Fluolab【疾病诊断荧光探针】器官损伤荧光探针
Fluorescent Probes for Disease Diagnosis
疾病诊断荧光探针
人体结构错综复杂，内含众多器官，每个器官均为维持整体健康功能不可或缺的部分。因此，确保每个器官的完好与功能正常至关重要，任何内脏损伤都可能引发严重的健康问题。在众多器官中，大脑、肾脏和肝脏因其复杂的生理功能和易受损伤的特性而备受关注。
遗憾的是，这些器官损伤的早期症状往往不易被察觉，容易导致损伤的持续恶化和疾病的进一步加重。因此，及时发现并深入了解这些损伤情况显得尤为重要。
在检测器官损伤发生和发展的众多方法中，荧光成像技术（如表3所示）日益凸显其重要性。该技术凭借其独特的优势，如高灵敏度、高分辨率和非侵入性等，在医学诊断领域发挥着越来越重要的作用。正如本系列前面章节所强调的，荧光成像技术不仅能为医生提供准确的诊断信息，还有助于更深入地了解器官损伤的机制，为临床治疗提供有力支持。
| probe | λex/λem （nm） | LOD | bioactive molecule | biological model |
|---|---|---|---|---|
| Liver Injury | ||||
| 95 | 450/555 | 0.13 μM | ONOO– | ALI mice |
| 96 | 450/562， 450/568， 520/587 | ATP， ONOO– | HL-7702 cells | |
| 97 | 540/705 | 33 nM， 100 nM， 40 nM | Cys， Hcy， GSH | DILI mice |
| 98 | 820/864 | lysosomal viscosity in hepatocytes and mice during HIRI | HIRI mice | |
| 99 | 530/560 | 25.9 μM， 0.628 μM | ATP， H2S | HepG2 cells |
| 100 | 988/1058 | HClO | ALI mice | |
| 101 | 380/470， 640/660 | 6.38 nM， 6.09 nM | O2•–， ONOO– | HIRI mice |
| 102 | 808/1053， 980/1525 | 0.7 nM | H2S | metformin-induced liver injury mice |
| 103 | 808/980 | 0.46 μM | ROS | HIRI mice |
| 104 | 675/720 | 10 × 10–9 M | O2•– | HIRI mice |
| 105 | 540/660， | 154 × 10–9 M. | ONOO– | CCl4-dependent acute hepatitis |
| 106 | 660/810 | 241 × 10–9 M | Balb/c mice | |
| Kidney Injury | ||||
| 107 | 490/635 | 0.057 U/L | GGT | zebrafish |
| 108 | 420/515 | 0.16 μM | O2•– | AKI mice |
| 109 | 808/- | 16.2 μM | H2O2 | unilateral ureteral obstruction mouse model |
| 110 | -/700 | 13 × 10–9 M， | O2•–， | cisplatin-induced |
| 111 | 17 × 10–9 M | ONOO– | AKI mice | |
| 112 | 675/720 | 12 nM | O2•–， NAG | contrast-induced AKI mice |
| 113 | -/800 | pH | acidosis-induced kidney injury mouse model | |
| 114 | 790/808 | 0.079 nM | caspase-3 | cisplatin-induced AKI mice |
| 115 | 675/720 | γ-glutamyl transferase | cisplatin-induced AKI mice | |
| 116 | Kim-1 | rhabdomyolysis-induced AKI mice | ||
| 117 | 808/1000–1100 | N/A | kidney dysfunction in murine model | |
| 118 | 660/910 | N/A | renal fibrosis mice | |
| 119 | 698/725 | N/A | renal ischemia-reperfusion mice | |
| 730/790 | ||||
| 825/912 | ||||
| 890/1025 | ||||
| Traumatic Brain Injury | ||||
| 120 | 800/I595/I453 | 55.4 nM | HOCl | BV-2 cells |
