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【JACS】高灵敏度精准追踪细胞内外二氧化硫（SO₂）的新选择-氟核磁共振（19F-NMR） ​

这篇文章发表在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society），研究了一种利用高灵敏度的氟核磁共振（19F-NMR）技术，在活细胞中可视化和定量基础水平的二氧化硫（SO₂）的方法。这项研究的核心在于开发了一种高效的19F探针（P1-CF₃），能够选择性地与活性硫化物（RSS）反应，并生成具有独特化学位移的稳定产物，从而能够在核磁共振谱图中清晰区分细胞内外的SO₂水平。

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背景与研究目的 ​

二氧化硫（SO₂）在生物体内不仅是重要的气体信号分子，还涉及细胞增殖、凋亡、氧化应激、炎症反应和内质网压力等多种生理过程。其异常水平与癌症、神经系统疾病和心血管疾病密切相关，因此，能够精准监测SO₂的基础水平对于理解其生理功能和疾病机制至关重要。然而，由于SO₂的连续生成和快速扩散，其定量分析面临较大的挑战，现有方法如荧光探针技术存在背景干扰，难以清晰区分细胞内外的SO₂水平。本研究旨在利用19F-NMR高灵敏、无背景干扰的优势，设计一种高选择性的探针，实现对活细胞中SO₂的实时监测和精准定量。

研究方法与关键技术 ​

研究人员设计了多种19F探针，并系统评估它们与SO₂的反应性，最终优化出一种高性能探针P1-CF₃，该探针不仅能快速、选择性地与SO₂反应，还能生成稳定的化学产物，且化学位移与其他RSS具有显著区分度。该方法的核心技术包括：

探针优化与合成： ​

  • 研究团队设计了一系列探针（P1-CF₃、P2-SCF₃、P3-CF₃等），其中P1-CF₃表现出最佳的检测性能。
  • 采用共轭迈克尔受体结构，通过氟原子的高灵敏度提高检测能力。 image.png

核磁共振分析： ​

  • 通过19F-NMR测定不同探针与SO₂的化学反应速率和产物稳定性。
  • 在溶液和活细胞环境中优化检测参数，确保结果的准确性和稳定性。

选择性验证： ​

  • 研究人员系统测试了P1-CF₃对不同RSS的选择性，发现该探针能够明确区分SO₂，而不受小分子生物硫化物（如谷胱甘肽、半胱氨酸、氢硫酸盐等）的干扰。 image.png

关键发现 ​

高选择性检测SO₂： ​

  • P1-CF₃能够快速与SO₂反应，形成具有特征化学位移的产物（-61.05 ppm和-61.26 ppm）。
  • 该反应具有极高的灵敏度，可检测浓度低至1 μM的SO₂。

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实时监测活细胞中的SO₂水平： ​

  • 研究人员在不同类型的哺乳动物细胞（HEK293T、HepG2、A549、NIH-3T3等）中应用该方法，发现细胞类型间的基础SO₂水平存在显著差异。
  • HEK293家族细胞内的SO₂水平较高，而癌细胞（如HepG2）中的SO₂水平较低，表明SO₂水平可能受到细胞代谢状态的调控。

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SO₂的主要来源： ​

  • 通过对细胞培养液的测定发现，HEK293T细胞释放出的SO₂远高于HepG2细胞，表明HEK293T细胞具有较高的SO₂代谢能力。
  • 研究进一步揭示SO₂的主要生物合成路径来源于半胱氨酸（Cys）代谢，而非谷胱甘肽（GSH）。
  • 实验表明，当HEK293T细胞培养基中额外补充0.5 mM Cys时，SO₂水平显著升高，而GSH补充则未引起类似变化，甚至可能减少SO₂含量。
  • 通过RNA定量PCR（RT-qPCR）分析SO₂代谢相关酶（如谷氨酸草酰乙酸转氨酶GOT1/2、硫代硫酸硫转移酶TST等）发现，HEK293T细胞中GOT1的表达水平远高于HepG2细胞，这可能是其较高SO₂生成能力的主要原因。

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SO₂的胞外扩散机制： ​

  • 在活细胞实验中，研究发现细胞内SO₂的水平保持相对稳定，而胞外SO₂随着时间推移逐渐增加，这表明SO₂能够自由跨膜扩散并持续外排。
  • 这一特性与另一种气体信号分子H₂S类似。

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GOT1抑制剂影响SO₂生成： ​

  • 进一步研究表明，使用GOT1抑制剂（compound 2c）处理HEK293T细胞，显著降低了细胞内SO₂水平，证明GOT1在SO₂生成中的关键作用。

结论与影响 ​

该研究成功开发了一种高灵敏度、无背景干扰的19F-NMR方法，能够精准量化活细胞中的基础SO₂水平，并区分细胞内外SO₂。该技术具有以下重要影响：

1. 生理学研究： ​

  • 可用于揭示SO₂在细胞信号传导和代谢中的作用，有助于理解其在疾病中的功能。
  • 研究发现SO₂水平受细胞类型及代谢状态调控，这对细胞生物学研究意义重大。

2. 医学应用： ​

  • 由于SO₂异常水平与癌症、心血管疾病等有关，该检测技术或可用于疾病早期诊断或药物筛选。
  • SO₂供体药物开发或可利用本研究的发现优化治疗策略。

3. 分析化学创新： ​

  • 该研究突破了现有SO₂检测技术的局限，特别是解决了细胞内外SO₂区分难题，未来可推广至更多生物活性小分子检测领域。

展望 ​

未来，该技术有望应用于更广泛的细胞类型，并结合其他代谢监测技术揭示SO₂的生理学和病理学功能。此外，优化更高灵敏度的19F探针，或可进一步降低检测限，使其成为生物医学研究和精准医学的有力工具。

参考文献 ​

Cui, C.-Y.; Li, B.; Zhang, X.; Guo, S.-L.; Pan, B.-B.; Su, X.-C. Visualization and Quantification of Base-Level SO2 in Live Cells without Intracellular Background Interference Using Sensitive19 F-NMR. J. Am. Chem. Soc. 2025, jacs.5c04351. https://doi.org/10.1021/jacs.5c04351.