2      光学显微镜原理

2.1  导言

在本章节的深入探讨中，我们将依托几何光学原理与光波特性的深刻理解，系统剖析光学显微镜的构造精髓与功能实现机制。我们的分析侧重于显微镜操作背后的基本物理定律，而非单纯聚焦于复杂光学结构的技术性细枝末节，旨在为读者构建一个宏观而坚实的理论基础。核心目的在于全面揭示显微成像技术的能力边界与潜在局限，为后续章节中更高级、更专业化的知识学习奠定坚实的基础。

尤为值得一提的是，本章还精心引入了生物科学领域内当前最为关键的两项光学对比技术——相位对比与微分干涉对比（DIC）。这两项技术以其独特的优势，成功地为生物及医学研究中广泛存在的透明样本提供了前所未有的对比度增强效果，极大地丰富了我们对微观世界的观察视角与理解能力。相位对比技术通过巧妙利用光波在样本不同区域传播时的相位变化来创建图像对比度，而DIC技术则更进一步，通过引入微小的光程差，实现了更为精细的结构细节呈现。

此外，本章还详尽阐述了荧光显微镜的基本原理、关键组件以及其在科学研究中的广泛应用场景。作为现代生物学研究不可或缺的工具之一，荧光显微镜不仅依赖于特定波长的光激发样本中的荧光分子，还通过高灵敏度的探测器捕捉这些荧光信号，从而生成色彩斑斓、信息丰富的图像。我们特别关注了荧光显微镜技术的最新进展，包括但不限于更高分辨率的成像方法、多色荧光标记技术以及自动化与智能化操作平台的开发，这些创新成果正不断推动着生命科学研究的边界。

2.2 制造光学显微镜

光学显微镜的组件

光学显微镜的精密构造根植于其两大核心组件的协同工作之中：照明组件与成像组件，两者虽功能迥异，却相互依存，共同决定了显微镜的光学分辨率与图像对比度的卓越性能。初学者往往聚焦于成像光束路径上的光学元件，视其为“显微镜之精髓”，却不经意间忽视了照明组件同等关键的角色。实则，照明与成像，二者相辅相成，通过各自独特的光路设计，共同编织出微观世界的清晰画卷。

在初步探讨中，我们依据几何光学的基本原理框架来审视这两大组件，即侧重于光线传播方向与光束路径的几何描述，而暂时搁置光的波动性质及复杂的衍射效应。这一简化处理有助于我们建立起对显微镜基础运作机制的直观理解。然而，值得注意的是，光的波动特性及其衍射现象对于显微镜性能的精细调控同样至关重要，这些深层次的话题将在本章后续章节中得到全面而深入的剖析。

成像路径

现代显微镜的成像系统核心在于其精密的双透镜结构，这一结构由物镜与管状透镜两大元件组成，共同协作以实现对微小标本或物体的清晰成像。在这一成像过程中，标本被精准地置于物镜的前焦平面上，物镜则发挥其关键作用，将物体转换为看似位于无限远处的虚拟图像，这一转换过程遵循了几何成像定律的深刻原理。

如图2.1所示，从物体两端发出的光线，特别是从物点o1及离轴点o2发出的光线，在物镜的作用下经历了复杂的变换。物点o1处的光线被物镜转化为平行于光轴的光束，这些光束随后穿越至管状透镜，并在其内部经过折射，最终聚焦于管状透镜的后焦平面，形成物体的初步像。而对于从离轴点o2发出的光线，其路径尤为关键，可通过两束特殊光束——光线rc（直穿透镜中心，未经折射）与光线rp（平行于光轴发出，聚焦至物镜后焦点）——的轨迹来追踪。这两束光线在物镜与管状透镜之间的空间中保持平行，这一区域被称之为无穷远空间，其特性在于所有从o2发出的光线均在此空间内维持平行状态。 图 2.1 使用光敏阵列图像探测器的无穷远校正成像过程。 f _obj 和 f _tl 分别表示物镜和管镜头的焦距。

管状透镜的位置虽然具有一定的灵活性，但在实际应用中，为了获得最佳的成像效果，其前焦点通常会与物镜的后焦点保持重合或接近重合。通过进一步追踪管状透镜的特殊光束，特别是那些穿过其前焦点的光束，我们可以发现这些光束在通过管状透镜后被转化为平行于其后光轴的光束rp'，而中心光束rc'则直接穿过透镜，未发生折射。这一转换过程确保了o2点在管状透镜后焦平面上的准确投射，形成物体的实像，即初像面。初像面的位置与大小直接关联于光轴与特定像点（如b1、b2）之间的垂直距离，从而实现了对物体尺度的精确放大。

此外，该双透镜系统的放大系数M是一个关键参数，它直接反映了成像系统对物体尺寸的放大能力。放大系数M的计算涉及物镜焦距f_obj、管状透镜焦距f_tl以及物体与像之间的几何关系。通过精确测量这些参数，我们可以得出双透镜系统对物体放大的具体倍数，这对于显微镜在科学研究、医学诊断等领域的广泛应用具有重要意义。

图 2.2 带有两个无限远校正放大级的显微镜。两个放大阶梯顺序排列的放大系数是两个单一系数的乘积。

为了实现对显微镜样品的清晰观察，显微镜采用了两级放大的设计（如图2.2所示）。第一级放大由物镜和管镜头共同完成，它们协作将样品图像初步放大并形成中间像或主像。物镜的直径通常在2至3厘米之间，其类型和质量直接影响成像的清晰度和分辨率。

第二级放大则是一个与第一级相似的双透镜无限远光学系统，但这次它服务于将中间像进一步放大并投射到观察者的视网膜上。这一级由目镜和眼球透镜组成，共同构成了观察者的视觉接口。视网膜作为第二像面，接收并解析来自显微镜的最终图像。

在显微镜的成像过程中，透镜系统可以通过两种主要方式产生实像：有限光学设置和无限远设置。在有限光学设置中，物体位于透镜的一倍至两倍焦距之间（f < s_o < 2f），此时透镜在主像面与透镜固定距离上直接形成一个倒立且放大的实像。而在无限远设置中，物体则被放置在物镜的焦平面上，随后利用管镜头等后续光学元件在无穷远处形成图像，这种设置在现代研究用显微镜中尤为常见，被称为无限远校正显微镜。

无限远校正显微镜的优势在于其物镜后的光路中仅包含平行光线，这些光线源自样品的不同位置且相互平行。这一特性使得在物镜与管镜头之间插入额外的平面光学元件成为可能，而不会干扰光束的路径。这些额外的元件，如荧光滤光片立方体、偏振分束器、分析器或附加滤光片等，对于实现各种对比成像技术至关重要。

此外，无限远校正物镜还允许通过移动物镜而非样品台来进行对焦，这一特性在需要精确控制对焦位置或样品位置受限的情况下尤为有用。综上所述，无限远校正显微镜以其灵活的成像配置、高清晰度的成像能力以及便于集成额外光学元件的特点，在科学研究和技术应用中发挥着不可替代的作用。它也可用于补偿残余像差。这种设置的最大优点是物镜后的光路只包含来自不同物体位置的平行光线。由于平行光束只会被平面平行的光学元件位移，因此有足够的空间插入额外的平面光学元件，而不会扭曲光束路径。荧光滤光片立方体、偏振分束器、分析器或附加滤光片等光学元件是各种对比技术所必需的。它们大多安装在物镜和管镜之间。无穷远校正物镜的另一个优点是可以通过移动物镜而不是试样台来对焦。

放大倍率

在有限光学装置中，尤其是中小倍率的普通透射光显微镜，物镜直接生成实像及倒立的主像，这一技术在商业上具有显著优势。然而，其主要局限在于，即便是平面平行的光学元件插入系统后，也会不可避免地扭曲成像光束的路径。为了纠正这一问题，物镜与主像面之间需增设一套透镜系统。

现代显微系统中，光检测装置如CCD相机常直接安装在主像平面上，简化了成像流程，仅需一步放大即可捕获图像。但在目视观测场景下，主像需通过目镜系统进一步放大，随后置于目镜前焦平面附近，目镜则负责将图像映射至无限远处，便于人眼聚焦于视网膜上，此时眼睛成为成像系统中不可或缺的一环（如图2.2所示）。由于主像位于前焦平面，从目镜出射的光线保持平行，模拟了观察无穷远物体的效果，这是眼睛最为舒适的视觉状态。

目镜在此扮演了放大镜的角色，与眼睛协同工作，形成第二个无限远成像系统，最终将图像清晰投射至视网膜。值得注意的是，图2.2及本章其他图示中，目镜被简化为单透镜，实际上它同物镜一样，是由多个内部透镜精密组合而成的系统，用以校正成像中的各种伪影。

至于目镜的放大倍率（即第二级放大），其计算依赖于放大镜的放大系数，该系数通过比较使用（B'）与不使用（B）放大镜时物体像的大小与原始大小（O）的比值（M_mg = B'/B）来确定。在无穷远系统中，此放大倍数可简化为眼球透镜焦距（f_eye）与放大镜焦距（f_mg）之比（M_is = f_eye/f_mg），进而得出像的大小B' = O × f_eye/f_mg。当物体置于眼睛正常视距（250毫米）处直接观察时，视网膜上像的大小B约为O × d_eye/250毫米，其中d_eye为眼球晶状体至视网膜的距离，近似等于眼球焦距f_eye。由此，可推导出放大镜的放大倍数为M_mg ≈ 250mm/f_mg。

最终，将显微镜目镜的放大系数（M_ep，以目镜焦距f_ep表示）与上述放大镜放大倍数相乘，即可得到复式显微镜的总放大倍率M_total=M_obj × M_ep。

理论上，总放大倍率可以是无限的；但是，应该选择的有意义的放大倍率是可以明确定义的。最佳放大系数的确定将在第 2.3.6 节中讨论。

角度和数值孔径

物镜作为显微镜系统的核心组成部分，其一个至关重要的特性在于其收集物体发出光线的能力，这一能力通过物镜能够捕捉到的最大光线角度来量化。具体而言，只有当光线位于一个特定的锥度范围内时，这些光线才能被有效利用以形成清晰、完整的图像。这个锥度范围的最大值，即物镜的总角度开度，也被称作角度孔径，是定义物镜性能的一个关键参数（如图2.3所示）。 图2.3 物镜的角度孔径

在图2.3中，角度𝛼被特别标注出来，它实际上是角度孔径的一半。这个角度的正弦值，在显微镜的光学理论中占据着举足轻重的地位，因为它是计算物镜数值孔径（NA）的基础。数值孔径NA，作为衡量物镜光学性能的一个综合指标，其定义为透镜与物体之间介质折射率的乘积与光线最大入射角正弦值的比值。