| 121 | 1050/1094 | ONOO– | brain vascular injury mice | |
| 122 | 808/1071 | ROS | TBI mice | |
| 123 | 480/530 | ROS | TBI mice | |
| 124 | 480/645 | blood | SAH mice | |
| 125 | 745/800 | N/A | TBI mice |
【器官损伤荧光探针】肝损伤荧光探针
Fluorescent Probes for Disease Diagnosis
疾病诊断荧光探针
肝损伤，这一复杂且多发的疾病，主要由药物性肝炎、慢性病毒性肝炎或外伤等因素引发。然而，由于公众对于肝损伤早期症状的忽视和缺乏足够认识，许多病例在初期并未得到应有的关注。肝损伤的类型繁多，包括但不限于急性肝损伤、药物性肝损伤、肝缺血再灌注损伤等，每一种类型都需要我们进行详尽的研究和精准的诊断。
在这一背景下，关键生物标志物的研究显得尤为重要。这些生物标志物，如活性氧、金属离子、肝酶和ATP等（如图34所示），在肝损伤的诊断和监测中发挥着至关重要的作用。它们不仅能帮助我们更好地理解肝损伤的发生机制，还能为疾病的预防、治疗和康复提供科学依据。因此，对这些生物标志物的深入研究，将有助于我们更好地应对肝损伤这一全球性的健康问题。
图 34.部分肝损伤荧光探针。
作为氧化应激的显著标记物，ONOO-（过氧亚硝酸盐）在成像和研究肝损伤中备受关注，文献已报道了多种针对ONOO-的荧光探针。其中，Wang及其团队在2023年设计的探针95，基于萘胺结构，旨在精确测量急性肝损伤模型小鼠溶酶体中ONOO-的水平。在无ONOO-的环境中，探针95在450纳米波长处呈现微弱吸收；然而，一旦ONOO-氧化裂解硼酸酯，其吸收显著增强，同时555纳米波长处的荧光响应也相应增加。该探针不仅对ONOO-具有高选择性，还拥有快速响应时间（约70秒）、优异的LOD（0.13 μM）和极低的细胞毒性。在光甘油-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）或脂多糖（LPS）诱导的LX-2细胞中共聚焦荧光成像实验中，探针95成功捕捉到了内源性ONOO-水平的上升，并在检测急性肝损伤小鼠体内ONOO-浓度升高方面展现了出色的性能。
ONOO-对ATP合成的有害影响，特别是通过ATP合成酶的失活，已引起广泛关注。鉴于ATP在细胞过程中的核心地位，ONOO-（及更广泛的氧化应激）可能导致严重的系统性问题。为了深入探究ONOO-与ATP之间的关系，2022年开发的探针96能够同时监测对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性中ATP和ONOO-的浓度变化。这种基于双罗丹明-萘二甲酰亚胺的探针在初始状态下荧光微弱，但遇到ONOO-时，其4-BPin功能团被氧化为苯酚，从而触发ICT过程，导致荧光开启（λex = 450/488 nm，λem = 562/568 nm）。在ATP存在下，罗丹明荧光团通过可逆的非共价键合（π-堆叠和H键合）发生环形打开，形成荧光形式，进而增强587纳米波长处的荧光强度。这种双模式荧光策略允许同时监测ONOO-的增加和ATP的耗竭。探针96以其高选择性、pH稳定性和低生物毒性，在APAP诱导的HL-7702细胞损伤成像中表现优异。这种市售探针为监测药物诱导肝损伤（DILI）系统以及其他疾病/器官中的ATP和ONOO-浓度提供了强有力的工具。
2023年，Zhang等人针对氧化应激，设计了一种基于硫醇-色素“点击”反应的新型近红外荧光探针97，用于观察DILI中的硫醇通量（涉及ROS/硫醇平衡，详见第2.2节）。 探针97由色烯-硫醇识别基团和二氰异佛尔酮荧光团构成，荧光团上连有α、β-不饱和酯。硫醇与探针97反应后，经历一系列转化，首先丢失色烯分子，生成中间酚类，随后与不饱和酯进行环状连接，生成香豆素单车。这一过程不仅产生以540纳米为中心的新吸收，还降低了原有二氰异佛尔酮部分的400纳米吸收，并激发以705纳米为中心的新发射。探针97的荧光强度与Cys浓度线性相关，检测限低至33 nM，对Hcy和GSH的检测限分别为100 nM和40 nM。在生理条件下，探针97表现出卓越的选择性和对硫醇的快速响应能力，可用于细胞和斑马鱼体内硫醇波动的观察，以及DILI小鼠体内硫醇水平变化的监测。
同年，Tang等人开发了一种粘度激活的近红外-II荧光探针98，用于检测肝细胞和小鼠在肝缺血再灌注损伤（HIRI）过程中溶酶体的粘度变化。探针98融合了吲哚青绿（ICG）和IR-783的结构特点，产生红移近红外-II荧光发射。在低粘度水中，其仅在694纳米处显示微弱吸收；然而，随着介质粘度的增加，该吸收带几乎消失，同时820纳米为中心的吸收显著增强。当粘度从3.0 cP增加至46.00 cP时，864 nm处的荧光发射强度增加了13倍。荧光强度（log F864）与介质粘度呈现良好的线性关系（线性系数0.997），在甘油中的量子产率为0.34，比ICG高出2.6倍。探针98对粘度具有高度特异性，不同溶剂的极性变化对其荧光强度无显著影响。Tang等人利用探针98在HIRI中成功揭示了ROS-丙二醛-护肝素B信号通路。
