙酸乙酯/正己烷、5% 乙醚/正己烷、100% 正己烷
经验法则
- 在10%乙酸乙酯/正己烷体系中Rf为0.5的化合物，在20%乙醚/正己烷体系中Rf也为0.5。该换算因子具有普适性。
- 甲醇可用作极性溶剂，但在混合物中的占比不得超过10%。甲醇占比超过10%时会溶解硅胶。
提示
- 二氯甲烷能更好地溶解化合物，但通过硅胶的过程会更慢。
- 苯有时可用作非极性组分，但由于其毒性，通常会避免使用。
- 如果你的化合物对酸敏感，在溶剂体系中加入1-3% 三乙胺以中和硅胶中的酸。你的化合物的Rf值可能会略微升高，建议先进行尝试。
快速柱层析的操作
所有快速色谱法均应使用60型硅胶进行
1. 选择洗脱剂体系
为待测化合物或反应混合液筛选适配的展开溶剂体系。常规实验中，目标物质在薄层色谱上的Rf 值建议控制在 0.3 左右；若两组分斑点集中在 Rf 0.7~1.0 或 0~0.2 区间内，即便位置相近、共点重叠，实际层析分离难度通常较低，较易实现有效分离。
多数薄层色谱分离场景中，正己烷 - 乙酸乙酯混合体系适配性最优，二者配比可在 100:0 至 0:100 范围内灵活调整。常用备选溶剂体系还包括：二氯甲烷 - 甲醇（配比 100:1~100:10）、乙酸乙酯 - 丙酮（配比 100:0~50:50），以及甲苯分别搭配丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷组成的混合溶剂。
分离含氮碱性化合物时，可向展开剂中加入体积分数约 0.1% 的三乙胺或吡啶，该操作往往能显著改善分离效果，部分体系中为必备优化手段。
分离酸性化合物时，可在溶剂体系中加入少量乙酸调节分离效果。需重点注意浓缩操作安全：微量乙酸随产物一同浓缩留存存在安全隐患。可采用甲苯共沸除酸法安全脱除乙酸：分次加入甲苯，减压旋蒸浓缩至数毫升，重复数次即可完成除酸。因乙酸沸点低于甲苯，该方法可高效去除残留乙酸，避免纯品化合物长期接触酸性物质。
2. 装填色谱柱
- 取少量脱脂棉塞入色谱柱下端旋塞孔，填充量以恰好封堵孔径为宜；色谱柱自带砂芯可直接省略此操作。
- 向柱内平铺厚度约 2 cm 的石英砂，砂层直径与柱体内径保持一致；自带砂芯的色谱柱无需铺设底砂。
- 采用干装法填入层析硅胶，柱内硅胶填充高度不宜过高，常规实验最优填充高度为 6~10 英寸。
- 将真空泵对接色谱柱下端旋塞接口，开启真空泵对柱内硅胶进行负压压实，使硅胶层紧实均匀，完成柱体固定。
- 在硅胶层上方铺设 1~2 cm 厚上层石英砂（也可替换为无水硫酸钠），随后倒入提前配制好的体积比 4:1 正己烷 - 乙酸乙酯混合展开剂，使溶剂自然流经层析柱，待溶剂基本流尽后关闭旋塞。
- 保证柱内溶剂充足，充分浸润压实硅胶完成完整装填，再借助气压洗脱柱内多余溶剂，全程严禁柱体干涸，待溶剂液面降至上层砂层表面时停止洗脱。合格装填的色谱柱内部硅胶无裂隙、无疏密不均现象，下端流出的溶剂无明显升温发烫现象。
3. 上样操作
以最少体积的二氯甲烷溶解样品或反应混合物料，用移液管缓慢将样品溶液加注至硅胶柱顶层，再取用二氯甲烷或洗脱剂分次洗涤容器 3 至 4 次，洗涤液一并上柱。每次加液后，待液面缓慢降至上层砂层下方、硅胶表层位置，再进行下一步操作。
逐次滴加 2~3 滴洗脱剂缓慢冲送样品渗入柱层，重复此操作 3~4 次，确保样品充分沉降吸附。
随后向柱内缓慢补加洗脱剂至填满柱体空余部分，接入压缩空气开展洗脱作业。洗脱流速控制为每分钟约 2 英寸为宜，可通过观察柱管内溶剂液面下降速度直观判定。建议在上样前提前调试并确定合适流速，操作更为便捷。
若目标样品难以溶于常规上样溶剂，可采用硅胶拌样法处理。先将样品溶于丙酮溶液，加入适量层析硅胶混合均匀，再减压旋蒸除去溶剂直至完全干燥，操作过程需严控温度与负压，严防液体暴沸。将负载样品的干硅胶均匀铺填至已装好的色谱柱顶端，再铺设上层石英砂压实。该方法仅作为备选方案使用，其分离效果普遍弱于直接溶液上样法。
4. 操作层析柱
- 柱洗脱组分收集于试管中，试管尺寸需与色谱柱类型、样品规模及极性相适配：小型分离实验（样品量 5~50 毫克）选用 13 毫米规格试管，较大规模分离则需使用更大尺寸的试管，确保馏分无遗漏。
- 样品上柱后需立即开始收集馏分，因为非极性极强的化合物在色谱柱中迁移速度较快，洗脱所需时间较短，延迟收集易造成组分流失。
- 色谱柱装填完成并启动洗脱后，应尽量保持连续运行，避免长时间中断。若中途停止，柱内化合物会在硅胶表面缓慢扩散，进而导致组分分离效果变差、目标产物产率降低。
- 为筛选出目标产物，需取每个馏分在薄层色谱板上点样，通过薄层色谱检测确定含有目标化合物的馏分。将含相同化合物的馏分合并，用二氯甲烷，或更环保的蒸馏乙酸乙酯洗涤试管（确保残留组分完全转移），随后在减压条件下浓缩溶剂，得到浓缩产物。
- 严禁让色谱柱干涸，且在未确认所有化合物完全洗脱之前，不得停止洗脱操作！这是柱色谱分离实验中极易出现的失误，需重点规避。
5. 柱子处理完毕后
- 实验结束后，通入压缩空气彻底吹除柱内残留溶剂，持续通气约 2 小时，即可得到干燥松散、流动性良好的硅胶填料。
- 将层析柱内剩余废液统一倒入专用硅胶类废液收集容器中妥善处理。
- 常规清洗可直接使用清水搭配丙酮冲洗色谱柱即可；顽固污渍可适量添加中性洗涤剂辅助清洁，严禁使用硬质毛刷大力刷洗，避免划伤柱体内壁。