这里的n，特指透镜与物体之间介质的折射率，它对于确定光线在传播过程中的路径弯曲程度至关重要。

在生物学研究中，生物样本往往被置于特定介质中进行观察，以改善成像质量。例如，常见的缓冲水溶液的折射率约为n_w = 1.33，这种环境适用于大多数常规观察。然而，为了进一步提升分辨率和对比度，科学家们还会采用油浸法，即使用折射率更高的油（如n_oil = 1.518的浸油）作为介质。值得注意的是，不同介质的折射率要求物镜必须进行相应的设计和优化，以确保最佳的成像效果。

数值孔径NA的重要性在于它直接关联到物镜的分辨率、亮度以及景深等多个方面。更高的NA值意味着物镜能够收集到更广泛角度的光线，从而提高了图像的分辨率和清晰度。同时，它还能增加图像的亮度，使得在低光条件下也能获得良好的观察效果。此外，NA还与物镜的景深密切相关，影响着成像过程中焦点深度的变化。因此，在本章的后续内容中，我们将详细探讨NA的各个方面，以及它如何影响显微镜的成像质量和应用范围。

视野

在主像面上，可观察到的物像场受到通常位于目镜内部的视场挡板的限制。以毫米为单位的该孔径被称为场数或视场数 s。根据该场数和物镜的放大倍率 M_obj，可以最大限度成像的物场直径 D_obj 由以下公式给出

显然，成像质量取决于物镜的场性能，即像场周边区域的成像质量。在老式显微镜中，可用视野数最多为 18，而现在平面消色差显微镜的标准视野数为 20，现代平面消色差显微镜的校正最大视野数可达 28。视野性能差的物镜会在图像外围区域产生模糊和色差。

照明光束路径

光学显微镜的照明系统扮演着至关重要的角色，其重要性不仅限于单纯照亮不发光的标本，而是与成像光学系统并列，共同塑造着对比模式、决定仪器的分辨率，并调控着整体亮度。这一系统包含两大主要的光学配置，各有特色与适用场景。

其一，是较为直接且结构相对简单的照明方式——源聚焦或临界照明，它以其简洁高效的特点，在某些应用场景中发挥着重要作用。

另一方面，更为广泛采用且功能全面的照明配置则是柯勒照明。柯勒照明以其独特的优势，成为光显微镜照明系统中的主流选择，为科学研究与观察提供了更为优越的光学条件。

临界照明和柯勒照明

在光学显微镜的复杂世界里，照明系统作为成像质量的关键因素之一，其设计与配置直接影响了观察结果的细节与清晰度。图2.4a展示了临界照明的光束路径，这是一种基础而直接的照明方式。在此模式下，光源通过聚光透镜（即所谓的聚光器）直接投射到物体平面上，形成一个明亮的照明区域。聚光透镜前焦面上的可变孔径调节着透镜的孔径大小，进而控制照射到试样上的光量，但同时也影响着照明区域的范围。光源的选择至关重要，通常采用乳白玻璃灯泡或背面照射的乳白玻璃板，以确保光源尽可能大且均匀无特征，以避免物体亮度受到不均匀照明的干扰。临界照明因其操作简便、设置直观且所需光学元件少，而广泛应用于不具备特殊对比技术的常规显微镜中。 图 2.4 照明和成像光束路径。(a) 临界照明。(b) 科勒照明和 (c) 相应的成像光束路径。

相比之下，柯勒照明（如图2.4b所示）则是科学显微镜领域的标准照明模式，得名于其发明者奥古斯特-柯勒在1893年的创新贡献。此照明系统复杂而精细，由光源、双光阑（场挡与聚光器孔挡）、双透镜（收集器与聚光器）组成。光源的灯丝经过聚光透镜前焦面的集光透镜成像，确保所有离开聚光镜的光线以平行光束的形式射向物体平面，并通过试样。这一过程中，物镜将未衍射的平行光束聚焦于其后焦平面上，形成光源的像，体现了光学共轭平面的概念。特别地，物镜后焦平面与聚光透镜前焦平面互为共轭，这一特性在相位对比、DIC等高级对比技术中发挥着核心作用。

柯勒照明的优势显著：首先，尽管使用如灯丝这样的结构化光源，但通过平行光束的传输方式，确保了试样表面的均匀照明；其次，由于场挡位于试样的共轭平面上，照明场的大小完全由场挡控制，与聚光器孔径独立，提供了高度的灵活性；再者，调整聚光器光阑尺寸可改变入射光的开口角度和数值孔径（NA），从而在不改变照明区域大小的前提下，精细调控试样的对比度和光学分辨率；最后，聚光器前焦平面与物镜后焦平面的共轭关系，为多种高级显微技术提供了坚实的理论基础。

综上所述，无论是临界照明还是柯勒照明，它们各自以其独特的方式优化着显微镜的照明效果，为科学研究与观察提供了强有力的支持。而柯勒照明，以其卓越的性能和广泛的应用潜力，已成为现代科学显微镜不可或缺的组成部分。

2.2.6.2     明视野和落射照明

在前面讨论的照明光束路径中，试样位于光源和物镜之间。这种配置被称为斜照、透射光照明或简单的明视野照明。物镜收集穿过标本的照明光和标本衍射的光。各种光显微技术都使用这种照明方式。不过，在许多情况下，从观察的一侧照亮试样是有利的，例如，在观察不透明或荧光试样的反射时。在这种情况下，照明和成像的某些光学元件是相同的，例如物镜。如图 2.5 所示，试样通过物镜由半透明镜照射。半透明镜引导光线通过物镜，而物镜则同时扮演聚光器的角色。这种设置被称为事件光或落射照明配置。科勒照明也可以在落射照明中实现。为此，只需将灯丝的图像投射到物镜的后焦平面上即可，如图所示。在落射照明中，照明场的大小由位于光源和半透明镜之间的场挡调节。在落射照明中，聚光透镜的前焦平面与物镜的后焦平面相对应。但是，光圈直径不是在这个平面上调整的，而是在另一个共轭平面上调整的，为了简单起见，图 2.5 中没有显示这个平面。传统的显微镜配置为直立式。物体放置在物镜上，物镜从下往上照射，从上往下观察。直立式显微镜的光路直接，光学效率高。但缺点是在观察过程中很难操作物体。在倒置显微镜上，样本位于物镜上方，因此可以从下方观察。当在装有液体培养基（如细胞培养瓶或培养皿）的开放室中检查样本时，这种配置非常方便。在显微镜检查过程中，可以很容易地对样本进行操作，例如显微注射。倒置显微镜除了具有更容易接近标本的优点外，通常还更加稳定。在仪器底部设有摄像端口的显微镜具有最高的光学效率。

图2.5 显微镜的不同照明方式

2.3  波动光学和分辨率

显微镜中光线的路径由折射定律以及透镜表面的位置和曲率决定。通过简单的几何光学，我们能够推导出光学系统的许多基本成像特性，如放大倍数和透镜像差。然而，要理解显微镜分辨率和图像对比度受限的根源，则必须考虑光的波动性质。在深入探讨之前，重要的是要仔细区分放大倍数与分辨率。虽然可以通过在显微镜中添加更多放大级来增加放大倍数，但成像系统的分辨率却存在一个基本限制，无法超越。分辨率指的是图像中可识别的细节水平，如微小而复杂的结构或紧密排列的小物体之间的距离。实际上，这种距离被用来定义和量化光学分辨率。在使用光学显微镜时，当微小物体之间的距离至少为~0.25微米，并采用绿光和高品质油浸物镜时，这些物体可以被区分开来。这显然意味着活细胞中发生的蛋白质和超分子复合物无法被详细识别。在后续章节中，我们将讨论如何通过先进的光学技术来克服或规避这一基本的光学分辨率限制。

2.3.1         成像过程的波光学描述

以下是对提供内容的重新整理和专业翻译：

光学分辨率极限的严谨探讨

根据恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）的实验和论证，我们有一套严谨的方法来探讨光学分辨率极限。在此，我们概述主要论点，并考察光照射物体并通过透镜系统成像时发生的情况。我们从简单物体开始，然后推广基本思想。

假设物体是一个简单的矩形光栅，由彼此相距d的多条线组成，d被称为光栅常数，量级为微米级，接近可见光的波长。我们用波长为λ的相干光从透射方向照射光栅。为简化分析，我们仅考虑平行于光轴的光线。光栅使入射光发生衍射，并形成衍射图样，这是由于从光栅各条线上发出的惠更斯（Huygens）小波造成的。光学教科书通常会讨论此类光栅衍射图样。

可以证明，只有当光栅线发出的惠更斯小波在非常特定的方向α_n上发生相长干涉时，才能观察到明显的衍射现象。这些方向满足所谓的布拉格条件（n为整数）：

在其他方向上，波因相消干涉而相互抵消。因此，在光栅后方，我们将观察到特定方向α_n上的衍射波前或光束。如果我们在光栅后方很远处放置一个屏幕，将观察到对应于不同衍射级n的明显衍射光斑。然而，当我们在物体后方空间放置一个透镜时，透镜会将衍射图样聚焦到其后焦平面上。所有衍射级都是平面平行波前，它们将在透镜焦平面上的位置p_n处聚焦成点。正p_n和负p_n分别表示光轴上方和下方的位置（图2.6）。

图2.6 光栅结构成像

为了创建之前引入的无限远光学条件，我们将透镜（代表物镜）放置在物体后方精确的一个焦距f处。如果透镜满足冯·比伦条件，我们可以将布拉格条件（式（2.8））代入式（2.9）来计算位置p_n：

从焦点p=0开始，我们发现光栅衍射产生的光在光轴上方和下方对应的衍射级随着n的增加而增加。有趣的是，具有较小常数d的更精细光栅的衍射图像在位置p_n处显示的点距离光轴更远，因为d是式（2.10）的分母。此外，p_n与波长λ成线性关系。因此，使用白光照明将产生边缘呈红色和蓝色的点，分别远离和靠近光轴。

一个非常普遍的结论是，透镜在其后焦平面上产生物体的衍射图样图像，而且物体不必位于前焦平面上，正如我们所选择的那样。对于显微镜而言，恩斯特·阿贝注意到了后焦平面的极端重要性，并在他1873年发表的著名经典文章中进行了广泛讨论。

从这一点出发，我们可以简单地使用第二个透镜（管镜）来构建显微镜，如之前所述。衍射图样再次呈现重复结构。我们将在管镜的后焦平面上找到第二个衍射图样，这是第一个衍射图样的衍射图样。这是我们之前引入的初级像平面。第二个衍射图样将根据物镜和管镜焦距之比（由式（2.3）给出）进行放大。实际上，阿贝非常合乎逻辑地将物镜后焦平面上看到的结构称为“初级”像，将最终投影的像称为“次级”像。然而，我们将坚持我们之前的定义。

