【Nat. Biomed. Eng.】🚀“93.2%纯度诱导、3毫米类肝芽、6天实现灌流”：肝窦微血管自组织技术登场

在组织工程和类器官研究领域，如何复制体内器官的复杂血管网始终是最大难题之一。尤其对于肝脏而言，其特有的肝窦微血管系统不仅为肝实质细胞提供营养和氧气，更通过内皮细胞分泌的各种“血管体液”（angiocrine factors）指导肝细胞的分化与功能成熟。传统的类肝器官多以三维支架或基质胶包埋方式培养，虽然能够重建肝实质细胞群，但始终缺乏功能性、组织特异的肝窦内皮（LSEC）网络，更无法提供真实的血流灌注与分子交换。由此，肝类器官在代谢、药物筛查以至于再生医学应用上都存在明显瓶颈。2025年6月，Saiki等团队在《Nature Biomedical Engineering》上发表了一项革命性成果：他们直接从人iPSC分化出高达93.2%纯度的肝窦前体内皮细胞（iLSEP），并借助一种“反向多层气–液界面（IMALI）”三维培养技术，实现四类前体细胞的自顶向下共组装，最终生成直径约3.0毫米、在6天内建立完备血流灌注网络的类肝芽球（HLBO）。更令人惊叹的是，移植后该类器官还能够在体内分泌功能性凝血因子，成功矫正FVIII缺陷造成的严重出血表型，开创了类器官治疗血液学疾病的新天地。

从胚胎发育启发，分步构建LSEC前体

模仿胚胎肝脏形成过程中，原始静脉丛和心脏静脉窦一同参与肝窦血管的构建，研究团队首先在二维微图案分化平台上对iPSC进行原肠胚和早期血管样谱系诱导。通过有限剂量VEGF-A和血液细胞因子组合的巧妙调控，在第6天获得了高表达CD31的血管前体，并在第8天时分离出CD34⁺CD31⁺CD32b⁺细胞，纯度高达88.0%。为了进一步获得功能性LSEC前体，他们借助了单细胞转录组学的发育轨迹重建，发现Oncostatin M（OSM）信号在胎肝中期对LSEC命运至关重要。于是，在第8天的CD34⁺细胞基础上，于第10–14天加入OSM，成功将CD32b⁺LYVE1⁺CXCR4⁻细胞群的比例提升至93.2%。这些iLSEP不仅在分子层面上高表达STAB2、LYVE1、FCGR2B等LSEC特异标志，还在超高分辨率电镜下展示了典型的“微孔（fenestrae）”结构，与原生LSEC高度相似。

IMALI气–液界面：还原胚胎空间组织

在获得高纯度iLSEP后，下一步便是如何让肝实质前体与LSEC自发共组织成真正的类肝芽结构。研究团队创新性地设计了一种反向多层气–液界面培养（IMALI），借助透气膜和多层水凝胶，将四类前体细胞依次分层铺设。其中，最底层为iPSC衍生的肝内胚层（iHE）与隔膜中胚质（iSTM）；中间层为动脉样内皮细胞（iAEC）；最上层则为iLSEP前体。该布局模拟了胚胎中原始静脉丛、隔膜以及肝管之间的解剖关系：上方空气提供充足氧气，下方液相供应营养物质。仅5天，这些细胞便在三维微环境中自主收缩、贴合，最终形成形如小圆顶的大型类肝芽结构。

三维自组装：3.0×3.0×1.5毫米类肝芽诞生

经过11天的IMALI培养，HLBO的直径稳定在3.0乘3.0乘1.5毫米，并呈现出致密的芽状外观。全组织免疫荧光染色显示，iLSEP衍生的CD32b⁺CD31⁺细胞与CD32b⁻CD31⁺细胞在HLBO内部共同分布，并与ASGR1⁺肝细胞紧密相邻。更高倍放大成像证实，这些上皮细胞群与血管网交织形成固有的“肝小叶”类似结构——中心肝细胞区富含谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸酶2（GLS2），而周边则更多表达分泌蛋白和胆汁相关因子。流式检测表明，约90.5%的CD34⁺细胞在HLBO中保留CD32b表型，说明LSEC群体在3D环境下得以稳定扩增。

