Fluolab✨文章标题：In Vivo mRNA Delivery to the Lung Vascular Endothelium by Dicationic Charge-Altering Releasable Transporters ✉️作者： Maya E. Kumar， Robert M. Waymouth 等 📚期刊：Journal of the American Chemical Society 🔗链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c06654
一、呼吸道疾病治疗的“最后一公里”
全球范围内，从急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺动脉高压，到慢性炎症，乃至新冠肺炎等一系列疾病，都与我们肺部的血管内皮细胞（Endothelial Cells, ECs） 功能受损息息相关 。这层精密的细胞网络，不仅是气体、液体和细胞进出血液与气道的“守门人” ，更是调节炎症和免疫反应的关键 。因此，将治疗性核酸（如 mRNA）精准递送到这个“内皮细胞小生境”（EC niche），被视为治疗各种肺部血管疾病最具吸引力的靶点 。
然而，要实现这一目标，却面临着巨大的技术挑战，这正是 mRNA 疗法普及的关键“最后一公里” 。
mRNA 是一种脆弱、带负电荷的分子，需要一个“快递小哥”——纳米载体——来保护它，并帮助它穿过细胞膜 。但目前的载体，在被静脉注射（IV）进入体内后，往往会随机分配到肝脏或脾脏等其他器官 ，只有一小部分能高效地到达我们真正想去的地方——肺部。更棘手的是，即便是到达了肺部，也很难穿透致密的血管壁，只选择性地进入血管内皮细胞，而不是周边的气道细胞或平滑肌细胞 。
本研究的突破点，正是解决这个“靶向性”和“效率”的双重难题。斯坦福大学的研究团队，通过对一种名为 CART（Charge-Altering Releasable Transporters，电荷改变可释放转运体） 的单组分载体进行 “分子魔改” ，不仅大幅提升了 mRNA 在肺部的表达水平，更实现了前所未有的精准性，专门针对肺部的动脉、静脉和毛细血管内皮细胞进行递送 。
这不仅仅是效率的提高，更是为广泛的肺部疾病，包括由空气传播病原体引起的感染、慢性炎症、肺纤维化和肺癌等 ，提供了全新的、无靶向配体的 “自动导航” 递送平台 。
二、Dicationic CART 的“分子魔改”哲学
1. CART：会“变脸”的智能快递
首先，我们来认识一下“快递小哥” CART 。CART 是一种单组分的递送载体，用于递送包括 mRNA、siRNA 在内的多种核酸货物 。它本质上是一种两亲性双嵌段寡聚物，由一个疏水性的脂质嵌段和一个可降解的阳离子聚酯嵌段组成 。
CART 的“智能”之处在于其动态静电特性 。在与带负电荷的 mRNA 混合时（通常在 pH 5.5 的弱酸环境下），CART 带有正电荷，通过静电络合作用，紧紧包裹住 mRNA，形成纳米颗粒（NPs），起到保护和递送的作用 。
一旦进入细胞内部的内涵体（Endosome），随着环境 pH 值的升高（pH 6-8），阳离子聚酯嵌段会发生不可逆的水解或重排降解 ，从而释放出中性或小分子副产物，导致整个纳米颗粒的电荷状态发生改变，实现著名的 “内涵体逃逸” 和 RNA 释放 。这种“变脸”能力是实现功能性 mRNA 递送的关键。
2. Dicationic CART：双重正电荷的威力
本研究的核心创新在于设计了一系列**“双阳离子”（Dicationic）的 CARTs 。简单来说，他们在每个重复单元上都带有两个阳离子胺基团，而不是一个，这显著增加了 CART 的电荷密度** 。
研究者们通过改变侧链的碳链长度，系统地合成了一系列基于不同 -氨基酸衍生的双阳离子 CART 单体 ，包括：
Lys-CART（源自赖氨酸，侧链有4个碳原子）
Orn-CART（源自鸟氨酸，侧链有3个碳原子） 222222
Daba-CART（源自二氨基丁酸，侧链有2个碳原子） 23232323
Dapa-CART（源自二氨基丙酸，侧链有1个碳原子） 24242424