2022年，Ye等人成功设计了一种名为探针99的多功能荧光探针，该探针能够同时检测APAP DILI（对乙酰氨基酚药物性肝损伤）和HIRI（肝缺血再灌注损伤）过程中溶酶体内的ATP（腺苷三磷酸）和H2S（硫化氢）。该探针的构建基于罗丹明6G与1，8-萘二甲酰亚胺的混合物，并结合二乙烯三胺和叠氮基团，分别作为ATP和H2S的活性识别位点。在ATP存在时，探针99在560纳米波长处的荧光发射显著增强，这是由于结合和开环反应导致的，如之前所述。而当存在H2S时，探针99在530纳米波长处的荧光发射迅速上升，这是由于叠氮功能的降低所引发的。探针99在酸性pH值范围（4.0-5.5）内对ATP表现出良好的响应，而对H2S的检测则具有更宽的pH工作范围（4.0-8.0），对这两种分析物均显示出极高的选择性（ATP的LOD为25.9 μM，H2S的LOD为0.628 μM）。借助探针99，可以精确地监测DILI和HIRI期间溶酶体中ATP和H2S浓度的动态变化。
同年，Yuan及其团队开发了一种新型NIR-II（近红外二区）荧光支架，即探针100，通过在氰型三甲基框架的两端引入富电子端基（如呫吨和苯并吡喃）来实现。 探针100的吸收和荧光发射均位于NIR-II区域（938/1001 nm、956/1005 nm、962/1015 nm 和 988/1058 nm）。该探针能与ROS（活性氧物种）和二硫化物产生可逆反应。在HClO（次氯酸）的氧化作用下，探针在三级氨基位点生成N-氧化物，而不经历进一步的重排或降解，导致980纳米波长处吸收和1040纳米波长处发射的减少，并在824纳米波长附近出现新的蓝移吸收带。当加入还原性活性硫后，氧化的探针恢复到原始状态，980纳米波长处的吸收和1040纳米波长处的发射重新增强，探针回到“NIR-II导通”状态。研究表明，探针100具有出色的光稳定性，能够在急性炎症和肝损伤/修复模型的氧化微环境中可逆地检测HClO。
Tang小组于2019年报道了探针101，该探针能够协同双选择性识别O2-（超氧阴离子）和ONOO-（过氧亚硝酸盐）。探针的设计基于咖啡酸，这是一种超氧化物的有效识别位点。在与O2-反应时，咖啡酸中的儿茶酚基团被氧化成邻苯醌，从而发出蓝色荧光。同时，探针另一侧的近红外荧光团Cy5与ONOO-反应，导致多甲基链的裂解和Cy5荧光的淬灭。通过这些反应，ONOO-关闭了近红外荧光，而超氧化物则开启了蓝色荧光信号。因此，该探针允许对两种ROS进行独立的多通道测量。该探针对O2-和ONOO-均表现出极高的灵敏度、选择性和特异性，O2-的检测限为6.38 nM，ONOO-的检测限为6.09 nM，且分析物之间无相互干扰。有趣的是，该探针还能对O2-进行可逆荧光成像，因为与内源或添加的还原剂反应后，非荧光的儿茶酚基团得以再生。利用探针101，研究人员成功监测了HIRI模型中线粒体的O2-和ONOO-水平，揭示了O2--ONOO--精氨酸酶1介导的红外损伤信号通路，以及精氨酸酶1硝化对红外损伤的不利影响，为治疗HIRI提供了潜在的新策略。
2021年，Zeng等人开发了一种基于H2S激活的比率纳米探针NaYF4:Gd/Yb/Er@NaYF4:Yb@SiO2（探针102），该探针具有高效的正交NIR-II发射，可用于二甲双胍诱导的肝毒性的原位高度特异性可视化。探针102以NaYF4:Gd/Yb/Er@NaYF4:Yb@SiO2为核心，表面覆盖有Ag纳米点，形成类似红花酢浆草的结构，尺寸为75纳米。探针102主要被肝脏吸收，随后在损伤肝脏组织中过量表达的内源性H2S的触发下，通过原位硫化转化为NaYF4:Gd/Yb/Er@NaYF4:Yb@SiO2@Ag2S，从而产生以1053 nm（808 nm激光照射）和1525 nm（980 nm照射）为中心的正交发射。探针102对H2S展现出卓越的选择性和特异性，其LOD值低至0.7 nM。
利用探针102的活化正交特性，研究人员成功实现了对二甲双胍肝毒性的原位高特异性比率测定近红外成像。这一创新技术为监测药物性肝损伤及其机制提供了新的视角，并有可能促进肝脏疾病诊断和治疗策略的发展。通过精确地测量和分析在特定生物过程中H2S的波动，我们能够更深入地理解其在生理和病理过程中的作用，为药物研发和疾病治疗提供重要的科学依据。
图 35.使用探针 102 观察 H2S 二甲双胍诱导的肝毒性示意图。
2022年，Liu等研究者成功开发了一种可逆氧化还原探针103，该探针由稀土离子掺杂的纳米颗粒（RENPs）和基于钼的聚氧化金属盐纳米团簇（Mo-POMs）共同构建，旨在实时成像肝缺血再灌注损伤（HIRI）过程中的活性氧物种（ROS）波动（如图36所示）。通过吸收竞争诱导发射（ACIE）效应，RENPs作为发光分子发挥作用，而Mo-POMs则扮演了竞争者和ROS识别单元的角色。RENPs中掺杂的钕和镱元素使得探针在808纳米（钕激发）和980纳米（镱激发）的激光照射下产生比率发光信号，这一特性显著减少了生物组织的自发荧光干扰。当Mo-POM层经历氧化过程（MoV转变为MoVI）时，Mo-POMs的吸光能力增强，导致与RENPs之间的发光竞争减弱，进而以RENPs为中心的发射增强。这种氧化状态可以通过接触如谷胱甘肽（GSH）等还原剂来实现可逆还原。基于这一创新平台，探针103展现出了对-OH和GSH的可逆检测能力，其荧光强度比F808/F980与-OH浓度在1.0至9.0 μM范围内呈线性关系，检测限低至0.46 μM，从而有效实现了对HIRI期间ROS波动的实时监测。