如果我们成像越来越精细的光栅会怎样？式（2.8）和（2.10）表明，随着d的减小，α_n和从光轴到衍射级焦点的距离p_n将越来越大。然而，透镜代表了一个有限大小的孔径，它限制了可以收集衍射图样的角度至α_max。很快，即使是大透镜也会错过一些衍射级，因为出于实际原因，我们无法制造出孔径角接近90°（π/2）的透镜。这导致用于形成最终图像的第一个衍射图样不完整，该图像将不再是初始结构的真实图像。当连第一个衍射级都无法通过透镜传递时，即

光栅结构的所有信息都将丢失。这是显微镜分辨率极限的物理原因。

最后，考虑到物体空间中可能存在折射率为n的浸没介质，这会减小光的真空波长λ0，我们最终得到周期性物体（如光栅）的分辨率极限：

如果照明方向与光轴平行，则此表达式有效。如果我们在斜角下照明物体，干涉条件会略有不同，并且在最大可能斜照明下，式（2.12）的分母中会出现额外的因子2。因此，高斜角照明可以提高显微镜的分辨率。稍后，我们将给出当成像点物体而非重复光栅结构时显微镜分辨率极限的类似表达式。

所呈现考虑的核心要点是，即使是一个理想的、无像差的物镜，在其后焦平面上不改变第一衍射图样的相位或振幅，也会对成像过程产生严重影响。显然，衍射图样的外点代表物体最精细的细节，因为光栅常数d的减小会增加α_n并使p_n远离光轴。因此，显微镜能够产生的图像往往会遗漏原始结构中最精细的细节。

2.3.2         艾瑞斑

艾里斑模式

之前关于成像光栅结构的讨论揭示了显微镜分辨率极限的物理原因。现在，让我们在物镜前的焦点处放置一个点物体，而不是光栅，如图2.7所示。同时，我们假设光线束与光轴之间的角度很小，并忽略光的矢量特性。点物体会将入射光衍射成球面波w_o。球面波的一部分被透镜（假设为理想且无像差的）转换成平行波前w_i。如前所述，这种振幅恒定的波前对应于点物体的衍射图像。然而，它受到物镜有限角孔径的修正。根据惠更斯原理，我们可以想象透镜后焦平面上的平行波前w_i的每个点都是惠更斯小波的发源地。所有小波都具有相同的相位，因此完全相干。 图2.7 源于物镜出瞳的小波干涉

如果在物镜后放置一个管镜以投射衍射图样，则由于只有该点对所有小波的光程长度相同，小波在像平面上的焦点处会相互产生相长干涉。这一点也对应于点物体的图像位置，可通过几何光学或光线追踪确定。然而，由于这个图像光斑是有限范围内小波干涉过程的结果，因此它有一个有限的直径。在像平面上，光轴一定距离周围存在一个圆形区域，由于小波的光程长度差异（OPDs），它们在此区域产生相消干涉，这在图2.7中用暗条纹表示。在距离焦点更远的地方，我们发现第二个圆，其中大部分小波产生相长干涉。在相消干涉的暗区周围出现了一个亮环（图2.7中用虚线表示）。这个亮环之后又是一个相消干涉的环，接着是相长干涉的环，以此类推。总的来说，小波的干涉过程导致了图2.7右侧所示的强度分布。该图显示了二维旋转对称强度分布的中央截面。这种明暗相间的强度分布也被称为艾里斑模式，中央的亮点是艾里斑。

正如之前讨论光栅时所述，最终图像是由物镜后焦平面上衍射结构中产生的惠更斯小波干涉形成的。因此，由于干涉的原因，点物体的图像不是一个点，而是一个具有特征强度分布的模糊光斑。这个分布被称为成像透镜的点扩散函数（PSF）。其解析推导并不复杂但冗长，这里不做详细讨论。

再次考虑物镜后焦平面上的圆形平面波段，这是物镜孔径限制下点物体的衍射图像。它对应于被一个平面波照亮的半径为a的圆形孔径后面的场。对于成像过程，只有远离孔径的场才是相关的。因此，我们可以忽略出射波的曲率，只考虑平面波（图2.8a）。 图2.8 弗劳恩霍夫衍射

为了计算远场，我们需要对孔径处产生的小波贡献进行积分，并计算总场。该情况具有径向对称性，场强仅是光轴角度θ的函数。对于R ≫ a，孔径表面上小波的积分得到以下场E(θ)的表达式：

其中，表示一阶第一类贝塞尔函数。管镜会将这个弗劳恩霍衍射图样从远场投射到其焦平面上（图2.8b）。以角度θ平行落在透镜上的光线在焦平面上距离光轴r处聚焦，其中β是管镜开口角的一半。当我们考虑到管镜的焦距在实际中在160到250毫米之间，镜头孔径最大为20毫米，最大图像尺寸为28毫米时，方程（2.22）中的近似对于管镜是合理的。

将此表达式代入方程（2.21），得到管镜焦平面上场的振幅作为到光轴距离r的函数：

透镜焦平面上作为到光轴距离函数的光强度I(r)通过计算I(r) = [E(r)]²得到。这导致以下表达式（2.24）：

其中I₀是透镜焦点的光强度。函数E(r)和I(r)在图2.9中绘制。

2.3.3         点扩散函数与光学传递函数

前面的讨论直接引出了成像的核心概念，像显微镜这样的光学系统实际上只是物体空间频率的低通滤波器。由于点对象被成像为艾里斑图样，因此精细的物体细节会变得模糊。微观成像实际上是对现实进行平滑处理的过程。

图2.9 对自发光点物体成像时，管状透镜焦平面上的强度和场分布

2.3.4         横向分辨率与轴向分辨率

2.3.4.1     使用非相干光源的横向分辨率

透镜系统孔径的衍射是光学成像分辨率限制的原因。一个发光点对象的图像对应于强度分布I(r)（方程(2.24)和图2.9b），这被称为艾里图样。在该图样中，由中心最大值与第一个零点之间的距离定义的圆形区域被称为艾里斑。贝塞尔函数的零点位于x=3.83处，因此，在像平面上艾里斑的半径r_im,0由以下公式(2.27)给出：

在像平面上，完整分布的总光量的84%位于距离0 < r < r_im,0的范围内。为了找出在物平面上对应的距离r_obj,0，方程(2.27)必须除以放大因子M。r_im,0在物空间中的对应值为r_obj,0 = r_im,0/M。考虑到物镜/管镜系统的正弦条件，并考虑到物空间中通常存在折射率为n的浸没介质，需要使用𝜆/n作为波长，我们得到r_obj,0的表达式为(2.28)：

其中𝛼表示物镜开角的一半。注意n sin 𝛼是物镜的数值孔径（NA）。而将2.28带入到2.27则可以得到r_obj,0的公式（2.29）

现在，我们来看由两个相距d的相邻点对象产生的图像。首先，我们考虑非相干光源，例如两个单独的荧光分子。由于发射体彼此独立，它们的光不能相互干涉。这两个点对象不是以点的形式成像，而是以“模糊”的强度分布形式成像，如图2.10所示。总的光分布是通过将方程(2.24)给出的两个强度分布相加得到的。当d > r_obj,0时，仍然可以观察到两个明显分开的最大值（图2.10a）。 图2.10 两个非相干点光源在图像平面上的强度分布表面图。

如果点对象在物空间中以距离d靠近彼此，且d = r_obj,0，则它们的艾里斑在像平面上会明显重叠（图2.10b）。在这种情况下，两个最大值中心之间的信号强度约为最大强度的75%。我们说两个对象是可分辨的，当它们在图像中仍然可以相互区分时。分辨率丧失的确切距离取决于探测器或观察者区分强度水平和信噪比的能力（图2.10c）。因此，分辨率距离的确切定义有些任意。瑞利勋爵提出距离d = r_obj,0作为光学分辨率的判据，因为在这种情况下，人眼仍然可以感知到两个分开的图像点。这一条件被称为瑞利判据。如果对象之间的距离远小于该值，则它们无法再被感知为单独的对象（图2.10d）。根据瑞利判据，光学分辨率d_R为：

d_R越小，光学系统的分辨能力越高。该公式解释了为什么使用短波长的光（如蓝色甚至紫外线）相比长波长的光（如红色或红外线）能提供更高的分辨率。结合使用高NA物镜和具有更高折射率（如水、甘油或油）的浸没介质以及合适的物镜，可以进一步提高分辨率。

2.3.4.2     相干光源的横向分辨率

对于两个相干点光源，情况则有所不同。这些光源可能由显微镜样品同一平面上的两个小结构形成，它们被平面波照亮。随后，两个光源发出的衍射光波具有相同的相位，并可能在像平面上相互干涉，最终形成的场分布由两个场分布之和决定，如方程(2.23)所示（见图2.9a）。观察到的光强度分布现在是通过场贡献之和的平方得到的，而不是像之前讨论的自发光点对象那样通过各个场贡献的平方和得到。这产生了与不相干点对象截然不同的图像，如图2.11所示。在图2.11中，展示了两个相干点光源的图像，它们在物平面上彼此相距d。这个图像与不相干情况（图2.10）大相径庭。特别是，当d等于方程(2.30)中定义的r_obj,0时，两个像点显然是不可分辨的。相反，需要更大的距离d，使得两个最大值之间的光强达到约0.75I₀的最小值。这个值可以用作两个相干点光源的“瑞利型”分辨率极限。显然，相干对象的光学分辨率降低了2倍。这是一个重要事实，因为相干对象在显微成像中很常见。在明场照明中关闭聚光镜光圈会产生点状光源。通过样品的光是相干的，因此衍射波也是相干的。在这种情况下，横向分辨率由方程(2.31)给出。

图2.11 两个相干点光源在图像平面上的强度分布表面图。

到目前为止，我们假设照明波沿光轴传播并同时击中物平面上的结构。在这种情况下，衍射波之间没有相位差。然而，当入射波与光轴成一定角度传播时，情况就大不相同了。此时，起源于物平面的惠更斯衍射小波相对于彼此具有特定的相位差，因为它们是根据在样品中的位置在不同时间点产生的。这种衍射光中的相位差在光被聚焦的像平面上仍然存在，图像由相干且相位偏移的波的干涉形成。现在，必须像之前那样对两个场振幅进行求和，但必须考虑它们之间的相对相位差。当样品被扩展光源的透射光照亮时（例如，通过完全打开的聚光镜光圈），则存在许多不同的照明点光源。当接近光圈极限时，这些光源的照明角度各不相同。每个光源本身都会照亮样品并产生来自样品的相干衍射光。然而，就彼此而言，这些光源是不相干的，因为它们对应于照明灯丝上的不同位置，因此在像平面上产生的所有光分布必须一起求和。必须在各个斜照明角度产生的强度分布上以适当的方式进行求和。必须考虑到，由于聚光镜外圈中更斜的照明方向数量更多，因此它们的贡献更大。最终图像取决于照明的详细模式，或者换句话说，取决于照明光的相干程度，这可以通过聚光镜光圈的大小来调节。确切地说，是聚光镜照明的数值孔径（NAcond）决定了照明光的相干程度。根据瑞利判据，最终分辨率可以表述如下：

