Fluolab【Angew. Chem.】214倍荧光信号增强！新型EC5-H3探针实现近红外活体氧化损伤精准成像
🔬一、研究背景：为何需要超高信噪比的近红外荧光探针？
在现代生物医学研究和临床诊断中，氧化应激诱导的组织损伤是多种疾病的重要标志，包括药物性肝损伤、炎症、肿瘤形成等。因此，能实时、准确识别活体内活性氧（ROS）分布的分子探针，具有重要价值。
而在所有成像光谱中，**近红外区（NIR，尤其指波长大于800 nm）**具有更深的组织穿透性、更低的自发荧光干扰，理想用于活体成像。然而，目前主流的NIR荧光染料面临如下挑战：
- 光稳定性差、易氧化降解；
- 荧光开启（turn-on）倍率低，通常仅3–10倍；
- 启动反应慢，灵敏度不够；
- 无法区分组织或细胞内部氧化损伤的异质性。
本研究则突破上述瓶颈，报道了一种全新的EC5-H3探针，具有超高214倍信号增强倍率、抗破坏能力强、稳定可靠，可用于活体/组织内ROS可视化追踪，尤其在药物性肝损伤模型中表现出色。
🧬二、EC5荧光母体染料的设计理念与优势
EC5为作者团队2017年开发的新型双苯并并五环结构近红外染料（bisbenzannulated xanthenoid dyes），拥有以下特性：
- 吸收/发射波长 >800 nm，适用于NIR成像；
- 高摩尔吸光系数与量子产率，荧光明亮；
- 较传统氰碱、BODIPY等染料更具光化学/化学稳定性。
但EC5染料的特殊结构也带来新问题——其类黄烷母体上典型用于探针设计的螺环开环机制（spirocyclization）不适用。原因在于：
- 中心亚甲基（methine C）高度芳香性，开环代价大；
- 含氮供电子团在水相中形成氢键，抑制电子推动能力，影响环开；
- 常规策略（S/Se活性基团）在生理条件下无显著信号响应。
🧠三、全新探针设计策略：EC5骨架上的“非对称共轭加成”
研究者提出一种突破性机制：在EC5染料的醌甲烷位点（quinone-methide carbon）进行共轭加成还原反应，合成出“还原型EC5探针（EC5-H3）”：
- 采用NaBH₄还原优化条件，使还原选择性发生在醌甲烷位点；
- 得到具黄色–绿色荧光特性的还原探针EC5-H3（530 nm）；
- 与ROS反应后可高效氧化为原染料形式（发射峰890 nm），激发近红外荧光；
- 实现前所未有的**“零背景→强信号”式超高对比度成像（turn-on比值>200倍）**。
📈四、探针光物理性能与高信噪比验证
🔬1. 吸光与发射光谱特性
- EC5-H3无近红外吸收，发射位于530 nm；
- 经•OH或ONOO⁻氧化后，吸收峰出现在840 nm，发射峰为明亮的890 nm近红外信号；
- 开启倍率（turn-on ratio）：
- 吸收：172倍；
- 发射：214倍；
- 相较主流近红外探针（通常仅5–20倍），该性能遥遥领先。
🧪2. 化学稳定性与特异性分析
- 对ONOO⁻、•OH反应迅速（秒级）；
- 对ClO⁻、¹O₂反应弱；
- 无GSH、Cys、生物金属离子等干扰；
- 不受pH变化影响，适用于多种生理环境；
- 氧化产物（EC5-2OMe）具超强耐氧化与光稳定性。
🧬五、细胞水平检测ONOO⁻与肝损伤模型验证
🧫HeLa细胞实验：
- 使用SIN-1（ONOO⁻释放剂）处理HeLa细胞，EC5-H3信号大幅增强；
- 加入FeTPPS（ONOO⁻清除剂）后信号下降，验证特异性；
- 构建活性ONOO⁻升高的炎症模型（LPS+IFN-γ处理），信号增强明显；
- NAC（抗氧化剂）可显著抑制发光，说明探针反应依赖ROS上调。
🧬APAP（对乙酰氨基酚）肝损伤模型：
- 细胞暴露于APAP（0.25–1.0 mM）后，呈现剂量依赖性荧光增强；
- NAC前处理可抑制增强，进一步验证为ROS诱导。
🐭六、活体小鼠成像：检测肝损伤的动态变化
将探针应用于小鼠APAP肝损伤模型，使用NIR-II荧光成像系统（激发波长808 nm，发射>1100 nm）：
| 分组 | 处理方式 | 荧光信号强度变化 |
|---|---|---|
| 对照组 | PBS | 微弱上升（基础代谢） |
| 低剂量APAP | 150 mg/kg | 无显著增强 |
| 中/高剂量APAP | 300/500 mg/kg | 明显增强，说明氧化应激显著 |
| NAC+APAP | NAC预处理后注射APAP | 信号部分恢复至低水平 |
此外：
- 肝区信号持续增强超过8小时；
- 信号主要集中在肝脏与脾脏，体现器官特异性。
🔬七、组织切片成像揭示损伤异质性与细胞特异性
将小鼠肝脏冷冻切片（OCT包埋）进行共聚焦成像：
- 肝损伤组信号最强；
- 修复组次之，对照组最低；
- 局部高亮荧光斑点（非均一分布），提示肝内细胞间存在氧化水平异质性。
🧬细胞定位验证：
- 与HNF4α抗体（肝实质细胞）共染色：信号基本不重叠；
- 与F4/80抗体（巨噬细胞）共染色：高度重叠；
- 推断：EC5-H3主要在肝巨噬细胞中富集并被氧化→产生荧光。
🧫八、脾脏区域信号来源分析
- 发现脾脏边缘区（MZ）富集信号；
- MZ为血液滤过与巨噬细胞富集区；
- 共染结果验证F4/80⁺脾巨噬细胞中信号强烈；
- 说明EC5-H3除用于肝损伤外，也具备免疫监测潜能。
🧩九、理论计算支持机制合理性
基于DFT分析：
- EC5-H3的HOMO能级高于EC5-H1/EC5-H2，最易被氧化；
- 表明该还原位点化学设计具备结构合理性；
- 荧光信号变化的高速、低背景、高对比度来自分子轨道分布优势。
🔚十、总结与展望
本研究成功构建近红外发射波长达890 nm，激发比214倍的EC5-H3 ROS探针，并通过体外、细胞及活体等多层级系统性实验验证其优越性能，主要亮点包括：
- 🧠设计创新：跳出传统spiro-cyclization，采用共轭加成；
- 💡性能卓越：超高turn-on倍率、光稳定性
参考文献
Hu, X.; Yao, C.; Wang, B.; Zhang, Y.; Yang, J.; Dong, Y.; Li, Y.; Wang, D.; Chen, X.; Deng, Y.; Ge, G.; Zhou, B.; Luo, X.; Qian, X.; Yang, Y. Near‐Infrared Biosensing of Drug‐Induced Cell‐Heterogeneous Injuries with an Ultrahigh Turn‐On Ratio. Angew Chem Int Ed 2025, e202503579. https://doi.org/10.1002/anie.202503579.