图 36.探针 103 对 HIRI 中 ROS 的近红外-II 成像。
2022年，Wang和Pu等人成功研发了一种名为探针104的聚合物基纳米探针（APNSO），该探针具备O2激活的近红外荧光响应特性和肾脏清除开关机制，旨在应用于HIRI（缺氧缺血再灌注损伤）的无创活体成像以及肾脏代谢的深入分析（如图37所示）。
探针104由四大核心单元构成：氧气敏感反应单元、自裂解单元、笼式荧光团单元以及肾脏清除单元。荧光团单元与自裂解单元紧密相连，共同构筑了探针的聚合主体结构。随后，通过引入O2敏感的三酸酯基团和肾清除型羟丙基β-环糊精单元，对探针进行功能化修饰。所得聚合物因其两亲性特性，能够在水介质中自主自组装成纳米颗粒。
在无氧环境下，探针104保持非荧光状态。然而，一旦环境中存在氧气，ROS（活性氧物种）将触发三酸酯的裂解反应，导致探针104的主体结构自我解聚，并释放出肾脏可清除的近红外荧光片段，即荧光人工尿液生物标记物（FAUBs）。因此，在全身给药后，探针104在肝脏中累积，随后通过超氧化物诱导的裂解过程释放FAUBs，为实时近红外荧光成像及肾脏代谢分析提供了有效手段。
图 37.用于近红外荧光成像和 HIRI 尿液分析的探针 104 的设计、合成和机制。
2019年，Yuan和Peng等人精心设计了两种高选择性比率荧光探针——UCNPs@PEI@E-CC（探针105）和UCNPs@PEI@H-CC（探针106），旨在追踪肝炎关键指标ONOO-（图38）。这两种探针的构建基于上转换纳米粒子（UCNPs）和两种创新的吡啶基发色团E-CC或H-CC。最初，UCNPs在540纳米和660纳米处的上转换发光（保持810纳米发射不变）被发色团有效淬灭。随后，当发色团暴露于ONOO-时，它们经历氧化并“解体”，从而释放出发光信号。这一机制使得探针能够精准实现ONOO-的比率检测（通过I540/I660或I660/I810的比值）。
尤为令人振奋的是，探针105和106展现出对ONOO-的高度选择性，有效排除了如HOCl和SO32-等其他漂白活性分子的干扰，显著降低了潜在竞争者带来的风险。此外，探针105和106的检测限分别达到了154 nM和241 nM，呈现出令人瞩目的纳摩尔级检测灵敏度。这些具备高选择性和高灵敏度的探针已成功应用于新型CCl4诱导的肝损伤小鼠模型的成像研究。
图 38.基于探针 105 和 106 的 ONOO- 比率检测。（a）作用机制。（b，c） 含发色团 E-CC （105） （b） 和 H-CC （106） （c） 的探针的紫外/可见光谱，以及在 980 纳米激发下，UCNPs 在修饰前后的上转换发射光谱。
在医学和临床领域，与癌症一样，GGT（γ-谷氨酰转肽酶）被视为药物性肝损伤（DILI）的关键生物标志物，对于严重DILI病例的诊断具有不可或缺的价值。在2016年，Wu和Zeng等人取得了一项突破性的成果，他们成功开发了首个用于可视化GGT的TP（双光子）荧光探针——探针107。
该探针巧妙地运用了一种源自DCM（二氰基甲烯基）的荧光团作为TP荧光报告物，同时以谷氨酸作为ICT（分子内电荷转移）荧光淬灭剂和识别单元。当探针暴露于GGT时，谷氨酸单元经历裂解过程，释放出具有高电子负载的苯胺，这一变化在635纳米波长处引发以ICT为中心的强烈荧光发射带。
值得一提的是，探针107在GGT检测中展现出优异的性能。在暴露于GGT后30分钟，其荧光强度达到最大值，且在0-35 U/L的GGT浓度范围内呈现出良好的线性响应，检测限低至0.057 U/L。此外，探针107还具备出色的光稳定性和选择性，使其在实际应用中具有广泛的潜力。
作为验证其实际应用价值的实例，探针107已成功应用于药物诱导斑马鱼肝损伤的成像研究，为药物性肝损伤的诊断和监测提供了有力的工具。
【器官损伤荧光探针】肾损伤荧光探针
Fluorescent Probes for Disease Diagnosis
疾病诊断荧光探针
急性肾损伤（AKI），作为一种肾功能急剧丧失或严重下降的病症，因其高发病率和死亡率，已成为全球范围内亟待解决的健康问题。AKI的诱因多样，包括但不限于败血症、低血压、器官衰竭、肾结石、身体创伤以及药物过量。然而，在预防可能导致生命威胁或致命的AKI方面，一个关键挑战在于实现准确的早期诊断。遗憾的是，当前临床诊断主要依赖于血清肌酐和血尿素氮的检测，这些方法在AKI早期诊断中的灵敏度尚显不足。
为了弥补这一不足，高灵敏度、低成本的分子光学成像技术为AKI早期诊断带来了新的希望。该技术能够检测O2-、ONOO-、HClO等生物标志物，以及与细胞凋亡密切相关的caspase-3等关键分子。