对于带有聚光镜的明场照明，可实现的分辨率取决于照明透镜的性质及其数值孔径（NA）。关闭聚光镜光圈（减少样品中的光散射）会降低可获得的光学分辨率，因为照明光的整体相干性增加了。必须在减少杂散光和提高焦深之间，以及降低横向光学分辨率之间做出选择。

2.3.4.3     轴向分辨率

截至目前，我们讨论了图像平面内光强的精确分布。然而，图像形成是一个三维过程。光波通过物镜前方的空间（即物空间）、物镜、物镜与管镜之间的空间以及管镜，最终到达图像平面。随后，这些光波在图像空间内聚焦形成图像。它们不仅在图像平面内相互干涉，还填充了管镜之后的所有空间，产生了复杂的三维光强分布。艾里斑（Airy pattern）精确地描述了初级图像平面内的横向光强分布。其数学表达式（方程（2.24））可以通过所谓的近轴近似进行解析推导。这意味着它仅在接近物体和图像空间光轴的小区域内有效，且所考虑的光轴角度必须很小。利用近轴理论，可以解析地计算出自发光点图像中心附近完整的三维光强分布。图2.12展示了这一分布的图形表示，该分布以归一化光学单位表示到图像中心的距离的函数。 图2.12 根据准轴向理论得出的三维光强分布。

沿光轴的光强分布可以进行解析描述，光轴上强度最大值与第一个最小值之间的距离z_0,im可以作为轴向分辨率的判据，类似于瑞利判据。在图像空间中，对于低数值孔径（NA_obj）的情况，z_0,im由下式给出：

由于，这对应于物空间中的轴向距离z_0,obj：

实际上，这是自发光点物体所在物体台必须移动的垂直距离，以使图像从中央强度最大值变为第一个最小值。虽然横向分辨率取决于NA的倒数，但轴向分辨率与NA²的倒数相关。图2.13展示了不同浸没介质下横向和轴向分辨率对NA的依赖关系。确实，在相同的NA下，水浸和空气浸物镜比油浸物镜具有更高的轴向分辨率，但它们的径向分辨率没有差异。

图2.13 空气、水和油浸物镜的轴向和横向分辨率与数值孔径的函数关系。

2.3.5         放大和分辨率

在深入探讨显微镜成像技术时，我们首先要认识到点状物体在图像平面上的横向表示与著名的艾里模式（Airy pattern）紧密相关。这一模式不仅揭示了光的衍射效应，还直接关联到显微镜的分辨率极限。在现代显微成像系统中，图像通常由高灵敏度的数字设备如CCD摄像机捕获，这些设备具备特定尺寸的探测器元件（通常表示为d_d）。

为了最大化显微镜的分辨率潜力，选择适当的整体放大倍率至关重要。理想情况下，这一放大倍率应确保图像平面上的艾里斑半径（d_Airy）至少为探测器元件尺寸（d_d）的两倍。如图2.14所示，当探测器元件尺寸接近艾里斑半径的一半（d_d ≈ d_Airy/2）时，图像探测器能够最有效地捕捉并记录图像中的所有可用信息，从而避免信息丢失或模糊。

因此，确定最佳放大倍率（M_opt,d）需综合考虑光学系统的分辨能力以及检测系统的特性，特别是探测器元件的尺寸，如CCD光电二极管的边长。根据这一逻辑，最佳放大倍率可近似等同于光学系统可达到的分辨率（d_R），这一关系在公式(2.30)中得到了定义。

以横向光学分辨率为0.25微米的显微镜和探测器尺寸为6.25微米的场景为例，计算得出的最佳放大倍率应不低于50倍。 图2.14 光学分辨率和探测器元件尺寸。(a) 以瑞利距离 d_res 分隔的两个点物体的图像。(b) 通过图像水平中心的线剖面图。(c) 使用探测器元件尺寸 d_d = M × d_res/2 生成的图像。M 是整体放大系数。在数字化图像中，两个物体被分开。(d) 探测器尺寸 d_d = M × 0.24 × d_res。可以识别两个物体的强度分布细节。这种情况被称为 "超分辨率"。如果 d_d > M × d_res/2，数字化图像将无法保持光学分辨率，如 (e) d_d = 1.5 × M × d_res 和 (f) d_d = 0.9 × M × d_res 所示。

然而，当考虑显微图像的视觉检测时，情况则有所不同。人眼的分辨率受限于能够区分两个物体点的最小视觉开角，这一角度通常不小于2或弧度。若将0.25微米的物体置于25厘米的舒适视距处，其对应的视角仅为弧度，远低于人眼的分辨极限。

为了满足目视观察的需求，总放大倍率（M_eye）需显著增加。这一放大倍率通常通过多级放大系统实现，其中第一级由物镜和管状透镜组成，提供初步放大（如100倍），第二级则由目镜和眼睛共同完成进一步放大（如10倍）。这样的组合确保了图像在视觉上足够清晰，便于观察和分析。

值得注意的是，超过公式(2.39)和(2.40)所定义的最大有效放大倍率的额外放大被称为“空放大倍率”，因为它不再提供新的图像信息，而是简单地放大了已存在的图像细节，可能导致图像质量的下降或观察的不便。因此，在实际应用中，合理控制放大倍率是实现高质量显微成像的关键。

2.3.6         景深和焦深

在光学成像系统中，景深（Depth of Field, DoF）和焦深（Depth of Focus, DoF）是两个关键概念，它们分别描述了物体空间和图像空间中能够保持图像清晰度的范围。理解这两个概念对于优化成像系统的性能以及获得高质量的图像具有重要意义。

景深是指在物体空间中，沿光轴方向能够保持图像清晰度的最大距离范围。它反映了成像系统对轴向位置变化的敏感程度。具体来说，景深定义了在不显著降低图像清晰度的情况下，薄物体能够沿光轴移动的最大距离。景深的大小受多个因素影响，其中最重要的两个因素是物镜的数值孔径（NA）和成像介质的折射率。数值孔径越大，系统收集光线的能力越强，但对轴向位置的变化也更加敏感，从而导致景深减小。此外，介质的折射率通过影响光在介质中的传播速度，间接地影响景深的大小。在实际应用中，景深的计算通常基于特定的公式，例如公式(2.34)，而其具体数值通常为该公式计算结果的两倍，以确保评估的准确性和实用性。

与景深相对应的概念是 焦深，它描述的是在图像空间中与景深相对应的距离范围。焦深与景深之间存在一定的数学关系，即焦深等于景深乘以放大系数M的平方。这一关系表明，焦深的大小不仅取决于景深，还受到系统放大倍数的影响。在实际应用中，显微镜等成像系统通常采用较大的放大倍数以获得更精细的图像细节。例如，在放大100倍的情况下，焦深可能达到几毫米的量级。这一较大的焦深范围确保了即使在成像系统存在微小轴向偏差的情况下，仍能保持图像的清晰度和分辨率。

总的来说，景深和焦深是光学成像系统中不可忽视的重要参数。景深决定了物体空间中能够清晰成像的范围，而焦深则确保了图像空间中清晰度的稳定性。通过合理设计和调整光学系统的参数，如数值孔径、介质折射率和放大倍数，可以有效控制景深和焦深，从而满足不同应用场景下的成像需求。例如，在显微镜成像中，较大的焦深能够帮助研究人员在观察微小结构时保持图像的清晰度，而在摄影领域，控制景深则能够实现背景虚化或全景清晰的效果。因此，深入理解景深和焦深的概念及其影响因素，对于优化成像系统的性能具有重要意义。

2.3.7         超采样和欠采样

在探讨成像技术的广泛应用时，我们不可避免地会遇到对图像分辨率需求的多样性。在某些特定的成像场景下，追求远超最优放大系数（M_opt）的放大级别变得尤为关键，这一做法被业界称为“超采样”。超采样的核心目的并非直接挑战光学成像系统的固有分辨率极限，因为从物理原理上讲，光学成像无法揭示超出其光学分辨率的精细结构信息。然而，通过超采样技术，我们能够以极高的精度定位那些尺寸远小于分辨率极限的微小物体，如单个分子，这对于生物、材料科学等领域的研究具有重大意义。

为了实现这一目标，关键在于获取完整且高分辨率的点扩散函数（PSF）图像。在超分辨率成像的实践中，通常采用一种精细的采样策略，即在每个方向上使用3到7个像素对衍射极限信号进行详尽的采样。这种策略确保了即使在极端放大条件下，也能捕捉到足够的细节信息，为后续的数据处理和图像重建提供坚实的基础（详细技术细节可参见第8章和第12章）。

另一方面，成像技术的应用并非总是追求极致的分辨率。在某些实验或应用场景中，研究者可能仅需对特定视场内的物体进行计数或粗略的形态分析，如细胞数量的统计。在这种情况下，高分辨率成像不仅不是必需的，反而可能增加数据处理的复杂性和时间成本。此时，采用相对粗糙的成像策略，即所谓的“欠采样”，便成为了一种高效且实用的选择。欠采样通过减少图像中的像素数量或降低采样频率，实现了在保证基本信息不失真的前提下，大幅度提升成像速度和降低数据处理难度的目标。

2.4 孔径、瞳孔和远心

在深入探讨光学显微镜的高级特性时，我们不仅要关注其生成标本放大图像的基本能力，还需细致理解图像质量提升背后所涉及的光学原理与系统设计。显微镜，作为高度复杂的光学系统，其性能受限于多个关键因素，特别是光波在通过多个放大级和可能的中继级后如何精准地抵达图像平面。

首先，我们必须认识到透镜收集光量的物理限制，这主要由透镜的物理直径即“孔径”决定。这些孔径不仅影响着光波的通过量，还直接关系到成像的亮度和质量。值得注意的是，光圈的大小并不直接关联于镜头的焦距，后者更多地决定了成像的放大倍率。在简单的透镜系统中，边缘或安装位置定义了“入口孔径”，它初步限定了可进入成像系统的光量。而在更复杂的物镜系统中，通常由最小透镜的直径或附加的可调光圈挡板来精确控制光束的横向传播。

对于显微镜而言，入口瞳孔（从物体同轴点看到的孔径图像）和出口瞳孔（从图像同轴点看到的极限光圈）的位置至关重要。当光圈挡板位于物镜后焦平面时，这一结构具有显著优势：它使得入口瞳孔看似位于无限远处，从而确保主光线平行于物体空间的光轴，形成所谓的远心透镜效应。这种设计带来的核心优势在于，即便物体发生散焦，图像在像面上的模糊程度会增加，但放大倍率却能保持不变，这对于显微镜的稳定操作和精确测量至关重要。

