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【JACS】30倍增强荧光信号，650纳米发射波长——双三氟甲基罗丹明染料开启活细胞成像新时代 ​

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一、研究背景与意义 ​

荧光染料是现代生物成像领域不可或缺的工具，尤其在活细胞成像、单分子追踪和功能成像等方面扮演关键角色。传统的罗丹明类染料（如TMR）虽然具有良好的亮度和生物相容性，但其发射波长偏短，往往落在560–590纳米区间，容易受到组织自发荧光的干扰，限制了其在深层组织和高对比度成像中的应用。

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因此，研究者们一直试图推动染料向**远红光或近红外区域（>650 nm）**发展，以实现更深层、无背景的高分辨率成像。

二、BF染料的分子设计与创新点 ​

本研究提出了全新的染料设计思路——将传统羧基罗丹明（CarboRhodamine）分子结构中**10’位的双甲基（-CH₃）替换为双三氟甲基（-CF₃）**基团，从而构建出一种全新类别的染料——双三氟甲基羧基罗丹明（BF Dyes, BerkeleyFluors）。这一替换策略带来了两个显著优势：

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  1. 波长大幅红移：相比传统的氧桥罗丹明染料，BF染料的激发与发射波长向红光区域推移了约90纳米，突破650纳米大关，进入远红至近红外区域。

  2. 高度荧光原位激活性（fluorogenicity）：CF₃基团的强电负性使得染料更倾向于维持闭环无色状态，结合靶标后则转变为有色开放结构，荧光增强可达30倍，显著提高成像对比度。

三、计算化学验证与理论支持 ​

研究团队运用密度泛函理论（DFT）在B3LYP/def2TZVP水平上进行了前线轨道能级计算，确认BF染料的HOMO–LUMO能隙为2.46 eV，低于CarboTMR（2.60 eV）和SiR染料（2.48 eV），为其远红特性提供了理论依据。

此外，计算结果还揭示，CF₃基团同时降低了HOMO和LUMO能级，使得染料不仅红移明显，而且闭环稳定性增强，从而提高荧光开关能力。

四、合成策略与结构多样化 ​

作者开发了两条合成路线。初始路线以多步反应合成中心骨架，通过导向硝化、还原与亲核加成等步骤，最终构建出BF核心结构，并实现多种辅助基团（auxochrome）的接入，获得一系列衍生物。 image.png

然而，为提高反应普适性与官能团兼容性，作者还开发出一条后期功能化策略：通过Sandmeyer反应将芳胺转化为溴代物，再结合Grignard加成与Buchwald-Hartwig偶联，灵活导入十余种不同氮取代基，包括：

  • 四甲基、四乙基
  • 碳环与氟代氮杂环（如azetidine、morpholine）
  • 含硫杂环（如thiomorpholine）
  • 不对称胺（如苯胺、氟乙胺）

这一策略使得BF染料的激发/发射波长可在592–661纳米之间灵活调控。

五、光物理性能与生物相容性测试 ​

BF染料的量子产率（Φ）和摩尔消光系数（ε）均表现优异。例如，四甲基衍生物在水溶液中的Φ为33%，ε超过140,000 M⁻¹cm⁻¹，光稳定性也优于传统SiR染料。

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更重要的是，BF染料展示出极低的背景信号，在未结合靶标时几乎无荧光，一旦与HaloTag蛋白结合则激发出高达50倍的荧光增强，远超市售SiR标记物（一般为2–7倍）。

此外，作者进一步将BF染料成功应用于细胞器靶向成像与膜电位检测，验证其适用于无清洗成像（no-wash imaging）、光控荧光标记（chemigenetic labeling）以及单分子追踪（Single-Molecule Tracking）等高端技术。

六、活细胞成像与单分子应用拓展 ​

使用BF染料标记HaloTag融合蛋白，研究团队在HEK293T与U2OS细胞中实现了不同细胞器（核、线粒体、内质网）的精准靶向成像。染料展示出优异的膜通透性、生物稳定性和光稳定性。

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在单分子追踪实验中，BF染料成功标记了核内蛋白（如H2B、Sox2、HEXIM1），实现高分辨率的空间轨迹绘制，为探索转录因子动力学、RNA结合机制提供了强有力工具。

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七、结论与展望 ​

本研究所开发的BF染料填补了传统罗丹明染料在远红光区域缺乏高性能染料的空白，其独特的结构设计实现了**“红移波长+高荧光增强”**的协同进化。从分子设计、光物理参数到生物成像应用，BF染料系统展现出强大的功能拓展性与实践潜力。

未来，这一策略还可拓展至纳米探针设计、光遗传操控、超分辨成像等前沿技术领域，或许将在光学生物学与精密医学中掀起新一轮革命。

参考文献 ​

Gerstner, N. C.; McCann, J. T.; Martin, J. G.; Henn, K. M.; Riske, K.; Anantakrishnan, S.; Graham, T. G. W.; Darzacq, X.; Miller, E. W. Bis(Trifluoromethyl)Carborhodamines: Highly Fluorogenic, Far-Red to Near-Infrared Dyes for Live Cell Fluorescence Microscopy, Activity-Based Sensing, and Single-Molecule Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 2025, 147 (25), 21950–21960. https://doi.org/10.1021/jacs.5c05473.