在2022年，Kim及其合作者开发了一种名为融入式余辉纳米传感器（MANS）的多功能元件，即探针108，旨在实现顺铂诱导的肾损伤的超氧化物反应性可激活余辉成像（图39）。这一创新性的设计将荧光探针Ir-OTf与具备余辉底物和发光体双重功能的rubrene相结合，并巧妙地嵌入到聚合物胶束纳米粒子中。探针108的运作机制基于一个简单的“关-开”可激活系统，其中超氧化物能够长时间（超过11分钟）激活余辉发光。这一激活过程通过裂解Ir-OTf中的三酸酯实现，进而触发系统的发射。
在实际应用中，探针108成功应用于小鼠模型中顺铂诱导的肾损伤分子成像。其独特的余辉功能使得能够成像病理状态下过度产生的超氧化物，且不受自发荧光的干扰，为AKI的早期诊断和治疗提供了有力的工具。
图 39.IrOTf （探针 108）的分子结构和 O2 激活的磷光。
2021年，Zhang等人提出并验证了一种创新的策略，该策略基于肽介导的近红外-II荧光团递送，旨在实现肾脏中的长期累积（超过48小时）。他们观察到，通过在如吲哚菁绿等小型有机荧光分子上引入亲水性多肽，这些分子的生物代谢路径得到了显著改变，从而减少了它们在体内的捕获、清除和降解过程，最终实现了在肾脏中的长期靶向成像。
基于这一发现，Zhang及其研究团队精心设计了ROS激活的肾脏靶向纳米探针GNP-KTPs-ICG（探针109）。这一纳米探针由三个关键部分构成：吲哚菁绿（ICG）作为荧光标记物，金纳米粒子（GNPs）作为载体，以及肾脏靶向肽（KTP）作为导航分子（如图40所示）。探针109在注入体内后，能够高效地积聚在肾脏组织中，并在与活性氧物种（ROS）发生特异性反应后，促使荧光标记的ICG-KTP基团从金纳米粒子上释放，从而触发出强烈的近红外-II荧光信号。这一特性使得探针109能够实现对体外或体内肾脏损伤的高灵敏度成像。
图 40.（A） 不同染料-KTP 结合物在体内的代谢途径示意图，以及在近红外-II 窗口的无创肾脏监测。（B） 用于检测肾功能障碍的 ROS 响应探针 109 的设计。
在2020年，Pu团队成功合成了两种近红外化学发光报告物（NCRs）探针110和111，这些探针在肾脏清除率方面表现出色，适用于实时成像肾脏内的活性氧物种（ROS）和活性氮物种（RNS）（如图41所示）。这些NCRs的核心结构包括一个β-环糊精清除单元和一个包含Schaap's二氧杂环丁烷的化学发光修饰的DCM分子。特别地，探针110（NCR1）被设计为特异性响应超氧阴离子（O2-•），而探针111（NCR2）则针对过氧亚硝酸根（ONOO-）进行识别。这两种探针的发光体上分别连接了不同的生物标记特异性反应单元，即三氯酸盐（针对探针110）和醛（针对探针111）。
这些NCRs展现了纳摩尔级别的灵敏度，以及高效的肾脏清除能力，能够灵敏地检测细胞内ROS和RNS浓度的细微变化，进而监测肾病肾脏中生物标记物的水平。值得注意的是，研究结果显示探针110比探针111更早地被激活，这暗示了O2-•和ONOO-在病理过程中是依次增加的，其中O2-•在急性肾损伤（AKI）中首先增加。此外，通过检测尿液中分泌的荧光NCRs，可以实现AKI的尿液分析比传统组织学分析提前24小时，为早期诊断和干预提供了可能。
图 41.（a） 110 和 111 这两种探针的总体作用机制。（b） 110 和 111 的化学结构，用于检测 AKI 中的 O2- 和 ONOO-。R = H 或 CHO。
造影剂诱导的急性肾损伤（CIAKI）作为一种医学并发症，显著特点在于使用造影剂后肾功能的急剧下降。在2019年，Pu等人精心设计了双功能探针112，通过实时监测氧化应激（特别是超氧阴离子O2-•）和溶酶体损伤（由N-乙酰-β-d-葡萄糖苷酶，NAG作为指标），实现了对CIAKI的体内实时成像（如图42所示）。
该探针112融合了化学发光和近红外荧光两种信号通道，前者在O2-•的触发下发光，后者则在NAG的激活下显现荧光。尤为值得一提的是，探针112拥有极高的肾清除率（高达80%），这意味着它能够有效地检测活体小鼠肾脏中超氧阴离子和NAG的升高，从而在肾小球滤过率下降或组织损伤通过传统检测方法显现之前，就实现对CIAKI的诊断。
这一创新的设计使得探针112有望超越现有的临床检测方法，为急性临床环境下的肾功能实时无创监测提供一种全新的工具，从而为患者提供更及时、更有效的治疗策略。
图 42.具有开启化学发光和近红外荧光功能的光学探针 112，用于检测 O2 和 NAG。
纳米粒子因其尺寸特性，通常会被肾小球迅速滤过并清除，这限定了它们与肾脏的相互作用时间，但同时也为精确传感提供了便利。然而，这一特性与超声波信号通常较弱的问题相结合，使得基于纳米粒子的平台在直接成像和诊断肾脏疾病时面临重大挑战。
针对这一问题，Liu和Wu在2021年取得了显著的进展。他们开发出了一类新型的超小、肾脏清除型发光金纳米粒子（PMIZ-AuNPs，探针113）。这些纳米粒子表面涂覆有pH响应的齐聚酰亚胺唑基团，这些基团在特定pH值下能诱导电荷反转和聚集。具体而言，当pH值为7.4时，探针113的尺寸为3.5纳米，而在pH值降低至5.5的酸性环境中，其尺寸显著增大至1048纳米，这归因于氢键的强烈作用导致的显著聚集。