在透射显微镜中，柯勒照明模式因其照明均匀性和可控性而广泛应用。此模式下，照明系统的入口瞳孔由聚光镜孔径实现，其位置恰好在聚光镜的前焦平面，该平面同时也包含了成像系统的出瞳。为确保最佳成像效果，这两个瞳孔的大小应保持一致，以充分利用照明光并减少光损失。此外，固定入口和出口瞳孔的位置（即无穷远或物镜后焦平面）在物镜切换时显得尤为重要，因为它避免了聚光镜的轴向重新定位，简化了操作流程。

特别在荧光显微镜等采用落射照明的装置中，照明光路与成像光路的瞳孔位置高度重合，均位于物镜后焦平面，这不仅简化了系统设计，还确保了光路的精确匹配和高效利用。这一设计也为多种透射光对比技术提供了便利，如将在后续章节中详细探讨的几种重要技术。

2.5  物镜

物镜，作为显微镜的核心与灵魂，其设计与制造融合了高度精密的光学与机械工程技术。一个优质的物镜通常由多达二十个精心挑选的单凸透镜和凹透镜组成，这些透镜各自拥有独特的曲率半径，旨在通过复杂的光学组合实现最佳成像性能。为了消除像差、确保图像质量，这些透镜的安装精度需达到极高的标准，这一要求在高端物镜中尤为严苛，而对于那些配备可移动透镜组及校正环的物镜而言，更是至关重要。因此，物镜的设计不仅是对光学原理的深刻理解与应用，更离不开精密机械技术的支持，二者相辅相成，共同铸就了显微镜成像的基石。

物镜的主要功能在于捕捉并汇聚来自被观察物体的光线，随后与显微镜的管透镜协同工作，共同形成清晰、准确的主实像。这一过程要求物镜不仅能够有效抑制各种像差，如球差、色差等，还需具备高分辨率，以呈现物体的细微结构与细节。此外，物镜还承担着调节显微镜放大倍率、塑造特定图像对比度的重任，是实现高质量显微观察不可或缺的关键部件。

随着科技的进步与应用的拓展，物镜的种类日益繁多，性能各异，以满足不同领域、不同样本的观测需求。从生物学的细胞观察到材料科学的微观结构分析，再到地质学的矿物鉴定，每一种物镜都承载着特定的使命与期望。因此，在选择物镜时，必须充分考虑样本的特性、观测目的以及显微镜的整体配置，以确保获得最为满意的成像效果。

2.5.1         物镜设计

物镜，作为显微镜成像质量的核心决定因素，其性能直接关联到观测结果的精确性与清晰度。然而，理想图像的形成并非无懈可击，它常受到单色像差与色差的双重挑战。单色像差源于大多数镜头采用的球面设计，而色差则根植于透明介质折射率随波长变化的物理特性中，难以彻底消除。像差的类型与程度深受物场尺寸、焦距、放大倍数、以及入射光束的宽度与倾斜度等因素的影响。

为应对这些自然产生的像差，光学工程师们巧妙地将具有不同色散特性、曲率半径、厚度及透镜元件间距的多种玻璃材料组合起来，构建出复杂的透镜系统。这一策略旨在通过精细的参数调整，最大限度地减少或消除各类像差。例如，轴向色差可通过结合两种不同色散特性的玻璃镜片来校正，尽管这种方法可能导致非选定颜色存在轻微偏差，即所谓的二次光谱。

物镜的设计过程既是一门科学，也是一门艺术，它要求设计者具备深厚的光学知识、敏锐的直觉与丰富的经验。设计的起点是明确物镜的各项关键性能指标，如放大倍率、视场数、数值孔径（NA）、工作波长区域、浸入介质、工作距离（WD）以及所需的像差校正水平。随后，设计者需参考既有设计或进行全新创作，精心布局每个透镜元件的位置、选择合适的折射率与材料，这一过程既充满创造力，也极具挑战性，往往耗时数周乃至数月。

为了精确评估与优化透镜系统的成像特性，计算机光线追踪技术成为现代光学设计不可或缺的工具。该技术通过模拟光线在透镜系统中的传播路径，能够直观展现成像过程中的像差表现。设计师需不断调整透镜参数或引入新元件，以逐步逼近理想成像状态。特别是对于显微镜物镜而言，球差与色差的校正至关重要，需严格控制在分辨率极限以内。

图2.18生动展示了五种不同63倍物镜的设计实例，从N-Achroplan到Alpha Plan-Apochromat，其像差校正水平逐步提升，体现了设计复杂度的增加与成像质量的显著改善。其中，C-Apochromat以其高NA值与卓越的成像性能脱颖而出，而Alpha Plan-Apochromat则通过牺牲部分成像质量，实现了NA值高达1.46的极端设计，专为全内反射荧光显微镜等高端应用量身定制。

为了定量评估与比较不同物镜的校正水平，均方根光路长度差（rms-OPD）作为一种通用且有效的测量方法被广泛采用。它通过对光线追踪结果进行统计分析，量化了透镜系统在不同波长下的残余像差，为物镜性能的客观评价提供了科学依据。图2.18b的rms-OPD曲线清晰展示了各透镜系统从近紫外到近红外光谱范围内的校正效果，进一步验证了设计优化的必要性与重要性。

最终，值得注意的是，尽管所有物镜设计均力求完美，但实际应用中仍需考虑残余像差与衍射极限之间的平衡。在视觉观测领域，当像差影响低于衍射极限时，其影响可视为可忽略不计；然而，在超分辨率显微镜等高精度成像任务中，任何微小的像差都可能成为决定性因素。因此，对物镜进行细致的测试与比较，确保其满足特定成像需求，是确保观测结果准确可靠的关键所在。

2.5.2         Light Collection Efficiency and Image Brightness

我们在前面已经看到，由于物镜的开口角度有限，任何物镜都只能捕捉到物体发射或衍射的部分基本波。这就导致光学系统的分辨率有限。此外，它还限制了物镜的集光效率，而集光效率当然是每台显微镜的核心特征。最终，它决定了最终图像的亮度。令人惊讶的是，众所周知，图像亮度与物镜的 NA 值有关，即与物镜开角 𝛼 的正弦值有关，而与物镜的开实角无关。这是第一个直观的猜测。那么，这是真的吗？仔细研究这个问题就会发现其中的原因，同时也会引出显微镜中的一个重要概念，即所谓的正弦条件。首先，我们考虑一个向周围空间发光的点状物体。如图 2.19a 所示，透镜收集到的光通量与填充透镜开口的球面段表面成正比，或者用数学术语来说，与开口实角成正比。考虑到围绕光轴的旋转对称性（可用角度 𝜑 标记），我们可以通过对所有表面元素 dS = d𝜙 sin d𝜃 进行积分，计算出表面段的总实体角，计算公式为

可以直接进行积分，因为点物体的光线垂直落在所有表面元素上，而与它们在空间中的位置无关，这就是角度 𝜑 和 𝜃 的特点。因此，物镜在检查点物体时的集光效率与镜头开角的正弦和 NA 值无关，而是由公式 (2.41) 得出。但是，在拍摄二维扩展发光物体时，情况就不同了。现在我们必须确定由表面元素 dA 发出并被透镜收集的光量。这样的发光表面被称为朗伯辐射体。然而，在不同的角度 𝜃 下，dA 的有效可见表面是不同的（图 2.19b）。随着角度 𝜃 的增大，有效可视面会变小，直到假设 𝜃 = 90∘ 时为 0。从数学角度讲，我们现在必须考虑标量乘积 -→ dA -→ dS。这会增加一个 cos 𝜃 的因子。如果我们考虑到这一点，并对球面段的总表面进行积分，就会发现

我们注意到，收集到的光通量与发射面元件的尺寸 dA 和物镜开口角正弦的平方有关。这个表达式适用于空气浸入式物镜。如果透镜前方是折射率较高的材料，如水或油，则必须使用适当的浸入式透镜。这种情况如图 2.20 所示。

我们可以看到，在折射率为 n 的材料中，以最大角度 𝛼 进入透镜的光通量与在空气中工作时被角度 𝛼 包围的光通量相同。根据折射定律，sin 𝛼 = n sin 𝛼。然而，光通量不会发生变化。因此，在使用光学密度较高的材料时，我们必须用开口角的正弦乘以折射率，才能得到所收集光通量的正确表达式：

因此，我们可以看到，如果成像的是平面二维试样，物镜收集到的光量与其 NA 的平方成正比。当然，这在显微镜下是最常见的情况。

作为开口角 𝛼 和 NA 的函数。在这两种情况下，使用高 NA 镜头的重要性显而易见，尤其是在对点状物体成像时。收集到的光线通过物镜的出瞳后投射到像面上。图像亮度与放大倍率有何关系？当考虑二维自发光物体的图像时，这一点就变得很明显了：放大倍率的增加会放大图像，但由于图像的总综合光度保持不变，其光密度的降低与放大倍率的平方成正比。综合前面的考虑，我们发现图像亮度 B 与 NA 的平方成正比，与放大倍率的平方成反比：

显然，这些考虑忽略了组成物镜的透镜的吸收和反射效应，或特殊透镜的特性，例如相衬物镜中的吸收环。因此，具有相同放大倍率和 NA 的物镜所产生的图像亮度值可能大相径庭。最后需要指出的是，NA 在荧光显微镜中的影响更为显著。在这种情况下，照明是通过物镜实现的，这就在样品平面的辐照度中引入了更多的 NA2 因子。因此，最终图像的亮度与所使用的 NA 值有关。不过，在荧光成像中，亮度与放大倍率的关系消失了，因为放大倍率对照明和成像的影响相互抵消。

2.5.3         Objective Lens Classes

我们已经看到，物镜的一个非常重要的特征是其像差校正程度。在单色像差中，有两种像差，即球差和彗差，在现代物镜中具有衍射限制校正功能，这意味着这些像差低于所有类型物镜的可见度阈值。景差和色差仍然是最重要的像差，物镜根据这些像差的校正程度进行分类。物镜类别名称的第一部分指的是景物曲率的校正程度，第二部分指的是色差的校正程度。对于景物曲率和畸变特别小的镜头等级，会加上一个 "平面 "名称。这类物镜的像场大，图像校正效果好。横向和纵向色差对获得良好的明视野对比度尤为重要，因为当这些色差存在时，物体成像会出现彩色条纹。关于色差校正，显微镜物镜可分为消色差、半消色差或萤石色差和变色差。这些规格都刻在物镜镜筒上。只有消色差物镜通常不标消色差。遗憾的是，每个制造商都以不同的方式标示其物镜，因此很难进行区分和比较。尽管如此，物镜的名称还是表明了其校正程度。除了校正等级外，物镜上还刻有其他重要参数的色标或缩写（表 2.1）。这些参数表示放大倍数、浸入介质和特殊成像应用的适用性。此外，一个或有时两个色环表示可达到的放大倍率和所需的浸入介质（表 2.2 和 2.3）。

