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【Angew.Chem.】RNA实时成像新突破：TriPPPPro策略实现高效标记，荧光增强率最高达45倍 ​

文章标题：Live‐Cell RNA Imaging via Clickable TriPPPro Nucleotide Reporters
通讯作者：Prof. Dr. Jens B. Bosse, Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht, Prof. Dr. Chris Meier
文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202516613

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文章概要 ​

引言 ​

RNA在细胞内的合成与动态过程是理解生命活动的关键。然而，传统的RNA标记与成像方法，如FISH或铜催化的点击化学，往往需要固定细胞，无法实现实时观察。近年来，基于MS2系统、分子信标或CRISPR-Cas13的成像方法虽能标记特定RNA序列，但难以全面追踪整体RNA合成。本文提出了一种全新的化学策略——TriPPPPro（三磷酸前药）方法，结合逆电子需求Diels–Alder（IEDDA）反应与双荧光激活染料，实现了活细胞内RNA的高效、特异、低背景成像。

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TriPPPPro策略的核心原理 ​

TriPPPPro通过在核苷三磷酸上引入可水解的脂溶性保护基团，使其具备细胞膜通透性。进入细胞后，内源性酯酶水解保护基团，释放出活性核苷三磷酸（NTP），随后被RNA聚合酶整合进新生RNA链。此时，带有反应基团的核苷与荧光四嗪染料发生IEDDA点击反应，产生强烈的荧光信号。该方法无需额外转运蛋白，避免了传统方法的毒性与复杂性。

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化学修饰与反应动力学 ​

研究团队设计了两类修饰：

  • 2TCOa（轴式反式环辛烯）：反应速率常数高达 (10^4 M^{-1}s^{-1})，但可能出现荧光暂时降低的双步动力学过程。
  • BCN（双环[6.1.0]壬炔）：反应直接生成芳香吡嗪，避免了荧光淬灭，但反应速率略低。

实验显示，荧光增强倍数在31至45之间，证明两类修饰均能实现高效标记。

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与传统方法的比较 ​

研究者将TriPPPPro与SNTT转运系统进行对比。结果表明：

  • TriPPPPro在细胞内的RNA整合效率更高，荧光信号更强。
  • SNTT方法虽能实现一定程度的标记，但信号明显较弱，且存在毒性风险。
  • TriPPPPro方法在不同哺乳动物细胞系中均表现出良好的适用性。

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实验验证与成像结果 ​

在Vero细胞中，TriPPPPro标记的RNA荧光信号集中于细胞核仁，与rRNA高度共定位，证明其特异性。进一步实验显示：

  • 使用转录抑制剂Actinomycin D后，荧光信号消失，确认标记来源于新生RNA。
  • 细胞质信号与线粒体探针共定位，表明该方法也能追踪线粒体RNA。
  • 标记的RNA可在48小时内持续追踪，显示其稳定性与低毒性。

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技术优势 ​

  1. 高效递送：无需转运蛋白，避免毒性与复杂操作。
  2. 双荧光激活：染料在点击反应与核酸结合后双重增强信号，背景极低。
  3. 实时成像：可在活细胞中直接观察RNA合成与动态。
  4. 广泛适用性：适用于不同细胞类型，且可扩展至其他核苷修饰。

结论与展望 ​

TriPPPPro策略成功解决了RNA实时成像中的三大难题：递送效率、标记特异性与信噪比。其模块化设计使得不同核苷与反应基团可灵活组合，未来有望应用于腺苷、鸟苷等修饰，甚至拓展至病毒RNA研究。该方法不仅为RNA生物学提供了强有力的工具，也为抗病毒药物研发开辟了新方向。

综上，本文展示了一种突破性的RNA成像技术，荧光增强率最高可达45倍，标记效率显著优于传统方法。TriPPPPro策略为实时、全面、低背景的RNA动态研究提供了新的可能性，具有广阔的应用前景。