Fluolab【JACS】突破衍射极限！14.6倍近红外荧光增强技术让活细胞RNA成像实现40纳米超清分辨率
✨文章标题：A Near-Infrared Aptamer:Dye System For Live-Cell Super-Resolution RNA Imaging ✉️作者：Murat Sunbul* , Andres Jäschke* 等 🔗链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16419
科学家们将RNA成像技术推向新高度，首次在哺乳动物活细胞中实现近红外超分辨成像
在细胞生物学领域，RNA成像技术一直面临着一个巨大挑战：如何在不干扰细胞正常功能的情况下，清晰观察RNA分子的动态变化。传统方法如同在黑夜中用手电筒寻找细微物体，要么分辨率不足，要么对细胞造成伤害。
现在，这一困境被彻底打破。德国海德堡大学的研究团队开发出了SiRiuS:SiR-5系统，这一突破性技术将RNA成像带入了一个全新纪元。
从“痛点”到“突破”：为什么RNA成像如此困难却又如此重要？
RNA是生命活动的关键执行者，从基因表达到细胞应激响应，无处不在。然而，RNA成像却长期面临三大技术瓶颈：
首先，细胞中不存在天然荧光RNA，研究人员必须借助“外援”进行标记。传统方法如荧光原位杂交(FISH)需要固定细胞，无法用于活体观察；而MS2-MCP系统虽然可用于活细胞，但庞大的蛋白质标签会严重干扰RNA的正常代谢和功能。
其次，可见光范围内的成像技术受到细胞自发荧光的严重干扰，信噪比低，就像在强光下观察星星，细节被完全淹没。
最重要的是，传统荧光显微镜的分辨率受限于光的衍射极限（约200纳米），而许多RNA聚集体的尺寸远小于这一极限，导致科学家们无法看清其精细结构。
荧光点亮适配体(FLAPs)技术的出现曾带来一线希望。这些结构化RNA链能特异性结合荧光染料并激活其发光，无需固定细胞或共表达蛋白质。然而，在近红外区域的高性能FLAPs系统几乎为空白，而近红外成像恰恰具有最小化细胞自发荧光、减少光毒性和增强组织穿透性的独特优势。
2019年，该团队曾开发出SiRA系统，它在细菌中表现优异，实现了超分辨成像。但当应用于哺乳动物细胞时，荧光增强效果微乎其微，且染料会在细胞内形成聚集，严重影响使用效果。
面对这一困境，研究人员决定从头开始，采用一种全新的策略：同步进化适配体和染料，打造真正适用于哺乳动物活细胞RNA成像的近红外超级工具。
核心方法与技术细节：如何打造完美的RNA“荧光标签”？
革命性的筛选策略：不以结合力论英雄
传统适配体筛选方法(SELEX)主要基于结合亲和力，但高亲和力并不保证高荧光增强。研究团队果断转向荧光激活细胞分选技术，直接在细胞中基于荧光强度进行筛选。
这一转变的关键在于：真正重要的是染料与适配体结合后能发出多强的光，而不仅仅是它们结合得多紧密。
研究人员将来自原始SiRA筛选第7轮和第14轮的DNA库克隆到表达载体中，转入大肠杆菌。通过诱导表达，固定细胞后与染料一起孵育，然后使用FACS分选高荧光细胞，回收其中的适配体序列进行下一轮筛选。
经过三轮迭代筛选，阳性细胞比例从最初的不足1.3%显著提升至4.5%，证明成功富集到了高效激活荧光的适配体序列。
适配体结构的精准优化：从L2-8到SiRiuS的蜕变
从筛选出的候选适配体中，L2-8表现出最佳的细胞内信噪比，尽管其体外亲和力并非最高。这表明体外性能不能完全预测细胞内表现，细胞环境的复杂性远超试管条件。
通过SHAPE结构分析，研究人员揭示了L2-8的精细结构：一个四向连接结构，带有四个螺旋以及内部和顶端环。特别发现L2和L4环之间存在**“吻环相互作用”**——两个互补的7核苷酸序列相互识别，这对维持适配体功能结构至关重要。
基于这些发现，团队进行了系统性的突变和截断实验。令人惊讶的是，完全改变某些螺旋序列仍能保持荧光激活能力，证明适配体结构具有一定的容错性。然而，吻环相互作用的任何破坏都会导致功能丧失，凸显了其关键作用。
经过多轮优化，最终得到了SiRiuS适配体，其对SiR-NH2的解离常数(KD)达到22 nM，体外荧光增强8.4倍，相比SiRA和L2-8有显著提升。
染料工程的巧妙革新：解决细胞内聚集难题
原系统在哺乳动物细胞中的失败主要归因于染料的溶酶体积累。研究发现，SiR-NH2染料会聚集在酸性细胞器中，与适配体表达无关。
问题根源在于染料的末端氨基基团：中性的螺环形式可以自由穿过溶酶体膜，但在酸性环境中，氨基被质子化形成铵阳离子，无法再穿过膜，导致 “离子陷阱”效应。
研究团队合成了六种SiR衍生物，将末端氨基替换为非碱性基团，包括甲氧基、羟基、羧基、乙酰胺、甲磺酰胺和三氟甲磺酰胺基团。目标是保持高结合亲和力的同时，避免溶酶体积累。
通过系统评估，甲磺酰胺衍生物SiR-5脱颖而出，它在保持高亲和力(kD = 22 nM for SiRiuS)的同时，完全解决了聚集问题，在活细胞中表现出均匀的胞质分布。
数据背后的创新与颠覆性：为什么说这是一项里程碑式成就？
惊人的性能提升：从微不足道到卓越非凡