2.5.4         Immersion Media

物镜可以在空气中使用，也可以与油或水等特殊浸泡介质结合使用。空气物镜也被称为干镜片。它们通常与盖玻片或无盖玻片一起使用，但 0.25 的 NA 值是其普遍使用的上限阈值。对于 NA 低于 0.4 的物镜，偏离 0.17 毫米的标准盖玻片厚度并不重要。空气物镜的最大 NA 值为 0.95，对应的孔径角为 ∼72∘。这种物镜很难使用，因为大孔径角会导致自由 WD 非常短，最短可达 100 μm。设计与遮光眼镜一起使用的空气物镜在操作上更为关键。许多物镜设计用于在盖玻片和物镜前透镜之间使用比空气折射率更高的介质。通常使用的介质包括浸油、甘油或水。这样可以提高 NA 值，从而提高亮度和分辨率。均匀浸入是有益的，即安装介质、盖板玻璃和浸入液的折射率，以及--理想情况下--物镜前光学元件的折射率尽可能匹配。这有利于在这些界面上避免球差和色差。这种物镜的构造更为简单，因为所有介质都可以看作是前透镜元件的延伸。同时，界面上的反射也会减少，从而提高图像对比度。这意味着要使用折射率接近玻璃的浸油，使用玻璃盖玻片，并将试样安装在折射率与玻璃和油相匹配的树脂中。使用高 NA 油浸物镜成像尤为关键，需要经验和预防措施。首先，盖板玻璃和油的折射率并不完全匹配。物镜针对标准盖板玻璃厚度进行了优化。不过，也有厚度在 120 到 200 μm 之间的盖玻片。最常见的是 170 μm。即使是同一批产品，厚度也可能相差很大。在 NA > 1.3 的情况下，实际厚度与物镜上指示值的偏差不应超过 ±5 μm，否则会产生像差。此外，浸入式物镜的设计使用温度为 23 ∘C。偏离这一温度会导致物镜中的透镜排列发生微小的热移动，从而影响图像质量。有些物镜带有机械校正环，可以调整系统中几个透镜的内部位置，以校正不同的温度或盖板玻璃厚度。为了将物镜和试样的升温降到最低，应使用中性密度滤光片或减小灯电流，尽可能降低照明光的强度。在没有校正环的情况下，可以通过使用特定的浸油来补偿物镜内部的温度影响。对水溶液中的试样进行显微分析有多种选择。所谓的浸水物镜是专为在水介质中直接使用而设计的，用于从上方观察活的生物标本。不过，显微镜的一个重要且非常广泛的应用是使用倒置显微镜对活细胞样本进行成像。显然，这需要使用安装在显微镜台上的盖玻片，并将标本和浸泡液分开。在这种情况下，前透镜和标本之间的不均匀光学系统是不可避免的。强烈建议使用专用的水浸透镜头，它能从试样深处的平面提供非常好的图像。对于这些物镜，盖板玻璃-水界面上不可避免的显著球差会通过物镜的固有设计进行校正。对于水浸式物镜，应使用蒸馏水或至少是去矿物质水，因为要清除物镜前透镜上干涸的水中的沉淀物非常麻烦。如果没有专用的高质量水浸物镜，通常会使用油浸透镜。对于非常靠近盖玻片/缓冲器界面的薄物体，这种方法的效果出奇地好。但是，当使用油浸物镜聚焦更深的水装试样时，图像质量会迅速下降。图 2.22 展示了 PSF 在这种情况下的衰减情况。

2.5.5         Special Applications

物镜的 WD 是指当物镜另一侧的试样对焦时，物镜前座与盖玻片最近表面之间的距离。如果不使用盖玻片，则 WD 是到试样本身的距离。只要保持浸入条件，这也相当于可以清晰成像的试样内部深度。对于高分辨率物镜，WD 很短，因为 NA 和开口角必须尽可能高。对于放大倍率为 100 倍、NA 值为 1.4 的高倍物镜，WD 短于 200 μm，而对于 NA 值为 0.2 的 10 倍物镜，WD 长达 6 mm。对于高倍率物镜，前端部分通常采用弹簧安装，以便在撞击试样时滑入物镜筒，从而避免损坏前透镜和试样。在某些应用中，例如在显微镜观察过程中通过显微注射活细胞等方式对标本进行操作时，需要使用很长的 WD。这些物镜被称为长距离物镜或 LD 物镜。尽管难以实现大 NA 值和良好的校正度，但还是开发出了用于此类目的的专用物镜。由于这类物镜通常带有校正环，因此价格相对较高。

除了实现纯放大之外，物镜还必须具备特定对比技术的某些特征。用于荧光显微镜的物镜必须具有较低的本征自发荧光、较低的本征反射率和较高的近紫外透光率。这些特性取决于所使用的玻璃类型和镜片表面的镀膜工艺。不过，当今物镜的透射系数在 90% 到至少 360 纳米之间。在这一波长以下具有高透光率的物镜通常都有专门的标签，适用于紫外光工作。采用特定对比技术的物镜是专门为此任务而设计的。通常这需要高度改进的光学特性。下文将对此进行讨论。

2.6  Contrast

光具有不同的特性--相位、偏振、波长（或颜色）和强度（或亮度）。光束路径中的物体通常会改变其中的一个或多个属性。人眼和电子光探测器只对波长和强度敏感。因此，我们只能直接探测到改变其中一个或两个属性的物体。这种物体被称为振幅物体，因为它们会改变穿过它们的光波的振幅。如果振幅的变化与波长有关，那么相应的物体就会呈现彩色。只改变光波相位的物体--可能以偏振相关的方式--被称为相位物体。典型的例子是由玻璃或晶体制成的透明物体。由于与周围介质的折射率不同，这些物体会对穿过的光波产生相位延迟。此外，生物物体（如薄层细胞或组织）会影响相位，但对穿越光波的振幅影响较小。对于检测设备来说，相位清晰并放大的物体并不一定是可见的。要使物体可见，其颜色或光强必须与周围环境有足够的差异。换句话说，物体与背景之间的对比度必须能够被探测到。对比度 C 在这里指的是物体与背景在强度或波长上的差异程度。对于光强度 I，有几种可能的定义，其中之一是 Iobj 和 Isur 分别表示物体和周围环境的强度。对于电子光探测设备来说，可探测的对比度取决于总体信噪比和测量信号时使用的离散化步数，这与探测设备的位深度相对应。下一章将详细讨论这些问题。对于人类在明亮光线下的感知而言，强度对比度可能只有 0.02，但在光线不足的情况下，感知物体所需的对比度为 0.05。对于非常小的物体，则需要达到 0.2。物体与其背景之间的对比度差异对于看到精细的细节至关重要，为了清晰地感知物体，对比度应尽可能大。在显微镜的发展史上，为了使相位物体清晰可见，人们开发了许多不同的技术，这些技术被称为光学对比方法。显然，这些技术在生物物体的显微镜观察中发挥着重要作用。原则上，有两种不同类型的对比技术：化学方法和物理方法。化学技术通过用染料对物体结构进行选择性标记来引入颜色对比。在现代显微技术中，主要使用荧光染料，这也是第 3 章和第 4 章的重点。物理技术将最初难以察觉的相位对比转化为振幅对比。目前，生物医学应用中最重要的光学对比技术是相位对比和暗场对比。暗场对比是物理对比技术的一个便捷途径。

2.6.1         Dark Field

最简单的物理对比技术是暗场对比，也称为暗场照明。其原理是通过一个特殊的照明系统，只保留物体衍射光，消除所有直接照射光。这可以通过从侧面照射试样轻松实现 [11]。另外，在透射光暗场中从下方照亮试样时，入射辐射的倾斜度可以选择得很高，这样物镜就不会捕捉到直射光。为此，入射光线相对于光轴的角度必须超过物镜的最大孔径角。如图 2.23 所示，只有试样的散射光进入物镜，形成高对比度的图像。物体背景完全变暗，只有散射光的物体结构才显得明亮。使用 NA ≤ 0.4 的低倍物镜时，只需在聚光器前焦平面插入一个适当大小的环形掩膜，即可轻松实现暗场照明。为此，甚至可以使用相位对比聚光器：如后面所讨论的，相位对比聚光器的前焦平面包含一个环形孔。照明光的中心部分被一个圆形、轴向居中的掩膜挡住（图 2.23a）。其优点是光罩位于聚光器的正确前焦面，并可通过调节螺钉进行轴向定心。但缺点是聚光器透镜表面的反射会减弱暗场效果。当需要使用较高 NA 值的物镜时，必须使用反射型专用暗场聚光器（图 2.23b）。这种聚光器还有其他优点。与环形聚光器相比，它们能产生更高的辐照度，并能使不同颜色产生相同的倾角，从而产生更清晰的暗场照明锥。在物镜光轴上准确定位这些暗场聚光器非常重要。使用心形聚光器时，应在物镜载玻片和聚光器表面之间添加浸泡液，以避免物镜载玻片发生折射，从而降低有效倾角。聚光器使用高 NA 值（例如 NA 1.4）尤其有利，因为在使用空气物镜观察时，照明光会在盖玻片的上表面完全反射。在这种情况下，照明光的消除特别彻底。使用可通过内部光圈光阑调节 NA 值的物镜是非常实用的，因为其有效 NA 值可以调节，直到形成完全黑暗的背景。原则上，也可以通过阻挡物镜后焦平面的照明光来获得暗场效果。不过，这意味着会损失相当数量的衍射光，因此需要使用特定的物镜进行暗场观测。

2.6.2         Phase Contrast

相位对比和后面描述的一些干涉对比方法的原理是将物体衍射的光与未被物体改变的光，即背景光或未衍射光分离开来。这两种光分量的振幅和相位会发生改变，最终在两种光分量之间产生建设性或相消干涉，从而形成振幅对比。弗里茨-泽尔尼克于 1932 年提出了一种多用途的实用显微技术，用于观察在明场显微镜下几乎看不到的相位物体[12]。他进行了一系列实验，优雅地说明了他的对比技术的原理，同时也说明了显微镜中图像形成的波理论。他的实验非常具有启发性，因此我们将详细介绍他的论点。