这种看似微小的**“空间阵列”（spatial array）变化，即侧链胺基团与聚合物主链之间的碳原子间隔变化，被证明对体内的 mRNA 递送效率和组织趋向性（Tissue Tropism）**具有决定性的影响 。
例如，D-Orn-CART（鸟氨酸衍生）的侧链比之前报道的 Lys-CART（赖氨酸衍生）短了一个碳原子 。研究发现，这种微小变化对体外细胞转染效果（A549细胞）影响不明显，但一旦转移到体内（小鼠静脉注射），D-Orn-CART 导致的蛋白表达水平，比 D-Lys-CART 高出一个数量级以上 。
3. D-Daba-CART：最强“肺部导航”系统
在对这些双阳离子 CART 系列进行系统评估后，研究者找到了最强悍的“肺部导航”系统—— D-Daba-CART（侧链有两个碳原子）和 D-Dapa-CART（侧链有一个碳原子） 。
效率： 它们展示出最高的生物发光表达水平，总通量达到约 光子/秒（p/s），比 D-Orn-CART 高出半个数量级（D-Orn-CART 约为 p/s），而 D-Orn-CART 又比 D-Lys-CART 高出一个数量级 。相比于商业化对照试剂 in vivo-jetPEI，这些新型 CARTs 的表现更是遥遥领先 。
靶向性（Tropism）： D-Daba-CART 和 D-Orn-CART 一样，表现出高度选择性的肺部蛋白表达 。
失控的 D-Dapa-CART： 相比之下，虽然 D-Dapa-CART 在总体表达水平上与 D-Daba-CART 相当，但它却将 mRNA 不加区别地递送到了肺部、肝脏和脾脏，失去了选择性 。
这再次有力地证明了一个核心观点：侧链胺基团的位置和间距，对 CARTs 的体内递送效率和组织趋向性具有显著的影响 。微小的分子结构调整，带来了巨大的功能差异。
三、数据背后的创新与颠覆性分析：精准到“每一根血管”
通过定量组织学分析和高分辨率共聚焦成像，研究团队得以将 D-Orn-CART 和 D-Daba-CART 的靶向能力，“放大”到细胞级别，揭示了它们令人惊叹的特异性和效率。
1. 细胞水平：内皮细胞的独家快递
首先，使用 NanoLuc 编码 mRNA 进行的单细胞悬液分选实验（FACS）结果显示：D-Orn-CART/mRNA 纳米颗粒在 电荷比下，产生的蛋白表达主要集中在肺部的 内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）群体中，而上皮细胞或免疫细胞群体的表达极低 。
内皮细胞作为多种呼吸系统疾病的关键受累细胞，其特异性靶向是开发治疗药物的重大突破 。
2. 血管网络：动脉、静脉、毛细血管“一个不漏”
肺部的血管床极其复杂，包括肺动脉、肺静脉、气管血管和肺毛细血管等至少六种主要的内皮细胞类型 。为了精确确定目标细胞，研究人员将 Cre 重组酶 mRNA 包裹在 CART 中，注射到 Ai14 Cre 报告小鼠体内。一旦 mRNA 被递送并翻译成功能性 Cre 蛋白，细胞就会被永久标记为红色荧光蛋白 tdTomato 阳性 。
结果令人振奋：
极高的选择性： 在 D-Orn-CART 和 D-Daba-CART 治疗的小鼠肺部，观察到大量的 tdTomato 表达，且这些表达严格局限于肺动脉和肺静脉的内皮衬里，以及肺泡内的毛细血管 。
非靶向排除： 没有任何 tdTomato 信号出现在传导气道的上皮细胞或围绕气道和血管的平滑肌细胞中 。这表明它们对肺内皮细胞具有极高的特异性 。
3. 效率量化：D-Daba-CART 在毛细血管中效率达93%
在对肺循环系统各部分进行定量分析时，D-Daba-CART 显示出惊人的效率 。
| 肺血管区室 | D-Daba-CART 阳性内皮细胞比例（tdT+） | D-Orn-CART 阳性内皮细胞比例（tdT+） |
|---|---|---|
| 肺动脉 | 53% 42 | 26% 43 |
| 肺静脉 | 65% 44 | 31% 45 |
| 肺毛细血管 | 93% 46 |
D-Daba-CART 的颠覆性表现： D-Daba-CART 在肺毛细血管中的靶向效率高达 93% ，这几乎是完全覆盖了两种毛细血管细胞类型（aerocytes 和 gCaps）。其效率显著高于在肺动脉和肺静脉中的表现（） 。
