Fluolab【疾病诊断荧光探针】免疫治疗中的治疗诊断荧光探针
Fluorescent Probes for Disease Diagnosis
疾病诊断荧光探针
1891年，威廉·科利（William Coley）在一次偶然的观察中揭示了化脓性链球菌感染对肉瘤患者病情缓解的现象，这一发现无意中揭开了肿瘤免疫治疗的新篇章，并逐渐发展成为当今抗肿瘤研究的热点领域。相较于化疗、放射治疗等传统治疗手段，免疫疗法因其高度的选择性、较低的副作用和显著的疗效，在临床治疗领域展现出了巨大的应用潜力。目前，癌症免疫治疗的主流策略包括免疫检查点疗法、过继细胞疗法和疫苗接种，其中，以CTLA-4和PD-1/PD-L1为靶点的免疫检查点阻断治疗尤为引人注目。然而，值得注意的是，约有七成患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的响应并不理想，且部分患者可能面临严重的药物副作用。为突破这些限制并优化免疫治疗效能，科研人员正致力于探索联合治疗策略。
在此背景下，一系列集实时成像与免疫治疗于一体的诊疗性荧光探针应运而生。这些探针通过负载小分子药物，与免疫检查点封锁策略相结合，显著提升了治疗效率。同时，凭借卓越的组织穿透力和适宜的体内存留时间，这些探针为临床诊断提供了实时影像指导，使医生能够迅速、准确地获取体内动态信息，突显了小分子药物在构建诊疗性荧光探针复合体系中的独特价值。
研究表明，肿瘤微环境（TME）的代谢状态对免疫治疗效果具有决定性影响。TME中与免疫治疗密切相关的靶标特征显著，如H2O2水平升高、物理化学性质变异和氧供不足等。针对这些特征，科研人员已开发出多种响应TME特性的诊疗性探针。这些探针的设计基于pH值变化、谷胱甘肽（GSH）含量、H2O2浓度差异以及缺氧状态等，展现出高度的针对性和敏感性。这些探针不仅有助于肿瘤的精确诊断成像，还为深入的机制研究提供了关键数据支持。本章节将综述近期基于TME特性，特别是H2O2响应和缺氧激活机制的诊疗性荧光探针研究的最新进展。
免疫治疗中TME可激活治疗诊断荧光探针
肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，由肿瘤细胞、多种免疫细胞、淋巴血管网络以及丰富的代谢产物交织而成，形成了一个高度动态的网络。TME的代谢特性通过复杂的分子机制对肿瘤免疫反应产生显著影响，尤其是免疫细胞与肿瘤细胞间的相互作用，成为决定免疫防御激活或免疫耐受诱导的关键因素。长期肿瘤抗原刺激和持续的免疫激活反应可能导致TME内效应细胞的耗竭或功能重塑，进而促进肿瘤免疫逃逸和恶性进展。这种免疫抑制性的TME环境极大地限制了免疫疗法的疗效，特别是在T细胞的募集和激活方面。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症治疗中取得了一定的成功，但由于其疗效高度依赖于TME状态，仅有约30%的患者能从ICI治疗中显著获益。因此，单一的免疫疗法模式逐渐显露出其局限性，迫切需要通过改进策略来克服免疫抑制性的TME，提升整体治疗效果。
在此背景下，结合基于小分子的荧光探针与免疫疗法，通过两者的协同作用，不仅可以增强免疫细胞的活性，还能结合光热治疗（PTT）和光动力治疗（PDT），形成多元化的治疗策略。这类治疗探针能够实时监测肿瘤状态，为临床医师提供直观的疾病进展信息和治疗导向，使得TME响应型治疗探针成为提升免疫疗法效能的极具潜力的途径。
近年来，适应性免疫耐受被公认为肿瘤演进的重要标志之一，其中，程序性细胞死亡受体1（PD-1）与其配体PD-L1（B7-H1）的相互作用是调控免疫逃逸的核心机制。PD-L1在多种肿瘤类型如黑色素瘤、乳腺癌和肾细胞癌中过度表达，通过与T细胞表面的PD-1结合，有效抑制免疫应答，从而削弱免疫治疗的有效性。为了克服这一挑战，抗PD-L1/PD-1抗体疗法的引入显著增强了癌症治疗的效果。基于此，Li等人创新性地结合低pH值激活的药物与免疫检查点阻断策略，设计出一种新型的治疗探针。他们合成了一种酸激活的多功能胶束复合物，该复合物集成了pheophorbide A（PPa）光敏剂、针对PD-L1的siRNA以及pH响应聚合物PDPA，形成了一个智能的诊疗平台（图104）。