Fluolab【JACS】超分辨率成像探针mDZ-RhoBAST用于活细胞FTO去甲基化研究
简介
本研究介绍了一种用于超分辨率实时成像FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）去甲基化过程的新型核酸探针mDZ-RhoBAST。该探针结合了6mA修饰的DNAzyme与RhoBAST荧光适配体，通过FTO的激活恢复DNAzyme的切割活性，使RhoBAST能够结合荧光团，实现FTO去甲基化过程的超分辨率成像。
摘要
单分子定位显微技术（SMLM）能够提供细胞内靶标分子的高精度成像。荧光适配体（FLAPs）为RNA标记提供了一种灵活方法，能够在活细胞中选择性结合荧光团，实现单分子成像。然而，研究RNA活动的蛋白调控过程仍然面临挑战。本研究开发了mDZ-RhoBAST探针，用于活细胞FTO去甲基化过程的超分辨率成像。mDZ-RhoBAST结合了6mA修饰DNAzyme与RhoBAST FLAP，通过FTO激活DNAzyme的切割活性，使RhoBAST结合荧光团，实现精准的超分辨率成像。该方法成功实现了活细胞内源FTO的去甲基化过程实时监测，为其生物学功能提供了新的研究工具。
研究结果与讨论
mDZ-RhoBAST的优化
为了提高成像效率，研究优化了DNAzyme序列、RhoBAST与荧光团的结合能力及荧光团的选择。实验筛选了不同的PEG长度的TMR-n-DN荧光团，发现TMR-3-DN具有最佳荧光变化（37.73倍）及较强结合能力（K_D = 1.5 ± 0.3 nM），因此选定该荧光团用于成像。与此同时，优化DNAzyme的底物序列以确保RhoBAST在切割后能恢复荧光团结合能力，从而保证mDZ-RhoBAST对FTO去甲基化的精准响应。
mDZ-RhoBAST在活细胞中的应用
实验通过转染mDZ-RhoBAST进入活细胞，并结合TMR-3-DN进行成像，结果表明FTO表达水平影响mDZ-RhoBAST的荧光信号。过表达FTO后，荧光显著增强，而敲低FTO后，荧光明显减弱，表明该探针可用于检测FTO活性。此外，研究还验证了探针对ALKBH5（另一种去甲基化酶）无反应，进一步确认了其对FTO的特异性。
超分辨率单分子成像揭示FTO的亚细胞定位
通过共聚焦显微镜及SMLM技术分析mDZ-RhoBAST与FTO的共定位，发现探针与FTO-EGFP在细胞质中具有良好共定位。研究还利用荧光染料标记细胞器，发现mDZ-RhoBAST在部分情况下与线粒体共定位，但主要分布于细胞质中，表明FTO在胞质中的功能可能与其代谢调控密切相关。
监测FTO对葡萄糖剥夺的响应
FTO不仅在RNA代谢调控中发挥作用，还受到代谢因子的影响。研究通过mDZ-RhoBAST监测细胞在葡萄糖剥夺条件下的FTO表达，发现葡萄糖剥夺导致细胞质内FTO荧光信号明显减弱，表明葡萄糖水平影响FTO表达。此外，通过时间序列成像分析FTO在葡萄糖恢复后的动态变化，发现FTO水平逐渐恢复，进一步证实了mDZ-RhoBAST在实时监测代谢调控中的潜力。
结论
本研究开发了mDZ-RhoBAST探针，实现了活细胞内FTO去甲基化过程的超分辨率成像。优化的成像系统确保了高特异性和高精度，成功验证了探针对FTO的特异性，并用于研究FTO的代谢调控。该探针不仅可用于研究RNA修饰过程，还可用于其他表观遗传调控蛋白的成像，为探索动态分子机制提供了新工具。未来，该方法可推广用于研究更多RNA相关蛋白，为表观遗传学研究提供新的视角。