【JACS】突破神经再生瓶颈！5 种小分子肝素糖模拟物实现无抗凝风险，神经突起增长超 4 倍

文章标题：Unraveling the Potential of Small Molecule Heparin Glycomimetics in Neuroregenerative Therapeutics 通讯作者：Melis Özkan、Silvestro Micera、Francesco Stellacci 文章链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c13142

文章概要

在神经再生治疗领域，肝素和硫酸乙酰肝素（HS）糖胺聚糖（GAGs）因能调控神经营养信号，一直被寄予厚望。然而，它们存在结构异质性、批次差异以及抗凝活性等问题，严重限制了其治疗应用。为此，来自瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）、意大利国际高等研究院（SISSA）等机构的研究团队，开展了一项关于小分子肝素糖模拟物在神经再生治疗中潜力的深入研究，旨在开发出结构明确、无抗凝风险且能模拟天然 HS 功能的糖模拟物，为神经再生治疗提供新的解决方案。

研究团队首先设计并合成了一个包含 5 种小分子 HS 糖模拟物的库，这些模拟物具有不同的硫酸化模式，涵盖单糖（M1）、二糖（D1、D2、D3）和四糖（T1）。合成过程采用模块化策略，通过正交保护基团的使用，实现了在糖骨架指定位置精准安装硫酸基团，为后续研究不同硫酸化模式对功能的影响奠定了基础。

为评估这些糖模拟物的性能，研究团队进行了全面的生物物理表征。利用生物层干涉法（BLI）检测糖模拟物与神经营养蛋白的结合亲和力，结果显示，其中的二糖模拟物 D2 表现尤为突出，对成纤维细胞生长因子 FGF-1（解离常数 KD=0.78μM）、FGF-2（KD=0.67μM）以及神经生长因子 NGF（双位点结合模型 KD 分别为 2.6μM 和 468μM）均具有良好的结合能力，且对凝血酶 III（AT-III）无可检测的相互作用，这意味着其不会引发抗凝相关风险。 circular dichroism（CD）光谱和热变性实验进一步证实，糖模拟物结合能增强 FGF 蛋白的热稳定性，如 FGF-2 与 D2 结合后，熔融温度（Tm）从 43.9℃提升至 52.4℃，最大提升幅度可达 8.5℃，表明这些糖模拟物能稳定目标蛋白结构，为其发挥功能提供保障。分子建模研究也从结构层面验证了糖模拟物与目标蛋白的结合模式，揭示了关键的相互作用位点，进一步解释了实验观察到的结合特性。

在功能验证方面，研究团队通过细胞实验评估了糖模拟物的神经再生潜力。在 PC12 和 SH-SY5Y 两种神经元细胞模型中，将 D2 固定在培养基底表面，模拟 HS 在细胞外基质（ECM）中的天然作用。结果显示，在 NGF（50ng/mL）刺激下，PC12 细胞在 D2 涂层表面的总神经突起生长长度从对照组的 108μm 显著增加到 541μm，增长超 4 倍；SH-SY5Y 细胞中神经突起相关的 β- 微管蛋白 III 荧光强度也显著提升，且 D2 的效果与天然 HS 相当，证明其能有效促进神经细胞成熟和神经突起生长。

为进一步验证在生理相关系统中的效果，研究团队利用原代大鼠海马神经元进行实验。当 D2 与 FGF-2（40ng/mL）共同作用时，神经元的神经突起数量从对照组的 3.6 个 / 神经元增加到 6.8 个 / 神经元，最长神经突起长度从 38μm 增加到 59μm，同时自发突触后电流（sPSCs）的频率和振幅也显著提高，频率从 1.23Hz 提升至 2.52Hz，振幅从 42pA 提升至 75pA，表明 D2 能协同 FGF-2 促进神经突起生长和神经突触功能，增强神经网络的活性。

此外，研究团队还通过发色底物实验和活化部分凝血活酶时间（aPTT）测定，确认所有合成的糖模拟物均不抑制凝血因子 IIa 和 Xa，对凝血功能无干扰，彻底解决了天然肝素类物质的抗凝风险问题。

该研究通过模块化合成策略成功开发出具有明确结构和功能的小分子肝素糖模拟物，不仅解决了天然 HS 的固有缺陷，还在细胞和分子水平上全面验证了其神经再生潜力。这些糖模拟物能选择性结合神经营养蛋白，稳定其结构并促进神经再生相关功能，且无抗凝风险，为神经损伤和神经退行性疾病的治疗提供了全新的候选分子。同时，该研究建立的结构 - 功能关系框架，也为后续开发针对多种生长因子的糖模拟物平台奠定了基础，有望推动再生医学领域在神经修复及其他组织再生方向的进一步发展。