这些胶束在中性pH环境中保持非荧光状态，降低了光毒副作用的风险，而在进入酸性TME（pH<6.2）时，PPa被激活，释放荧光信号用于实时成像，并促进ROS的生成，从而激活肿瘤免疫反应。同时，siRNA的释放有效抑制了PD-1/PD-L1信号通路。实验结果显示，静脉注射168后加激光处理的小鼠组不仅观察到显著的荧光信号，TNF-α和IFN-γ水平也显著提升，标志着免疫激活的显著增强。更为重要的是，该治疗组小鼠的肿瘤被有效消除，且在再次接种相同肿瘤细胞后，75%的小鼠未见肿瘤再生，充分证明了该酸性TME响应药物平台在激发高效抗癌免疫反应方面的卓越效果。
图104。(A)酸激活168的化学结构。(B)168介导的光动力癌症免疫疗法的示意图。B16-F10肿瘤转移灶的(C)照片和(D)H&E染色。
谷胱甘肽（GSH），作为一种强还原性的三肽分子，在细胞内抗氧化防御体系中占据核心地位。GSH与其氧化态形式——氧化型谷胱甘肽（GSSG）之间形成的动态平衡，精准调控着细胞的氧化还原稳态。特别在肿瘤微环境（TME）中，GSH的异常高表达显著提升了环境的还原性，这为研发还原敏感型治疗探针提供了新的方向。基于此，Yu及其团队精心研发了一款GSH响应型前药169。该分子巧妙融合了光敏剂（PPa）、针对还原环境优化的IDO-1抑制剂（NLG919）以及聚乙二醇（PEG）屏蔽层。
IDO-1作为一种关键的免疫调节蛋白，通过促进T细胞凋亡，参与适应性免疫耐受过程，从而影响免疫治疗效果。而NLG919能有效抑制IDO-1活性，增强细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的肿瘤浸润能力。在正常生理条件下，前药169保持稳定且具有良好的隐身性，这得益于PEG外壳优异的生物相容性和肿瘤靶向累积性能。
一旦进入富含GSH的还原性TME，前药169即被特异性激活，同时伴随荧光信号的释放，为实时成像追踪提供了便利，并释放NLG919以阻断IDO-1活性，打破免疫抑制状态（如图105所示）。尤为引人关注的是，通过近红外光（NIR, 671nm）照射，PPa能够催化产生大量活性氧物种（ROS），进而诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。
实验数据通过流式细胞分析显示，经前药169处理并联合激光照射的组别，树突状细胞（DCs）的成熟比例相较于对照组显著提升了1.7倍，同时肿瘤内的干扰素-γ（IFN-γ）水平和细胞毒性T细胞浸润也明显增强。这些发现充分验证了该自组装纳米系统在显著增强免疫治疗效果方面的巨大潜力。
图105。(A)MMP-2可脱落且GSH可激活的前药囊泡169的示意图。(B)4T1肿瘤模型和(C)CT26肿瘤模型的肿瘤生长曲线。(D)4T1荷瘤小鼠的生存曲线。
为实现融合成像导航的声光动力免疫疗法，Ye等人巧妙设计并合成了一种创新的纳米平台——肿瘤靶向且GSH响应的近红外Zn螯合磷酸盐探针（Zn-PPA-SH）。通过将该探针与IDO1抑制剂NLG919及MRI造影剂Gd-DOTA的亲水性衍生物（2-Gd）进行协同组装，成功构建了多功能纳米增敏剂170。该纳米探针Zn-PPA-SH在激光激发下，不仅能高效产生活性氧物种（ROS），从而强化局部的光疗与免疫治疗效应，而且在672nm波段展现出特征性的近红外荧光“开启”现象，为实时影像监控提供了便利。
在小鼠肿瘤模型中，170通过cRGD肽引导的靶向机制，成功穿透肿瘤组织，并通过T1加权MRI实现清晰追踪。在肿瘤微环境（TME）的高GSH环境下，170中的二硫键被选择性还原，促使Zn-PPA-SH与NLG919的有效释放（如图106所示）。治疗后仅8小时，肿瘤区域即表现出显著增强的近红外荧光信号，其强度高达未经处理对照组的6.5倍。
实施包含170注射、超声（US）引导及激光照射的综合治疗策略后，实验动物的生存期显著延长至54天，而仅接受生理盐水处理的对照组小鼠生存期均未超过32天。这一系列研究成果充分展示了GSH激活机制的170在显著提升癌症治疗成效上的巨大潜力。