这种pH响应性聚集不仅显著增强了超声波信号，而且在探针113通过肾小球过滤被清除后，其会在肾小管的酸性环境中发生聚集，从而增加了重吸收、在肾脏内的停留时间以及荧光和超声信号的强度。这一特性使得探针113在成像肾脏损伤方面比之前的纳米探针更为有效。
此项研究揭示了通过调节发光探针113的体内清除途径，可以实现一种荧光-超声合作成像策略，这一策略在未来有望用于早期肾损伤的诊断，并提供更为精确的解剖信息。
图 43.具有 pH 值诱导电荷反转和聚集特性的探针 113，可通过受伤肾小管细胞的重吸收和原位聚集，进行早期肾损伤的协同荧光和超声诊断。
在2021年，Ye团队通过创新的“一锅顺序点击反应”策略，成功设计并合成了磷脂酰丝氨酸（PS）靶向且能被Caspase-3激活的近红外荧光探针1-DPA2（简称探针114）。该探针在药物诱导的急性肾损伤（AKI）早期阶段，展现出了对肾脏细胞进行无创实时成像的卓越能力（如图44所示）。
探针114的构造精妙，它结合了三唑取代的IR780荧光团、Caspase-3可识别的多肽（G-DEVD-G）、两个PS靶向配体（DPA-Zn）以及一个近红外荧光淬灭剂（QC-1）。在没有Caspase-3存在的环境下，QC-1与IR780的相互接近会导致近红外荧光的淬灭。然而，当引入Caspase-3后，DEVD链接器被特异性裂解，从而释放荧光团，导致在808 nm处的荧光发射显著增强。这种荧光增强与0.01-0.2 μg/mL范围内的Caspase-3浓度呈现出良好的线性关系。
通过应用探针114，研究人员实现了对小鼠肾脏中荧光信号的实时成像，观察到探针主要在小鼠肾脏中积累。这一发现使得在顺铂刺激诱导的小鼠AKI早期过程中，能够实时监测caspase-3的活性变化。此外，该探针还能够用于监测小鼠在接受N-乙酰-L-半胱氨酸治疗后AKI的恢复情况，为药物疗效评估和疾病治疗进展的监测提供了新的有力工具。
图 44.Caspase-3 介导的探针 114 水解为荧光产物 2-DPA2。
在2020年，Pu小组成功合成了一种新颖的荧光声学聚合物肾脏报告探针FPRR（探针115），旨在实现药物诱导性急性肾损伤（AKI）的实时成像（如图45所示）。 探针115的构造精妙，由三个关键分子组成：首先是聚合物葡聚糖，作为肾清除促进剂（已在先前研究中提及），其次是近红外荧光/光声（NIRF/PA）信号产生用的半氰基分子，最后是生物标志物响应分子γ-谷氨酰基。
类似上述提及的探针设计，半氰胺的羟基部分被γ-谷氨酰基分子所掩盖，这一设计巧妙地抑制了探针的荧光发射。然而，一旦探针暴露于γ-谷氨酰转肽酶（GGT）环境中，γ-谷氨酰基分子将被特异性裂解并消除，进而解除对荧光发射的抑制，导致近红外荧光和光声信号的显著增强。
这项创新研究不仅首次验证了活化型光声探针在分子水平上对肾功能进行实时、灵敏成像的可行性，而且进一步突出了高肾清除率聚合物探针在生物医学成像领域的广泛应用前景。
图 45.用于 AKI 实时近红外荧光和 PA 成像的 115 号探针的示意图和分子机制。
2022年，Xia及其研究团队报道了一种基于四面体DNA框架（TDF）的纳米装置Kim-TDF（探针116），该装置被设计用于早期急性肾损伤（AKI）的体内近红外成像（如图46所示）。探针116的构建融合了三个核心功能模块：首先，尺寸可调的TDF纳米结构作为肾脏靶向载体，确保探针能够精准定位；其次，引入了生物标志物肾损伤分子-1（Kim-1）的特异性结合模块，以实现对受损肾脏组织的精准识别；最后，搭载了商用近红外信号模块（IR CW800），以产生强烈的近红外荧光信号。
该探针能够选择性地聚集在Kim-1含量较高的受损肾脏组织中，从而释放出强烈的近红外荧光信号。由于探针的大小设计得当，它能在健康肾脏中迅速清除，从而显著降低了背景信号的干扰。在Kim-1尿液分析前6小时和血尿素氮检测前12小时，通过使用Kim-TDF探针（探针116），研究人员成功地实现了对AKI的早期诊断，这为临床上AKI的早期干预和治疗提供了有力的技术支持。
图 46.（A） 第 116 号探针的合成。（B） 通过原生 PAGE 凝胶电泳鉴定探针 116。（C） 利用探针 116 对 Kim-1 进行荧光成像的示意图。
2019年，Pu研究小组成功合成了一种近红外-II荧光分子半导体CDIR2（探针117），旨在实现对活体小鼠肾功能障碍的实时成像（如图47所示）。探针117的构造精妙，由两部分组成：一是独特的近红外-II荧光团，二是肾脏清除使能分子（（2-羟基丙基）-β-环糊精）。该NIR-II荧光团采用了典型的“屏蔽单元-供体-受体-供体-屏蔽单元”设计，其中苯并[1，2-c:4，5-c′]-双（[1，2，5]噻二唑）作为受体，3，4-乙氧基二氧噻吩作为供体，而二烷基芴则担任屏蔽单元的角色。
在活体小鼠全身给药后，探针117通过肾小球滤过作用迅速清除，且不被肾小管重吸收，最终分泌至尿液中。相较于其他同类探针，探针117展现出了显著的优势：其高信噪比确保了成像的清晰度，极高的肾脏清除率（24小时后约90%）保证了探针的快速代谢和排出，同时极低的体内代谢减少了潜在的生物毒性。这些特点使得探针117成为无创监测肾功能障碍和开发其他肾脏相关探针的理想选择。