2.6.2.1     Frits Zernike's Experiments

我们首先利用明视野照明来观察一个小振幅物体。在聚光器光圈大开的情况下，图像平面上可以看到明亮地面上的一个暗点，这就是小振幅物体的标准明场图像。接下来，我们将聚光器光圈关闭到一个小光斑上，从而用点光源照射样品。同时，我们在物镜的后焦平面上放置一个小的遮光罩（图 2.24c）。会发生什么？聚光透镜将来自其前焦平面点光源的光转换为平面波。这些平面波遇到试样后，部分通过试样而不发生衍射，部分发生衍射。未衍射光再次被物镜聚焦到其后焦平面，后焦平面与聚光镜的前焦平面共轭。在这里，它被上述遮光板阻挡。它的形状与聚光器前焦面的遮罩互补，可选择性地阻止未衍射的背景光通过物镜的后焦面。阻挡物体通过的未衍射光会导致图像平面的背景变暗。但是，衍射光不会在物镜后焦面聚焦，因为它不是平面波，而是本章第 2.3 节所述的物体空间中的发散球面波。因此，它在后焦平面不会被掩膜阻挡。它通过后焦面后被管透镜聚焦到主像面上，在暗背景上形成一个亮点。实际上，这种在共轭平面上使用两个互补掩膜的结构代表了一种特殊的暗平面光场照明，第 2.6.1 节对此进行了讨论。图 2.24 显示了两组不同的共轭平面：聚光器前焦面和物镜后焦面，以及物平面和像平面。在第一个实验中，未衍射光和衍射光都会到达像平面，并产生暗物像。当我们遮挡物镜后焦平面上的背景光时，图像仅由衍射光形成，我们看到的是一个亮点。这两种截然不同的成像模式的物理解释是，与未衍射光相比，衍射光的相位偏移了 180∘。在第一个实验中，图像是物体衍射光波和未衍射光波相消干涉的结果。在第二个实验中，图像仅是物体衍射光波的结果。不可能发生相消干涉（图 2.25）。在第三个实验中，我们对一个小的相位物体成像。在物镜载玻片上放置一个小的透明粟米，打开聚光器光圈，从物镜后焦平面移除掩膜，从而回到明场显微镜。现在我们看到的是明亮的背景视场，实际上没有物体，因为它是透明的。接下来，我们再次关闭聚光器光圈，将互补掩膜放回物镜的后焦平面。同样，由于未衍射的照明光被遮挡，我们看到的是一个暗背景，而物体则是一个亮点。显然，透明物体的衍射光确实与振幅物体类似，但其相位显然没有偏移 180∘。否则，在亮场中就会看到亮背景上的暗物体图像。Zernike 假设相位物体的衍射光仅偏移约 90∘。振幅较小的光波在与背景波干涉时相位偏移 90∘，产生的波与未衍射波相比，振幅和相位几乎没有变化。图 2.25 的最后一列展示了这一点。它显示了所有实验中不同波成分的振幅和相位关系。沿 x 方向的蓝色箭头表示未衍射波的振幅和相位。衍射波的振幅和相位用红色箭头表示。例如，在第一个实验中，由于相对于未衍射波的相位偏移了 180∘，箭头指向-x 方向。这个箭头也比较短，因为衍射波的振幅小于参考波的振幅。黑色箭头表示在光斑图像位置处衍射波与未衍射波的和波的振幅和相位。

它由前两个箭头的矢量加法得到。这种图称为相量图。在每个实验中，可以通过比较蓝色箭头和黑色箭头的长度来评估产生的对比度。在第一个实验中，这两个箭头的长度相差很大，而在第二个实验中，由于物镜后焦平面的阻挡，图像平面上没有未衍射波。在第三个实验中，振幅的微小变化只能产生很小的对比度。因此，在背景上无法感知透明物体。为了验证 Zernike 的假设，我们进行了最后一个实验，以进一步证明相位对比成像的原理。我们在物镜的后焦平面插入一个特殊的掩膜。该掩膜由一个光吸收中心组成，可将未衍射背景光的振幅减小到几乎与衍射光的振幅相同。该中心周围有一个相位板，可为衍射波增加 90∘的相位延迟。对之前实验的这一修改在图像平面的灰色背景上产生了一个暗点。这一结果验证了 Zernike 的假设。灰色背景是由于背景光振幅减小所致。穿过物镜后焦平面外部区域的物体衍射波的相位延迟增加了 90∘，因此与背景光相比，总相位延迟为 180∘。此时，衍射光在像平面上与暗淡的未衍射光发生相消干涉，在灰色背景上形成相位物体的暗像。减小未衍射光振幅的窍门可以获得高图像对比度。总之，可观察到的图像对比度取决于物体的物理特性、照明模式，以及对背景光和衍射光的选择性操作。这两种光成分在空间上相互分离，因此在物镜的后焦平面上可独立获取。

2.6.2.2     Setup of a Phase-Contrast Microscope

上述实验中用于物体照明的针孔现在由环形掩膜取代。通过这一改动，更多的照明光到达物体，从而获得更明亮的相位对比图像。与此同时，聚光器的有效 NA 也增大了，从而提高了光学分辨率。当然，物镜后焦平面的遮光罩必须由适当的互补环形遮光罩取代。这种环形掩膜带有吸收层，厚度与掩膜的其他部分不同。它被称为相位环。来自聚光器前焦面的未衍射照明光会通过此环。来自试样的衍射光将穿过掩膜的中央和外部区域，掩膜比吸收环厚，或在所谓的负相位对比中比吸收环薄，从而达到所需的约 180∘ 的总相位差。掩膜产生的确切相位延迟取决于照明光的波长。因此，掩膜只对一种特定波长产生 90∘的相位延迟。通常设计为 550 纳米或绿色--人眼最敏感的颜色。可以在照明光束路径中插入彩色滤光片，以便只选择这一波长的照明光进行成像。物镜后焦平面的照明环成像必须与吸收环完全匹配。因此，对于不同倍率和 NA 的物镜，必须使用不同直径和宽度的照明环。照明环位于聚光器前焦面的旋转转盘上。转盘上的一个位置是开放的，用于正常明视野照明。物镜后焦平面上的照明环图像和相位环的重合度可以用一个特殊的辅助显微镜来检查和调整，该显微镜可以代替目镜插入。辅助显微镜由两个镜头组成，可以直接观察后焦面。贝特朗 "透镜是辅助显微镜的另一种选择，它可以切换到光束路径上，将后焦平面的图像投射到主像面上，因此可以使用现有的目镜观察后焦平面。如果两个环形结构不完全匹配，可通过两个螺钉调整聚光器转盘上照明环的横向位置。物镜的后焦平面位于物镜外壳内。因此，用于相位对比成像的物镜是特定产品。显然，在普通明视野模式下使用时，吸收相位环也会降低图像亮度。相位对比物镜在荧光显微镜等落射照明技术中尤其不利。

2.6.2.3     Properties of Phase-Contrast Images

相位对比图像并不是简单地显示物体的放大图像。产生对比度的原因是对未衍射光和衍射光的相位进行了特殊处理。因此，对它的解释并不简单。从图 2.25（实验 5）中的相位图可以看出，在明亮的背景上看到的相位物体是暗的。但是，如果物体造成的相位延迟过大，例如超过 45∘（除了固有的 90∘），对比度就会再次降低，当接近 90∘时，对比度几乎消失。这样就恢复了明视场观测相位物体的相位关系。因此，相位对比只适用于相位延迟相对较小的薄物体，最高可达 ∼30∘。细胞单层或组织切片等薄型生物标本就属于这种情况。如果由于相移太小或已经太大，相位物体只能产生很小的对比度，则可以通过改变安装介质的折射率来改善。相移与物体的路径长度以及物体和安装介质的折射率之差成正比。因此，可以通过选择合适的安装介质来改变相移。相位对比的产生是基于这样一个事实，即直接照射光和衍射光在物镜后焦平面上是相互分离的。然而，由于相位环的宽度有限，这种分离并不完全。从粗糙的试样特征衍射出的光可能衍射不够强烈，无法从相位环外通过，而是会穿过相位环。同样，精细试样特征衍射的部分光线也会穿过相位环。这些影响的结果是，看起来很暗的物体周围会出现明亮的光晕，从而使物体边界的识别变得困难。

2.6.3         Interference Contrast

解决相位物体问题的方法是将物体与其周围环境之间的相位差转化为振幅差。为此，需要改变衍射波的相位，使衍射波和未衍射波在图像平面上发生相消干涉。泽尔尼克通过操纵物镜后焦平面上空间上分离的两个波分量实现了这一目的。还有更多的技术可以有效地达到同样的目的。实际上，一些所谓的干涉对比技术甚至比相位对比技术更灵活。干涉对比的主要原理如图 2.26 所示：在遇到物体之前，照明光被分光器分离成两束相干的波列。其中一束穿过装有物体的试样室。第二波--参考波--沿着相同的光路传播，但没有物体。此外，还可以通过插入一个玻璃楔，在参考光束路径中引入一个确定的相位延迟。在通过试样和参考室后，两个波列重新组合，并通过图像平面上的干涉形成图像。这种装置使显微镜专家能够实现与 Zernike 的相位对比装置[13]相同或更多的功能。可以对物体衍射光和主要未衍射光的振幅和相位进行操作。最终图像由三种不同波形的干涉产生：物体衍射波、通过物体腔室的未衍射光以及未衍射参考波。参考波的相位可通过玻璃楔以确定的方式延迟。因此，未衍射波的相位可以相对于物体衍射波进行偏移，这样，无论物体的实际相位偏移有多大，它们的最终总相位差都是 180∘。为了了解如何做到这一点，我们首先考虑试样室中没有物体时的情况。首先，我们将玻璃楔完全移出光束路径（图 2.27a）。由于两束光的光路完全相同，因此两束波前会同时到达图像平面上的每一点，并发生相长干涉。这将产生均匀、明亮的背景。接下来，我们将玻璃楔块移入参考光束路径，并与通过试样室的波形成 180∘的相位延迟（图 2.27b）。现在，两个未衍射波在图像平面的任何地方都会发生相消干涉，导致背景完全变暗。也可以调整参考相位延迟，使图像平面上的两波之和与来自试样室的未衍射波相比，实际相位延迟为 270∘（图 2.27c）。当我们最终在试样室中添加一个物体时，未衍射参考波和试样室波的相位保持不变。然而，物体衍射波的相位却出现了通常的 90 ∘ 相位延迟。相位图显示，未衍射背景波与物体衍射波之和的相位差现在为 180∘（图 2.27d）。未衍射的背景光和衍射光会发生相消干涉，从而产生明显的相位对比。我们会在明亮的背景上看到一个黑暗的物体。此外，由于我们可以任意选择背景和波与物体波的相位，我们可以将对比度从负值变为正 值，或者调整相位差，使衍射波相位偏移大于或小于 90∘的物体也能得到 180∘的相位差。两个未衍射波的物理分离允许自由定义它们与物体波相位的和波相位。此外，通过在背景波中引入已知的相移，甚至可以测量物体产生的相位延迟，从而获得其折射率的信息，或（如果已知）其物理厚度的信息。不过，这种多功能性也是有代价的。干涉显微镜需要非常特殊的光学装置。必须有特殊的元件来分离试样室和参考光束，使它们重新结合，并调整它们之间确定的相位延迟。这就需要非常精确地匹配试样和参考光束的光路长度，而要做到这一点并非易事。不过，我们在此不会重点讨论干涉显微镜的光学设置，因为它实际上是另一种相关技术，也是当今医学和生物样本观察中最重要的技术。