灌流功能：6天内实现体内血流接通

最具革命性的是，在免疫缺陷小鼠颅骨窗口移植实验中，研究者在术后6天即可通过活体显微成像，观察到HLBO中由GFP标记的iLSEP衍生血管与小鼠血管网络连通，真正实现了血流灌注。更通过不同分子量的荧光标记葡聚糖试验，证明2000 kDa的巨分子被血管壁完全拦截，而70 kDa的小分子可自由透过，精准重现了肝窦内皮的典型小孔过滤功能。此外，注入的AcLDL探针亦被人源LSEC特异摄取，表明它们具备强大的清除和内吞能力。

单细胞图谱：多重内皮谱系的分化轨迹

为了深入解析HLBO中内皮多样性，团队对3、7、11天的类器官进行单细胞RNA测序。通过UMAP降维与层次聚类，他们鉴定出包括动脉样、静脉样和窦状样三大内皮亚群。随培养时间推移，CD32b⁺F8⁺LYVE1⁺的窦状样细胞（EC4）的比例显著上升，而THBD⁺vWF⁺的静脉样亚群（EC2、EC3）与CD31⁺CD32b⁻的动脉样亚群（EC1）逐渐减少。RNA velocity和PAGA图揭示了静脉样到窦状样的分化转轨，而关键转录因子GATA4、OSM下游信号则在早期驱动该命运决定，为后续功能化提供了分子依据。

LSEC–肝细胞互馈：WNT2构建“窦状–肝实质”联动

除了自组织成网，iLSEP还通过分泌多种“血管体液”影响肝细胞功能。配体–受体分析显示，iLSEP是HLBO中最活跃的信号分泌中心，尤其富含WNT2。WNT2通过FZD5/LRP5/6与iHE建立精密联结，促进肝实质前体向成熟肝细胞方向分化。利用LNP包载siRNA在IMALI体系中敲低WNT2后，ASGR1⁺肝细胞数目显著减少，GS表达和谷氨酸合成活性下滑，血管网分支密度也随之下降，FVIII分泌减少，印证了WNT2在器官共建和功能互促中的核心地位。

功能输出：多重肝功能与凝血因子齐聚

在HLBO中，除了结构重建，研究还验证了肝细胞的代谢和分泌能力。经典的CYP3A4和CYP1A2药物代谢酶可响应Rifampicin和Omeprazole诱导而显著上调，说明HLBO具备体外药物代谢研究潜力。更为突破的是，HLBO培养上清富含补体C3、C4、C5和凝血因子FV、FVIII、FIX、FXI等，能在含有单因子缺陷的血浆中恢复正常凝血时间。尤其在FVIII缺失模型中，HLBO上清将Aptt从超过120秒缩短至约49秒，展现出可观的补偿效果。

治疗前景：类器官移植矫正血友病

将HLBO移植至严重血友病A小鼠的肾包膜下后，研究者在第14天的止血试验中发现，HLBO组小鼠的尾部止血时间较对照组缩短约60%，失血量降低超过70%。这一体内功能验证首次证明了类器官不仅能维持生理灌注，还能在宿主环境中分泌功能性凝血因子，显著改善遗传性出血表型，揭开了类器官在血液病治疗领域的应用新篇章。

领跑同侪：与主流肝模型的多维对比

团队在整合11个公开人肝类器官数据后，通过谱系相关性对比发现，+iLSEP HLBO在肝窦特异标志、药物代谢、补体与凝血功能四大维度均领先于现有任何类器官模型，尤其在LSEC相关基因表达和功能检测上，Spearman相关系数高达0.96以上，显示出无可比拟的优势。

展望：迈向多器官级联与临床翻译

这一工作不仅为类器官技术提供了“血管化关键钥匙”，也为再生医学开辟了新的应用场景。未来，IMALI平台可扩展至肾、肺、脑等多种器官类器官的血管化培养，甚至可在生物打印、体外动态培养系统中实现更大尺度的器官构建。对于血友病等凝血因子缺陷性疾病，HLBO有望成为补充FVIII的长期来源，甚至发展为“类器官移植疗法”。同时，多模态成像与微流控技术的结合，也将推动类器官进入更精准的疾病模型和药物筛选阶段。

正如作者所言，“当我们能在体外重现器官的血管-实质互作与功能输出，才是真正打开再生医学与器官工程大门的时候”。这一93.2%纯度的LSEC直分化、3毫米肝芽规模化自组织与6天内实现血流灌注的创举，无疑将成为类器官领域下一个里程碑。

参考文献

Saiki, N., Nio, Y., Yoneyama, Y. et al. Self-organization of sinusoidal vessels in pluripotent stem cell-derived human liver bud organoids. Nat. Biomed. Eng (2025). https://doi.org/10.1038/s41551-025-01416-6