图 47.用于肾功能障碍实时近红外-II 荧光成像的探头 117。
2022年，Tang及其研究团队成功开发了近红外AIE探针AIE-4PEG550 NPs（探针118），这是一种先进的水溶性系统，旨在通过双模式荧光和光声成像技术来诊断小鼠肾脏纤维化（如图48所示）。探针118是一种电子供体-受体-供体（D-A-D）构型的AIEgen（聚集诱导发光基团），通过与0.55 kDa的PEG-NH2进行PEG化修饰，显著提高了其水溶性。
这种水溶性近红外荧光团不仅展现出优异的光稳定性和生物相容性，而且能够精准地识别早期肾脏纤维化。其较小的分子量（约26 nm）使得探针118能够轻松通过肾脏滤过（3.3 kDa），并在24小时内实现高达93%的肾脏清除率。这些特性赋予了探针118卓越的成像性能和良好的生物相容性，使其成为未来开发临床诊断测定的极具潜力的候选材料。
图 48.（A） 自组装超小探针 118 的设计和光物理过程。（B） 利用探针 118 对小鼠肾脏纤维化的进展进行双模成像。
在肾损伤研究领域中，最后一个值得关注的例子是张氏研究小组于2022年研制的一系列刷状荧光探针（如图49所示）。这些探针，如FBP912和119，以偶氮-BODIPY为核心结构，展现出优异的肾脏清除特性。这些探针的发射波长可通过调整取代基来实现精准调控，覆盖从725纳米至1025纳米的宽广范围（如图49所示）。 其中，探针119是通过原子转移自由基聚合（ATRP）技术，在氮杂-BODIPY基单体和低聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯之间合成的水溶性探针。这一设计显著延长了其在体内的循环时间（t1/2 > 6小时）。经过优化后，探针119的近红外-II荧光强度超过了先前报道的所有可清除近红外-II探针的10倍以上，并且在12小时内表现出65%的清除率，为高效、灵敏地检测HIRI（缺氧/再灌注损伤）提供了有力工具。
图 49.近红外-II 刷大分子荧光团。
【器官损伤荧光探针】治疗脑外伤的荧光探针
Fluorescent Probes for Disease Diagnosis
疾病诊断荧光探针
创伤性脑损伤（TBI），作为由长时间血流不畅或暴力创伤诱发的严重病理状态，是导致高致残率和致死率的关键因素之一。这种损伤常伴随不同程度的脑功能损害，包括感觉、运动、认知、行为及心理等方面的障碍。TBI后常伴有的继发性损伤，诸如炎症、血脑屏障（BBB）破坏、氧化应激、缺氧和缺血等，其初期阶段往往难以察觉，这迫切要求发展高效的诊断与治疗方法以实现实时早期的干预。
传统的创伤性脑损伤诊断方法，如CT和MRI，主要侧重于解剖与功能变化的检测，而对早期分子层面的波动响应不够敏感。因此，开发高灵敏度的诊断工具，以实现对TBI的早期原位实时诊断与治疗评估，显得尤为重要。
线粒体次氯酸（HOCl）与线粒体的氧化还原稳态紧密相关，其异常水平可诱导线粒体功能受损和细胞凋亡。2020年，Liu等人报道了一种结合ESIPT苯并噻唑和rhodol结构的比率型双光子荧光探针120（图50），用于实时监测线粒体中的HOCl水平。在该探针中，改性的rhodol染料作为荧光团，二肼作为反应位点，而阳离子季铵化吡啶则作为线粒体靶向基团。当加入NaOCl后，探针在453纳米处的荧光强度变化微小，而在595纳米处的荧光强度显著增强，实现了NaOCl的比率荧光成像。两个波长下的荧光强度之比（I595/I453）与NaOCl浓度呈线性关系，最高可达174 μM，检测下限（LOD）计算为55.4 nM。探针120展现出优异的性能，包括快速响应、高灵敏度和高选择性，同时其双光子激发特性赋予了其在深层组织（达270 μm）中成像的能力。因此，该探针为活细胞和组织中内源性HOCl的监测提供了有力的工具。
图 50.用于创伤性脑损伤线粒体次氯酸成像的探针120。
2020年，Li研究团队成功开发了一种名为V&A@Ag2S（探针121）的近红外-II纳米探针，旨在实现创伤性脑损伤（TBI）早期生物标志物的实时活体成像（如图51所示）。 Ag2S量子点因其独特的宽吸收光谱和尖锐的近红外-II发射光谱而备受关注。当与近红外吸收剂A1094结合后，A1094在1094 nm处呈现出强烈的吸收峰，这与Ag2S的发射窗口存在广泛的重叠，从而有效促进了量子点（QDs）与A1094之间的荧光共振能量转移（FRET）。这种能量转移导致了荧光的显著淬灭，使探针处于“关闭”状态。值得一提的是，探针121对过氧亚硝酸根（ONOO-）展现出高度的特异性，其在1050纳米波长处的荧光强度与ONOO-的浓度呈现出良好的线性关系。因此，探针121在小鼠创伤性脑损伤模型中成功实现了内源性ONOO-的实时监测。
图 51.用于观察 TBI 区域 ONOO 触发荧光反应的探针 121。
2016年，Dai等人设计了一种创新型的NIR-II荧光染料，旨在实现创伤性脑损伤小鼠的脑成像。该染料的结构灵感来源于大型OLED型发光体（如图52所示），并被命名为IR-E1（探针122）。探针122基于经典的供体-受体-受体结构，采用苯并[1，2-c:4，5-c′]-双（[1，2，5]噻二唑）作为受体，以噻吩基单元为供体，构建了一个具有较窄带隙的荧光团。此外，为了保护共轭骨架免受分子间和分子内相互作用的影响，该结构还引入了大分子3，4-乙氧基二氧噻吩作为桥基。