图106。(A)170用于FL和MR双模成像引导的肿瘤声光动力免疫治疗的示意性机制。(B)释放的2-Gd、NLG919和Zn-PPA-SH的化学结构。(C)170小鼠的BL图像。
免疫治疗中H2O2可激活治疗诊断荧光探针
Zhang及其研究团队精心构建了一种自发光纳米复合材料171（如图107所示），通过将光敏剂Ce6（氯素e6的阴阳离子共轭形式）与荧光酚单元及聚乙二醇(PEG)进行共价连接，实现了诊断与治疗功能的一体化集成。纳米粒子171利用荧光酚与Ce6之间的化学发光共振能量转移(CRET)机制，实现了双重功能的同时发挥。具体来说，在H2O2环境下，荧光酚模块经氧化后发出蓝光，这一过程通过CRET作用得到显著增强，产生与H2O2浓度呈线性关系的高强度荧光信号，为精准诊断提供了有力支持。同时，经CRET介导原位激活的Ce6能有效生成单线态氧(¹O₂)，为光动力治疗(PDT)及免疫疗法提供了高效工具。
为评估纳米复合材料171的治疗效能，我们进行了一系列动物实验。实验结果显示，尾静脉注射后，肿瘤部位呈现出清晰可辨的荧光标记。尤为重要的是，该体系在长达约8小时的时间内持续产生¹O₂，展现出良好的持久性。治疗效果与纳米粒子中Ce6的剂量密切相关，其中3.25毫克/千克的Ce6剂量显示出最佳疗效。这项研究不仅凸显了171作为智能诊疗纳米载体的巨大潜力，也为精准医疗领域提供了新的材料与策略方向。
图107.发光纳米探针171NP的设计，用于成像和治疗表达高H2O2的肿瘤。
肿瘤微环境（TME）中高浓度的过氧化氢（H2O2）为开发氧化还原响应型诊疗探针提供了新的方向。Yu等人通过将聚集诱导发光（AIE）分子TST——一种集成近红外荧光与光热性能的分子——与喜树碱前药（CPT-S-PEG）和免疫检查点抑制剂AZD4635相结合，成功构建了多功能纳米粒子172。在常规生理环境下，172保持隐匿状态，但一旦进入肿瘤细胞内部，其荧光量子产率显著提升15.32%，展现出卓越的荧光成像潜力。
值得注意的是，CPT-S-PEG中的氧化还原敏感键在H2O2的作用下发生降解，促使活性喜树碱（CPT）在TME中释放。同时，TST不仅具有强烈的近红外荧光，适用于即时成像技术（如图108所示），还能高效促进光热治疗（PTT）过程中的活性氧（ROS）生成。AZD4635的加入进一步削弱了由免疫原性细胞死亡（ICD）引发的免疫抑制效应，从而协同增强了PTT与免疫治疗的效果。
实验结果显示，通过808nm激光照射5分钟，172能够迅速将周围介质温度从32.7℃提升至68.8℃，验证了其高效的光热转换能力。在静脉注射后，小鼠体内肿瘤部位展现出清晰的近红外-II区荧光影像，这得益于纳米粒子的增强渗透滞留（EPR）效应。动物实验进一步证实了172不仅具有出色的抗肿瘤活性，还具有良好的生物安全性，仅需12天的治疗周期即可导致肿瘤消退。
尽管基于H2O2的策略已成功与化疗、放疗、光动力治疗（PDT）、声动力治疗（SDT）及PTT等多种癌症治疗手段相结合，用于癌症的诊断与治疗，但要将这些系统全面推向临床实践，仍需克服诸多挑战并继续深入探索。
图108。(A)172治疗肿瘤的示意性机制。(B)静脉注射172或对照后活体小动物的图像。
Cai等人精心在金纳米笼外表面沉积MnO2，成功设计并合成了具有核壳结构的纳米复合材料AuNC@MnO2（简称AM，编号为173）。此纳米体系173因其卓越的近红外光致发光特性，为光激发过程提供了理想的平台（如图109所示）。值得注意的是，AM中的MnO2壳层在实体肿瘤特有的酸性及高H2O2浓度环境下能够自发分解，这一过程不仅原位释放氧气和Mn2+，有效改善了肿瘤微环境(TME)的氧合状态，还赋予了AM出色的光声(PA)、磁共振(MR)及荧光(FL)三模态成像能力。释放的氧气进一步转化为高效的反应性氧物种(ROS)，这些ROS不仅直接杀伤肿瘤细胞，还能触发免疫原性细胞死亡(ICD)，从而启动抗肿瘤免疫应答。特别是在808nm激光的照射下，AM能高效产生单线态氧(¹O₂)，推动光动力治疗(PDT)的进程，并诱导ICD。此外，AM还具备激活和招募T淋巴细胞的能力，为免疫治疗策略提供了新途径。动物实验显示，经静脉注射并结合激光治疗后，AM组小鼠在15天内实现了肿瘤的完全消退，且相较于对照组，肺部转移病灶显著减少，彰显了该纳米粒子在联合治疗中的巨大潜力。