性能对比结果令人震撼：在优化后的显微镜设置下，SiRiuS:SiR-5系统实现了14.6倍的荧光增强，而SiRA仅达到2.7倍。这一近5倍的提升使得活细胞RNA成像从未如此清晰。
更令人印象深刻的是，这一卓越性能在低染料浓度(100 nM)下即可实现，极大降低了潜在细胞毒性。系统在HEK293T、HeLa和COS-7三种常用细胞系中均表现一致，证明其广泛适用性。
离子依赖性测试揭示了SiRiuS的另一优势：相比SiRA对镁离子的高度依赖，SiRiuS在生理镁离子浓度范围内(0.25-1 mM)保持95%以上荧光强度，甚至在1μM极低浓度下仍保持90%性能。这一特性使其更适合于体内应用，因为细胞内镁离子浓度可能存在波动。
光稳定性测试结果同样令人鼓舞：在连续照射25分钟后，共价标记的蛋白质荧光信号下降55%，而SiRiuS:SiR-5系统仍保持85%的初始强度。这种卓越的光稳定性对于长时间活细胞成像至关重要。
活细胞mRNA成像：从静态观察到动态追踪
研究人员将8个SiRiuS适配体重复序列插入多种mRNA的3‘非翻译区，成功实现了活细胞mRNA成像。选择8重复是基于实验优化：虽然从4增加到8重复时荧光信号成比例增强，但从8到16重复时改善有限，表明8重复在信号强度和细胞负担间达到了最佳平衡。
团队成功对GAPDH和肌动蛋白β等内源性mRNA进行成像，这些mRNA在细胞质中均匀分布，与既往报告一致。Northern印迹分析确认，带标签的mRNA在降解过程中未产生可能造成假阳性信号的结构片段。
真正展示系统威力的是应激颗粒形成过程的动态观察。应激颗粒是细胞在应激条件下形成的相分离凝聚体，参与多种细胞过程。研究人员用砷酸钠处理细胞诱导氧化应激，成功观察到了GAPDH mRNA向应激颗粒的募集过程。
时间序列成像显示，较大的G3BP1-GFP颗粒在应激后10-15分钟开始形成，GAPDH SiRiuS信号在15分钟后可见在颗粒中积累。更重要的是，应激缓解后，团队还观察到了应激颗粒的分解过程，完整记录了这一动态细胞事件的始终。
超分辨成像的突破：打破衍射极限，看清纳米世界
最令人振奋的成就是SiRiuS:SiR-5系统在STED超分辨显微镜中的应用。刺激发射损耗显微镜通过使用耗尽激光抑制焦点外围荧光，突破衍射极限，但此前近红外FLAPs系统未在哺乳动物细胞中实现这一技术。
研究人员对表达GAPDH mRNA的细胞进行成像，在活细胞中达到94纳米分辨率（相比共聚焦的419纳米），在固定细胞中更是达到了惊人的43纳米分辨率（共聚焦为311纳米）。这意味着科学家现在能够以前所未有的清晰度观察RNA在细胞内的纳米级组织。
多色STED成像进一步展示了系统的实用性。研究人员将SiRiuS:SiR-5系统与之前开发的RhoBAST:SpyRho系统（工作波长较短）结合，同时观察两种不同mRNA在应激颗粒中的分布。有趣的是，GAPDH和mAzurite mRNA聚集并不完全共定位，暗示应激颗粒内可能存在更精细的RNA区室化。
应用展望、局限性与未来路线图
当前研究的局限性
尽管SiRiuS:SiR-5系统表现卓越，但仍存在一些局限性。首先，系统的激发波长(664 nm)与标准共聚焦显微镜的固定640 nm激光不完全匹配，未能充分利用其红移特性。使用全谱可调激光器可能进一步提升信噪比。
其次，虽然系统在多种细胞系中验证有效，但在更复杂体系（如组织、胚胎或活体动物）中的性能仍需进一步验证。近红外光虽然组织穿透性更好，但生物体内的散射和吸收可能影响成像效果。
此外，目前工作主要关注mRNA成像，对非编码RNA（如长非编码RNA）的应用潜力尚未充分探索。这些RNA分子通常表达量更低，定位更特异，对成像系统灵敏度要求更高。
广阔的应用前景
SiRiuS:SiR-5系统的成功开发为细胞生物学研究开辟了众多新途径：
在基础研究领域，这一技术将使科学家能够实时观察RNA的转录、运输、定位和降解全过程，揭示基因表达的精细调控机制。特别适用于研究相分离凝聚体中的RNA行为，这是当前生物学的热点领域。
在疾病研究方面，系统可用于追踪疾病相关RNA的异常定位和行为，如神经退行性疾病中应激颗粒的形成机制，或病毒感染过程中病毒RNA的复制和运输。
药物开发应用潜力巨大，该技术可用于筛选影响RNA定位和功能的化合物，为开发靶向RNA的药物提供强大工具。
未来发展方向
基于当前成就，该技术有几个明确的未来发展路径：
首先，进一步优化染料化学，开发亮度更高、光稳定性更好的衍生物，可能将活细胞STED成像的分辨率推向新高度。
其次，扩展多色成像能力，开发更多正交系统，实现同时追踪多种RNA物种的相互作用，揭示RNA网络的复杂性。
最后，推动技术向体内应用发展，探索在模式生物乃至临床前模型中应用的可能性，最终实现人类疾病诊断和治疗的转化应用。
SiRiuS:SiR-5系统代表了RNA成像技术的一个里程碑，它不仅是第一个在近红外光谱区工作的FLAP系统，也是第一个在哺乳动物细胞中实现STED超分辨成像的系统。随着技术的进一步优化和应用的拓展，我们有理由相信，这束照亮RNA世界的“近红外之光”将引领我们进入细胞生物学研究的新时代。