效率提升的量化冲击： 相比之下，D-Orn-CART 在毛细血管中的效率为 66% ，在动脉中的效率仅为 26% 。D-Daba-CART 在肺动脉和肺毛细血管的靶向效率上，相比 D-Orn-CART，分别提升了约103%（动脉）和41%（毛细血管），实现了对整个肺循环系统的超高效、均衡覆盖。
非靶向的再次确认： 两种 CARTs 均未靶向淋巴管内皮 ，并且对支气管动脉的靶向效率也较低 。
4. 耐久性：长达96小时的持续表达
除了高效率和高特异性，D-Orn-CART 还表现出长效的蛋白表达耐久性 。在静脉给药后长达 48小时，肺部的生物发光信号仍保持高水平（总通量大于 p/s），甚至在 94小时后从取出的小鼠肺部仍可检测到信号 。这种长效的表达曲线，与第一代 Gly-CART 在 24 小时后显著下降的表达曲线形成鲜明对比 ，意味着在治疗环境中，可以实现更低的给药频率 。
5. 安全性：良好的生物安全性
安全性是所有新药的基石。在静脉注射 D-Orn-CART/mRNA 纳米颗粒 24 小时后，小鼠的丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST) 和血尿素氮 (BUN) 水平与未治疗的小鼠相比没有显著升高 。即使在连续四周、每周一次的重复给药后，这些肝肾毒性标志物也没有表现出任何毒性迹象 。这得益于 CART 优异的生物降解性 。
四、应用展望、局限性与未来路线图
这项研究成功地展示了，通过对 CART 阳离子嵌段侧链进行系统的、微小的结构调整，可以显著控制 mRNA 递送的效率、组织趋向性，甚至蛋白质表达的耐久性 。
1. 潜在的应用场景
精准治疗： 这种对肺内皮细胞的高度特异性和高效能，使得 D-Daba-CART 成为治疗一系列肺血管疾病（如肺动脉高压、ARDS）的理想载体 。它能将药物或基因编辑工具直接送达病灶，减少对健康组织的脱靶效应。
诊断平台： 精准靶向的载体，也可以用于递送荧光标记或成像报告基因，用于早期诊断或实时监测肺部内皮细胞病变 。
基础研究工具： 它提供了一个无配体的“自动导航”工具，可用于在活体动物模型中特异性操纵肺内皮细胞的基因表达，加速对肺部疾病机制的研究 。
2. 客观的局限性与挑战
体外/体内的不一致性： 研究再次证实，体外的 mRNA 递送效率并不能很好地预测体内的效率和组织趋向性 。例如，D-Gly-CART 在体外 A549 细胞中表现出最高的蛋白表达，但在体内却表现最差 。这提示我们在药物开发中，必须以体内数据为准绳。
炎症迹象： 虽然肝肾毒性指标表现良好，但支气管肺泡灌洗液（BAL）测量显示，D-Orn-CART 治疗组的总蛋白水平有所升高，这暗示着轻微的炎症反应 。尽管Masson's trichrome染色未发现血栓或炎症细胞积聚 ，未来的研究仍需深入探究其潜在的长期炎症风险。
非肺部表达的控制： 尽管 D-Daba-CART 和 D-Orn-CART 主要靶向肺部，但 Cre 报告小鼠实验中，肾脏、心脏、脾脏和肝脏仍存在散在的 tdTomato 标记细胞 。要实现100%的肺部特异性，仍有优化空间。
3. 未来路线图
这项工作为无需靶向配体就能通过纳米颗粒固有特性控制组织趋向性（Tissue Tropism）的假设提供了有力支持 。未来的研究路线图应聚焦于：
机理解析： 深入探索侧链结构变化如何影响纳米颗粒的体内循环稳定性、蛋白质电晕形成和内皮细胞特异性内吞机制 ，以指导更合理的结构设计。
毒理学深入： 对 D-Daba-CART 等高效载体进行更全面的慢性毒理学和免疫原性评估，特别是 BAL 液中炎症指标的长期变化。
临床转化： 利用这一平台，包装治疗性 mRNA 或基因编辑工具，如针对肺动脉高压靶点的 mRNA，加速其在临床前模型中的验证 。
总而言之，以 D-Daba-CART 为代表的新型双阳离子 CART 平台，不仅代表了 mRNA 递送技术的一次重大飞跃，更提供了一套可调谐、高效、专一的肺内皮细胞靶向工具，极大地加速了肺部靶向基因疗法的临床发展和应用 。