为了提升探针122的水溶性，研究者巧妙地在其结构中嵌入了PEG链。在808纳米波长的激发下，探针在水、PBS以及胎牛血清中均展现出1071纳米的发射波长，这充分证明了探针在不同溶剂和介质中均能保持优异的稳定性。
更重要的是，探针122成功用于监测小鼠创伤性脑损伤模型中的动态血管变化，包括最初的短暂低灌注现象。脑成像研究显示，这些病理变化不仅具有潜力成为药物试验或临床研究的生物标志物，还可作为治疗创新的潜在靶点。
图 52.用于对创伤性脑损伤进行无创评估的 122 号探头。
创伤性脑损伤（TBI）是儿童和青少年死亡与残疾的主要元凶之一，然而，目前尚无有效治疗手段能阻止初次损伤后引发的继发性损伤。这种慢性发展的继发性损伤部分归因于活性氧物种（ROS）向周边正常脑组织的释放。
在TBI的生物标志物中，异位蛋白酶活性的变化尤为显著，它们直接参与细胞死亡、细胞外基质分解以及炎症反应。2021年，Kwon及其研究团队成功研发出一种荧光活性纳米传感器（即123号探针），该传感器能特异性地聚集在大脑受损区域的损伤血管中，并在钙蛋白-1（Calpain-1）激活时发出荧光信号。这一创新技术为实时监测TBI相关的Calpain-1蛋白酶活性提供了可能（如图53所示）。
为提升123号探针的递送效率和生物利用率，研究者对基质靶向肽进行了深入评估。实验结果表明，透明质酸靶向肽能显著增强探针在受损脑组织中的分布，尤其是在病变区域及海马神经元内。这种透明质酸靶向肽涂层的探针通过配体价依赖的方式显著提高了其激活度，相较于非靶向纳米传感器，在受损皮层中的激活度最高提升了6.6倍。
图 53.（A） ECM 靶向探针 123 的示意图和实验设计概述。（B） 主要器官的 VivoTag 750 表面成像。（C） 基于 FAM 荧光的每克组织纳米材料注射剂量百分比（% ID/g）的批量定量（n = 3，平均值 ± SEM；****，p ≤ 0.0001，双向方差分析，以及每个器官组内的 Tukey 多重比较事后检验）。
蛛网膜下腔出血（SAH）作为脑血管破裂所致的中风严重类型，对其出血程度的精确评估对于深入理解脑损伤机制和制定治疗策略至关重要。在2023年，戴氏研究小组基于AIE（聚集诱导发光）原理，利用生物探针TTVP（探针124）开发了一种新型的出血评估系统（如图54所示）。
探针124由4-溴-N，N-二苯基苯胺AIE核心单元与吡啶鎓基团构成，其激发波长（λex）为480纳米，发射波长（λem）为645纳米。由于其独特的分子转子状结构，探针124在水溶液中因其分子高度旋转而几乎不发光。然而，当加入四氢呋喃形成纳米聚集体时，探针的光致发光性质显著增强。
借助这些AIE特性、细胞膜亲和性以及白蛋白靶向能力，探针124能够在出血区域产生高信噪比的特异性荧光信号。该探针已成功应用于小鼠脑部蛛网膜下腔出血的检测，显示出其在SAH及其他出血性疾病出血程度分析中的巨大潜力，有望成为灵敏且高效的诊断工具。
图 54.探针 124 用于 SAH 检测和分类的示意图。（A） 124 号探针的结构及其与血液的反应。（B） 在小鼠模型中使用 124 号探针。（C） 根据在大脑中观察到的荧光强度对 SAH 进行分类。
创伤性脑损伤的一个显著后续影响是组织细胞的死亡或坏死现象。在2016年，Löwik、Cruz及其团队报告了一项创新研究，即利用PEG化聚乳甘酸（PLGA）纳米粒子（探针125）来实现对创伤性脑损伤坏死区域的双模检测与监测（如图55所示）。该探针的表面经过PEG脂质层的修饰，有效降低了非特异性结合，确保了特异性配体仅针对坏死区域进行作用。探针内部封装了IRDye 800CW等青色荧光染料，不仅作为荧光团发挥作用，还特异性地靶向失去膜完整性的细胞内蛋白质。
为了实现对创伤性脑损伤中坏死组织的串联光学成像和19F MRI成像，研究团队在探针125中引入了全氟化碳和NIR700两种物质。这两种模式均能够准确检测坏死组织，但光学成像方法在灵敏度方面表现更为出色。利用探针125，可以快速地对创伤性脑损伤状态进行定性光学监测，同时，通过定量三维核磁共振成像分析，还能够深入评估深层组织的病变程度。这一成果凸显了探针125在脑损伤坏死诊断领域的巨大临床应用潜力。
图 55.双模（近红外 + 19F MRI）探针 125（近红外 700 + PFCE）与 800CW 配体针对死亡细胞的示意图。
参考文献
Wang, X.; Ding, Q.; Groleau, R. R.; Wu, L.; Mao, Y.; Che, F.; Kotova, O.; Scanlan, E. M.; Lewis, S. E.; Li, P.; Tang, B.; James, T. D.; Gunnlaugsson, T. Fluorescent Probes for Disease Diagnosis. Chem. Rev. 2024, 124 (11), 7106–7164. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.3c00776.