图109.(A)173(AuNC@MnO2)用于治疗的治疗机制。(B)不同治疗组的肿瘤生长曲线。(C)PDT治疗后监测的肺转移实验的小鼠体重。(D)从切除的肺中计数的转移病灶的数量。
免疫治疗中的缺氧激活治疗诊断荧光探针
肿瘤微环境(TME)的缺氧状态，作为癌症治疗中的一大挑战，已受到广泛关注。肿瘤细胞的过度增殖导致氧气供需失衡，加之血管异常增生和血流减缓，使得TME中的氧浓度显著下降，低至正常生理范围的2%至9%。尽管缺氧对正常和肿瘤细胞均有毒性，但肿瘤细胞通过遗传适应性改变，能在乏氧条件下存活。在免疫治疗领域，缺氧具有多重负面影响，如促进T淋巴细胞凋亡、削弱自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞功能、诱导树突状细胞凋亡，并促进免疫抑制细胞的产生，从而限制治疗效果。
为克服这一挑战，研究者们提出了多种策略，包括直接输氧给肿瘤、原位产氧方法以及开发针对乏氧环境的响应性药物递送系统。其中，缺氧激活型治疗探针成为研究热点。Tirapazamine（TPZ）作为一种在缺氧条件下经生物还原激活的药物，能特异性地引发细胞死亡。
Cao等人巧妙地结合了脂质体、碘化青染料Cyl和TPZ，设计出一种缺氧响应的治疗探针174。该探针在静脉注射后能特异性地富集于肿瘤内部。在808nm近红外激光的激发下，Cyl不仅产生ROS以执行光动力治疗(PDT)，还能产生热能用于光热治疗(PTT)，并因其近红外发光特性实现肿瘤成像。PDT过程不仅直接杀伤肿瘤，还能激发免疫反应，招募并激活CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞，促进IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等细胞因子的释放，从而增强免疫治疗效果。此外，PDT导致的氧气消耗进一步加剧局部缺氧，从而促进TPZ的激活，特异性地清除肿瘤细胞。
实验结果显示，注射1小时后，肿瘤区域即出现荧光信号，且持续长达24小时，证明了174优异的成像能力。治疗21天后，174联合激光治疗组展现出最小的肿瘤体积和显著的远端肿瘤抑制作用，标志着PDT/PTT/成像/免疫疗法联合作战策略的成功开发。
图110.(A)174高效协同PDT/PTT/免疫疗法与缺氧激活化疗相结合的方案。(B)174在荷瘤小鼠中的体内动力学。
AQ4N的独特之处在于其乏氧或缺氧条件下的特异性激活特性，这一性质为与光动力疗法(PDT)及免疫疗法的联用提供了增强肿瘤治疗效果的潜力。Yoon等人巧妙地将AQ4N与水溶性酞菁类衍生物PcN4结合，设计出一种新型治疗探针，显著强化了PDT与免疫治疗的协同作用。PcN4在生物体内倾向于特异性地与血清白蛋白形成稳定的超分子复合体，这不仅赋予探针卓越的肿瘤靶向性，还赋予其出色的荧光成像能力和光诱导的抗肿瘤活性。
PDT过程通过增加肿瘤部位的缺氧程度，进一步提高了AQ4N在肿瘤微环境中的激活效率，从而放大了抗肿瘤效果。在缺氧微环境的激活下，PDT还能促进大量ROS的生成，这些ROS不仅直接损伤肿瘤细胞，还能激发免疫检查点阻断(ICB)效应，促进机体的免疫应答。
实验结果表明，经655nm激光照射后，荷瘤小鼠的免疫反应显著增强。这一研究的核心在于，通过整合免疫检查点阻断治疗与活化后的PcN4，能够最大限度地触发全身性、针对肿瘤的特异性适应性免疫反应，为缺氧条件下的肿瘤治疗提供了一条高效途径。
参考文献
Wang, X.; Ding, Q.; Groleau, R. R.; Wu, L.; Mao, Y.; Che, F.; Kotova, O.; Scanlan, E. M.; Lewis, S. E.; Li, P.; Tang, B.; James, T. D.; Gunnlaugsson, T. Fluorescent Probes for Disease Diagnosis. Chem. Rev. 2024, 124 (11), 7106–7164. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.3c00776.