Fluolab【JACS】三光子吸收竟能由单光子“接力”实现？非线性荧光分子工程新突破
文章标题： Molecular Engineering for Nonlinear Fluorescence: En Route to Three-Photon Absorption via Sequential One-Photon Excitation
通讯作者： Johan Hofkens, Uwe Pischel, Morten Grøtli, Joakim Andréasson
文章概要
本文介绍了一种创新的分子工程策略，旨在通过连续的单光子激发（1PE） 来模拟复杂的多光子非线性荧光响应。传统的多光子激发（MPE）虽然在三维空间分辨率和信噪比方面具有巨大优势，但往往受限于极高的激发光功率需求以及长波长激发带来的分辨率下降问题。研究团队通过巧妙设计分子二元簇（Dyad）和三元簇（Triad），成功实现了分别对应于二光子和三光子吸收特征的非线性荧光发射，为在低功率连续光源下获得高阶非线性光学性能开辟了新途径。
Figure 1. Schematic illustration and corresponding chemical structures. (a) Schematic representation of the design principles for the 3for1 triad and 2for1 dyad. F: Fluorophore, PSC: Colored isomer of photoswitch, PSCL: Colorless isomer of photoswitch, PC: Photocage. (b) Photochemical and thermal isomerization pathways for the 3for1 triad (BDP/SNPC/ACD) and the 2for1 dyad (SNPC/ACD). Upon FRET-induced decaging (), the 3for1 triad releases the BDP unit to generate the 2for1 dyad, which subsequently undergoes FRET-induced isomerization () and thermal isomerization (). SNPCL/ACD is the only fluorescent form. BDP: BODIPY, SNP: Spironaphthopyran, ACD: Acedan.
引言
荧光显微成像技术在生物和材料科学中不可或缺，而多光子激发技术由于其仅在焦点处激发荧光的特性，能够显著降低背景噪音并提高成像对比度。然而，实现三光子甚至更高阶的激发通常需要极其昂贵的高功率脉冲激光器，且长波长激发光会导致空间分辨率受到衍射极限的制约。为了攻克这一难题，作者提出利用光开关分子和光笼分子与荧光团进行偶联，通过“阶梯式”的单光子吸收过程来逐步激活分子，使其最终的荧光强度与激发光功率呈现出平方或立方关系的非线性依赖，从而在无需复杂昂贵设备的前提下，获得类似多光子激发的成像优势。
Scheme 1. Synthesis of the 2for1 Dyad and the 3for1 Triad
主要实验及结论
在分子设计方面，研究人员选用Acedan衍生物作为荧光团（F），并将其与具有负光致变色特性的萘并螺吡喃光开关（PS） 偶联形成二元簇（2for1）。这种设计的核心在于，处于热稳定状态的光开关异构体可以通过高效的荧光共振能量转移（FRET） 淬灭荧光团，使系统处于“关闭”状态；当光开关吸收第一个光子异构化后，FRET消失，分子被“激活”，此时吸收第二个光子即可触发荧光读出。实验结果显示，该二元簇的荧光强度与激发强度呈现出近二次方的依赖关系（NLF=1.6，背景扣除后达1.9）。为了进一步提升非线性阶数，团队在二元簇的基础上引入了BODIPY光笼（PC），构建了三元簇（3for1）。在这个系统中，需要先通过第一个光子进行脱笼反应，再通过第二个光子诱导光开关异构化，最后由第三个光子激发产生荧光信号。
Figure 2. Absorption/emission spectra of the monomer, dyad and triad for 2for1 and 3for1. (a) Absorption (filled area) and emission spectra (solid line) of ACD (black) and SNPC(orange). (b) Absorption spectrum (filled area) of the SNPC/ACD dyad and emission spectrum (solid line) recorded after 405 nm irradiation of SNPC/ACD to yield a significant population of the fluorescent form SNPCL/ACD. (c) Absorption (filled area) and emission spectra (solid line) of ACD (black) and BDP/SNPC (red). (d) Absorption spectrum (filled area) of the BDP/SNPC/ACD triad and emission spectrum (solid line) recorded after 405 nm irradiation of BDP/SNPC/ACD** to yield a significant population of the fluorescent form SNPCL/ACD. The shoulder at around 525 nm in the emission spectra originates from the minor BDP fluorescence centered at 524 nm.
实验表征证实，引入光笼不仅成功增加了一个激活步骤，还将初始背景发射从7%显著降低到了1%。在连续光照射下，三元簇表现出了明显的非线性增长趋势，其非线性因子达到了2.2，这在实验上证明了通过单光子“接力”实现超越二光子性能的可能性。通过动力学模型模拟发现，实验观察到的非线性因子与理论预测高度吻合，进一步验证了这种顺序单光子激发机制的可靠性。虽然光笼的脱笼过程具有不可逆性，但这一原型证明了分子工程在调控光学非线性方面的巨大潜力。
Figure 4. Time-dependent fluorescence responses of the BDP/SNPC/ACD triad under continuous irradiation at two excitation intensities. (a) Fluorescence kinetics of BDP/SNPC/ACD upon 405 nm irradiation at Half _I_exc (80 mW/cm2, black) and Full _I_exc (160 mW/cm2, blue). (b) Ratio of fluorescence intensities (dots) and kinetic simulation (solid line) performed using parameters determined from experimental data. A maximum NLF of 2.2 was observed.
总结及展望
这项研究通过精密的分子逻辑设计，打破了实现高阶非线性光学响应对高功率激光器的依赖。研究证明，通过光开关与荧光团的协同控制，可以在极低的激发功率下模拟出昂贵三光子显微镜才能实现的非线性效应。未来的研究方向将侧重于开发完全可逆的光控开关系统，以实现分子的重复循环使用，并尝试在不依赖酸化环境的情况下优化光开关性能。这一成果不仅丰富了非线性荧光分子的理论库，也为开发新一代高灵敏度、高分辨率的生物成像探针提供了极其重要的技术参考。