2.6.4         Advanced Topic: Differential Interference Contrast

DIC 显微镜是一种非常强大的增强相位物体对比度的方法。DIC 可用于透射光或反射光。对于生物医学应用而言，外发光 DIC 并不重要。透射 DIC 的工作原理和实现方式可以通过 DIC 显微镜的光学设置来了解 [14]。要理解这一点，需要详细了解光的波特性，如干涉、相干和偏振，以及偏振器和分析器的功能。

2.6.4.1     Optical Setup of a DIC Microscope

DIC 显微镜的光学装置是利用聚光器前焦面和物镜后焦面光学共轭的又一实例。光束路径相对复杂（图 2.28）。在照明场挡和聚光器之间有一个偏振器。假设它产生的光的偏振方向为 45∘（图 2.28b）。这束光会遇到聚光器前焦面的沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜是一种光学设备，它能将偏振光的垂直偏振分量和平行偏振分量分成发散角度很小的两个不同的波。我们称这两个相干波为垂直和平行偏振波（图 2.28a,c）。在物体空间中，由于棱镜位于聚光器的前焦平面，两个不同偏振的波阵面平行移动，但两个波阵面之间有微小的横向偏移（图 2.28b）。偏移或剪切是由沃拉斯顿棱镜的结构决定的，并选择小于所使用物镜的光学分辨率。两个空间偏移或剪切光束通过物镜后焦平面上的第二个沃拉斯顿棱镜重新组合。这个沃拉斯顿棱镜可以调整其横向位置，以便在两束偏振相互垂直的光束之间引入额外的相位延迟 Δ。棱镜的横向移动会改变两束光在沃拉斯顿棱镜内的光路长度。在第二个沃拉斯顿棱镜后面放置了一个分析器。它只传输重组光束中选定的偏振分量。总之，图像是由四种不同波段的相互作用产生的，即两个不同偏振方向的位移波前的衍射波和未衍射波。对比度的产生取决于两个分裂波阵面之间的 OPD。由于有多个参数会改变这些参数，其中包括照明光的偏振、第二个沃拉斯顿棱镜的横向位置（它决定了两个偏振方向之间的相位延迟 Δ）、分析仪的设置以及样品本身的特性，因此对比度的产生过程相对复杂。图 2.29 举例说明了对比度的产生过程。该图也与图 2.28 直接相关。图 2.29 的上部显示了以细胞核为例的试样室。两条剪切垂直线（虚线和满线）表示两个横向偏移、垂直偏振的波列穿过该腔室。为了了解对比度的产生，我们对样品中四个不同位置的波分量进行了评估（图 2.29a-d）。图 2.29 中下部显示了在相移 Δ 的两个不同值（0∘ 和 30∘）下，图像中四个不同位置的和波的偏振状态。我们从图 2.29a-d 开始，假设第二个沃拉斯顿棱镜上方的分析器与第一个沃拉斯顿棱镜前的偏振器交叉（如图 2.28 所示）。在背景位置，没有来自物体的衍射波（图 2.29a）。因此，在图像中，如果调整第二个沃拉斯顿棱镜，使两个偏振方向的未衍射背景波的光路长度相同，则物体周围的背景是暗的。对于 Δ = 0∘，就是这种情况。图 2.29 中部面板显示了 Δ 值的偏振情况。两个偏移背景波的偏振和相位在此采样点没有改变。因此，背景光完全被分析仪阻挡，因为它与偏振器交叉。图 2.29 中部和下部的灰色对角线表示分析仪的方向。上部沃拉斯顿棱镜的横向移动会导致两个偏振方向之间的相位偏移，从而使组合背景波产生椭圆偏振。

图中下部显示的是 Δ = 30∘ 时的椭圆偏振示例。分析仪只允许沿其方向的偏振分量通过。图 2.29 中下部对角线方向的黑色粗线表示了该分量的大小。因此，我们可以通过移动物镜后焦平面上的沃拉斯顿棱镜来改变背景光的偏振状态。让我们将其移回到 Δ = 0∘。当平行偏振光束遇到相位物体的边缘（即细胞核），而垂直偏振光束没有遇到相位物体的边缘时，会发生什么情况（图 2.29b）？平行偏振的波会发生衍射。光被相位物体衍射，这意味着相对于未衍射的波，它获得了 90∘的固有相移，外加一个小的额外相位延迟𝜑1，这是由于细胞核的光密度较高而造成的光路长度差异。举例来说，我们假设𝜑1 = 22∘，但它可以是任何值。现在的关键是，衍射波分量的相移（90∘ + 22∘）改变了与分析仪相接的和波的极化。它不再像没有物体的试样区域那样完全线性偏振，而是椭圆偏振。这样做的一个重要结果是，总波通过分析仪时的振幅不再为零，从而在图像的这个位置产生了一些光。相位差转化为可见的亮度差。在垂直偏振的剪切光束遇到同一物体特征（原子核）的区域，会产生第二个垂直偏振的物 体衍射波，其相位延迟为 90∘ + 𝜑2 ≈ 90∘ + 𝜑1。相移为零的平行地垂直偏振波共同形成一个线性偏振波，该波被分析仪完全阻挡，导致该 图像位置的强度为零。因此，在物体的边缘刚刚形成对比。在原子核的另一侧（图 2.29d），只有垂直极化波与物体发生作用，而平行极化光束通过时已经没有衍射。因此，同样会产生一定的椭圆度，分析仪会让一些光通过相应的像点。总之，DIC 图像的最终对比度是由沿物体空间某一方向横向略微偏移位置的 OPD 决定的。因此，它被命名为 "差分"。发生路径长度差的方向由第一个沃拉斯顿棱镜的方向决定。相邻物体位置的光路长度差异会产生明显的对比度。更重要的是，可以通过选择 Δ 来调整对比度，从而使物体的一个边缘产生正对比度，而另一个边缘产生负对比度。图 2.29 的下部显示了垂直极化波相移 30∘后产生的椭圆极化。此时，原子核的左边界比背景、核内部，尤其是原子核的对边界更亮。这样，就形成了一个三维物体的视觉印象，它从一侧发光，在另一侧投下阴影。这种不对称对比是 DIC 的典型特征。DIC 是一项复杂的技术，实现起来并不容易。第二个沃拉斯顿棱镜必须位于物镜的后焦平面。由于其厚度相当大，因此需要特殊的物镜。由于棱镜安装在物镜中，因此不适合用于其他任务。为了克服这一问题，我们引入了特殊结构的棱镜，将光束重组平面置于棱镜本身之外 [15]。因此，这些所谓的 Nomarski 棱镜可以位于焦平面之上，这一点很容易做到。此外，这些棱镜还可以拆卸。这种对经典 DIC 的改进被称为 Nomarski DIC，它已成为生物科学领域最广泛的干涉对比技术之一。

2.6.4.2     Interpretation of DIC Images

DIC 的强度取决于两束光之间的横向剪切力、棱镜、偏振镜和分析器各自的方向以及样品特征。DIC 的优点是对比度产生的方式和图像外观可以广泛调整。不过，这也会导致图像解读的模糊性。DIC 的主要特点是其出色的边缘对比度。这就导致该效果具有很强的深度依赖性。DIC 对试样的轴向移动非常敏感，因此可以获得非常薄的光学切片。它非常适合厚试样。相位物体所显示的明显浮雕结构是该技术的副作用。一个边缘可能很亮，而另一个边缘可能很暗。物体似乎从一侧发光，而在另一侧投下阴影。这样，图像就呈现出 3D 效果。然而，所有的对比效果都仅仅是由于光路长度的差异造成的。它们可能与物体的拓扑结构有关，但也可能是折射率差异造成的，而真正的物体厚度是不变的。真实的试样拓扑结构并没有可视化。此外，圆形物体的图像不是旋转对称的，因为我们只能看到沿光束剪切方向的 OPD。使用旋转平台有助于了解物体的完整结构。值得注意的是，明暗对比也有可能转化为色彩对比，这使得解释 DIC 图像变得更加困难。

2.6.4.3     Comparison between DIC and Phase Contrast

相位对比和透射 DIC 的应用相互重叠。这两种技术都能将物体衍射光之间或穿过物体不同区域的光之间的相位差转换为可感知的强度变化。不过，这两种技术之间也有一些重要的区别。在相位对比中，物体是以旋转对称的方式成像的。DIC 显示的光路长度梯度仅沿一个空间方向发生。DIC 图像显示典型的三维表面阴影外观，这是产生对比度的伪影。与相位对比图像相比，DIC 图像具有更高的分辨率，这主要是因为 DIC 图像不会显示与周围环境相位差较大的环绕物体特征的光晕。在 DIC 图像中，小物体的对比度非常明显，薄物体和厚物体的对比度也很高。重要的是，DIC 具有出色的轴向分辨率。焦平面以外平面上的物体特征不会出现在图像中，因此可以进行光学切片。这与相位对比形成鲜明对比，后者对厚物体效果不佳。相位对比对非常薄的物体效果最好。景深非常大，焦平面以外平面上的物体特征很容易受到干扰。如果路径差过大，尤其是超过 30∘（良好相位对比的上限）时，就会出现问题。总之，与相衬法相比，DIC 技术要求更高，但应用范围更广。

2.7  Summary

本章要点如下：

• 显微镜的基本成像元件是物镜和管镜。通常，它们构成一个无穷远校正装置。
• 放大步骤可以按顺序排列。
• 显微镜包含两个互补的光束路径，即照明路径和成像光束路径。每种光束路径都由特定的组件和不同的共轭平面组成。
• 柯勒照明提供均匀的照明，将照明场与照明孔径分开，并在聚光器和物镜的前焦平面上形成共轭光学平面。
• 物镜的后焦平面包含物体的衍射图样。它对应于物体函数的截断傅立叶变换。
• 图像是物体和 PSF 的卷积。- 透镜是物体结构的低通滤波器。
• 横向光学分辨率由瑞利准则 0.61𝜆∕n sin 𝛼给出。- 相干和非相干物体具有不同的分辨率限制。
• 最佳放大倍率是探测器尺寸与光学分辨率之比 的两倍。
• 物镜应该是远心的。
• 物镜的类型和校正水平各不相同。它们总是会出现残余像差。
• 图像亮度通常与 NA 的平方成正比，与放大倍率的平方成反比。
• 荧光显微镜的图像亮度随 NA 的四次方增加。
• 必须为特定应用仔细选择物镜。只有合适的物镜才能获得令人满意的成像效果。
• 生物医学应用中最重要的对比技术是相衬和 DIC。
• 光学对比技术基于对背景光和物体衍射光的选择性操作。