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【Angew. Chem.】信号增强3倍！“诱饵DNA”策略实现DNA探针在活细胞中稳定24小时的全新突破 ​

🧬一、研究背景：DNA张力探针在细胞力学研究中的局限与挑战 ​

细胞与周围环境的机械互作对于细胞粘附、迁移、分化及激活等行为具有关键作用，这些过程统称为机械转导（mechanotransduction）。为了揭示这一过程的分子机制，科学家们开发了DNA张力探针（molecular tension probes），可在单分子层面、pN力敏感的尺度上，实时探测细胞产生的机械应力。

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DNA探针常结合RGD等粘附配体，通过FRET、荧光解猝灭、DNA-PAINT等方式，在受力发生时生成可视化信号。然而，在活细胞环境下，这些DNA探针极易被核酸酶（DNases）降解：

  • 降解会快速终止探针功能，使实验时间受限；
  • 更糟糕的是，探针被降解时的荧光信号会被误解为“力作用”，产生大量假阳性信号。

这两个问题极大限制了DNA张力探针在长期细胞力学实验中的应用。

💡二、关键策略：以“诱饵DNA”吸引核酸酶保护真实探针 ​

为克服上述难题，研究者提出一种全新策略——添加“诱饵DNA”：

含义：向实验体系中加入大量未修饰的双链DNA，作为“诱饵”吸引DNase，与探针竞争结合，大幅延缓目标DNA的降解速度。

相比于改造DNA结构（如引入PNA、左旋DNA、PS修饰等昂贵方法），此方案具有以下优点：

  • 可直接与现有探针体系兼容；
  • 无需结构改造与额外标定；
  • 成本低廉，每次实验耗费不到1美元；
  • 对细胞行为干扰小，适用于多种细胞系。

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🧪三、“诱饵DNA”保护机制实验证明 ​

📍1）自由悬浮探针的保护效果 ​

  • 被测探针：18 bp荧光标记双链DNA（Cy3/BHQ2体系）
  • 降解环境：加入125 U/L DNase I
  • 结果：
    • 无诱饵DNA时：10分钟内完全降解；
    • 添加2.5 μM诱饵DNA后：完整探针可稳定存在至少60分钟；
    • 荧光信号强度显著减缓增长，表明假信号减少。

📍2）固化表面探针在细胞下的表现 ​

  • 细胞模型：乳腺癌细胞MDA-MB-231（高DNase表达）
  • 涂层：玻璃表面修饰RGD配体与DNA探针
  • 诱饵DNA浓度梯度：0、5、20、80 μM
  • 观察时间：1、4、24小时
  • 结果：
    • 未添加时，1 h内即出现荧光虚假增强，24 h内信号几乎全部丧失；
    • 添加80 μM诱饵DNA后，即使24 h仍能保持大部分探针活性；
    • Confocal图像显示降解荧光“珊瑚状斑点”明显减少。

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📸四、应用于张力成像系统中的验证：提升信噪比约3倍 ​

🔧1）Tension Gauge Tether (TGT)系统保护： ​

  • 原理：张力拉断双链DNA后荧光解猝灭产生信号；
  • DNase降解也能产生“假信号”；
  • 添加5 μM诱饵DNA后：
    • 背景信号降低6倍；
    • 实际张力信号强度提高，整体SNR提升约3倍；
    • 明显改善图像质量和可靠性。

🔧2）Hairpin张力探针（MB-PAINT）保护： ​

  • 原理：力拉开发夹结构暴露结合位点→MB探针瞬时结合发光；
  • 降解会导致背景漂白与信号误解；
  • 实验比较：
    • 无保护：1小时内背景荧光饱和，无法识别细节；
    • 加入5 μM诱饵DNA后：保持清晰力信号，图像具备高分辨率。

🔬五、在TIRF成像与超分辨张力图像中的显著优化 ​

  • TIRF显微镜揭示：未保护时，背景区域单分子事件密集，干扰力学信息；
  • 加入诱饵DNA后：
    • 单分子信号更集中；
    • 图像分辨率提升，细胞边界清晰可辨；
    • 亮度分布双峰现象消失，表明“降解假信号”被有效抑制；
    • 整体背景强度降低至原来1/2以下，定位精度显著提高。

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🕒六、活细胞中24小时稳定性实现 ​

  • 实验关键测试：
    • 加入80 μM诱饵DNA，孵育乳腺癌细胞24小时；
    • 控组探针全部降解，细胞脱落；
    • 诱饵组细胞保持粘附，探针活性保存；
    • 成像清晰，信噪比保持与1 h时相当。

🧠七、机制原理与设计考量 ​

  • DNase偏好降解dsDNA，无序剪切碎片可作为二次诱饵；
  • 使用48 bp无CpG双链DNA设计，防止TLR9免疫激活反应；
  • 长度控制在免疫刺激阈值以下（＜50 bp）；
  • 成本优势显著，远优于PNA、PS-DNA、L-DNA等修饰核酸（后者价格高达其200倍）；
  • 可按系统进行“诱饵序列”优化，未来支持个性化细胞环境防护设计。

🔮八、应用拓展与未来展望 ​

  • 不仅限于张力探针系统，还可应用于：
    • DNA/RNA适配体（如SELEX产物）稳定；
    • DNA纳米结构（如DNA-FRET钳）长期追踪；
    • 动态微环境监测与活细胞荧光传感平台；
  • 结合可穿戴生物传感器/柔性器件，可用于癌症监测、免疫分析、药物筛选；
  • 若每日补充诱饵DNA，还可进一步延展至48小时甚至更长实验周期。

✨结语：简单策略，惊人效果 ​

本研究首次证明，加入仅5–80 μM的“诱饵DNA”，即可在不改变探针结构、不增加成本、无需复杂优化的前提下：

  • 大幅延长探针稳定性（从1–2小时 → 超过24小时）；
  • 消除假信号、提升信噪比（最高达3倍）；
  • 推动DNA张力成像技术向长期、高精度、低干扰实验方向转型。

🎯这项技术以其通用性、成本效益与操作简便性，预示着DNA探针在未来活细胞力学研究中的广泛应用与商业转化潜力。

参考文献 ​

Zhang, H.; Kim, S. H.; Li, I. T. S. Decoy DNA Protects Molecular Tension Probes from DNase Degradation. Angew Chem Int Ed 2025, e202506590. https://doi.org/10.1002/anie.202506590.