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【JACS】如何让癌症无处可逃？——突破性共价靶向亲和蛋白药物助力精准治疗 ​

研究背景 ​

亲和蛋白（如 affibody 和 monobody）是一类小型支架蛋白，具有极强的肿瘤靶向能力。然而，由于其分子小，临床应用面临血液快速清除和肿瘤滞留不足的问题。传统的亲和蛋白药物通常只能通过可逆作用结合靶点，而其在肿瘤组织中的滞留时间有限，降低了治疗效果。为了克服这一难题，本研究提出了一种新的共价靶向策略，使亲和蛋白能够与其靶点形成不可逆的结合，从而显著提高肿瘤滞留并提升治疗效果。

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共价靶向策略 ​

研究团队采用 SuFEx（硫氟交换）化学，开发了一种 maleimide 取代芳基氟硫酸酯（MFS） 连接子，使亲和蛋白能够通过化学修饰与靶点共价结合。关键步骤包括：

  1. 设计 MFS 连接子：该连接子通过 thiol 反应与蛋白上的半胱氨酸位点相连，使蛋白具备与靶点共价结合的能力。
  2. 筛选适合的连接子长度：研究人员合成了不同长度的 MFS 连接子，以确定最佳结合效果。
  3. 共价交联实验：通过蛋白免疫印迹（Western blot）验证修饰的亲和蛋白是否能够与靶点形成稳定的共价连接。

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研究结果 ​

体外实验 ​

- 亲和蛋白对 HER2 的结合效率： ​

  • 采用 MFS 修饰的 affibody 亲和蛋白在体外实验中对 HER2 受体的共价结合率达到了 72%，远高于非共价对照组。
  • 细胞摄取实验显示，共价修饰的 affibody 蛋白较非共价药物提高了 185% 细胞摄取率，证明其共价结合能力可以增强肿瘤细胞对药物的摄取。

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- 亲和蛋白对 EGFR 的结合效率： ​

  • 研究团队还针对 EGFR 受体 开发了 monobody 亲和蛋白，实验结果显示其与 EGFR 形成了稳定的共价结合，提高了药物在肿瘤组织中的滞留效果。
  • 经过优化的 Adnectin-17MFS01-PE24 亲和蛋白能够与 Lys105 位点共价交联，确保药物在癌细胞中的持久作用。

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细胞摄取及内化机制 ​

  • 共价修饰显著提高了亲和蛋白的 细胞摄取能力，荧光标记实验显示：
    • HER2 靶向的 affibody 亲和蛋白 在 SKOV-3 细胞中的摄取比非共价修饰药物 提升 1.85 倍。
    • EGFR 靶向的 monobody 亲和蛋白 在 A-431 细胞中的摄取比非共价修饰药物 提升 1.39 倍。
  • 共价修饰蛋白主要通过 受体介导的内吞 进入细胞，并在 溶酶体环境 中释放活性成分。

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体内实验 ​

  • 在小鼠模型中，共价亲和蛋白药物的 肿瘤滞留能力较非共价药物提高 2.01 倍，有效延长药物在肿瘤组织中的作用时间。

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  • 通过活体荧光成像观察药物在小鼠体内的分布，显示 共价修饰蛋白药物能够更快、更稳定地富集于肿瘤组织，降低在正常器官的分布，提高靶向治疗效果。

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  • 经过 16 小时的实验，72.08% 以上的药物成功共价结合靶点，大幅减少药物流失，提高治疗效果。

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抗肿瘤疗效 ​

  • 细胞存活率测定（CCK-8）：

    • 研究发现，采用共价修饰的 affibody 亲和蛋白药物 ZHER2:342-25MFS03-PE24 对 SKOV-3 细胞的半数抑制浓度（IC50）仅为 0.54 nM，相比非共价对照组 下降了 2.5 倍。
    • 类似的，采用共价修饰的 monobody 亲和蛋白药物 Adnectin-17MFS01-PE24 对 A-431 细胞的 IC50 仅为 0.31 nM，相比非共价药物 下降了 4.9 倍。

  • 细胞凋亡实验：

    • 荧光标记实验显示，服用共价修饰药物的癌细胞 凋亡率达到 73.58%（HER2 靶向），相比未修饰药物 提升 27%。
    • 另一组实验发现 EGFR 靶向药物的凋亡率达到 73.95%，相比未修饰的药物 提升 41%。

  • 动物实验：肿瘤抑制效果：

    • 在小鼠模型中，共价亲和蛋白药物的 肿瘤抑制效果显著提高，接近完全抑制肿瘤生长。
    • 观察发现，共价修饰蛋白药物在肿瘤组织中保持 高浓度分布超过 48 小时，相比非共价药物的分布时间（24 小时） 延长了一倍。

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结论 ​

本研究开发了一种新型的 化学修饰策略，通过 SuFEx 反应 在亲和蛋白药物上引入共价结合能力，显著增强其肿瘤滞留能力，提高治疗效率。实验结果表明：

  • 亲和蛋白的共价结合能力增强了药物摄取，提高了 药物浓度 和 肿瘤滞留时间。
  • 共价靶向策略提高了肿瘤细胞的凋亡率，优化了治疗效果，使肿瘤几乎完全消失。
  • 该策略可广泛应用于其他蛋白药物，为未来的生物制药提供新的可能性。

这一策略为亲和蛋白类癌症治疗药物的开发提供了强有力的支持，有望大幅提高癌症靶向疗法的效率，同时推动蛋白类药物的临床应用。

参考文献 ​

Xia, X.; Gao, W.; Yang, X.; Huang, W.; Xia, X.-X.; Yan, D. Chemically Engineered Affinity Protein Drugs for Covalent Targeted Cancer Therapy. J. Am. Chem. Soc. 2025, jacs.5c02212. https://doi.org/10.1021/jacs.5c02212.