Fluolab【Angew.Chem.】🔬突破传统检测！一文读懂“2种酶+1种DNA酶”打造的超灵敏病毒与癌症诊断平台
在精准医疗和快速诊断日益重要的今天，如何实现对疾病相关蛋白酶的高灵敏度检测，成为科研与临床的共同挑战。近日，《Angewandte Chemie》发表的一项研究提出了一种创新的DNAzyme放大蛋白酶检测平台（DP平台），不仅实现了对新冠病毒（SARS-CoV-2）蛋白酶的准确识别，还成功用于结直肠癌（CRC）组织的分型分析。本文将为您详细解读这一平台的设计原理、性能优势及临床应用潜力。
🧬一、DNAzyme放大蛋白酶检测平台的设计原理
传统的蛋白酶检测方法，如ELISA和免疫组化，虽然广泛应用，但存在灵敏度低、操作复杂、无法区分活性酶与前体酶等问题。为解决这些痛点，研究团队设计了一种基于DNAzyme（脱氧核酶）的放大检测系统。
该平台核心由两部分组成：
- 功能性正电荷肽段：含有特定蛋白酶识别序列及富含精氨酸的抑制结构；
- DNAzyme催化元件：带负电荷，可催化核酸底物裂解，产生荧光信号。
在未加入目标蛋白酶时，肽段与DNAzyme通过静电作用结合，抑制其催化活性。一旦目标蛋白酶（如新冠病毒的3CLpro或PLpro）识别并水解肽段，DNAzyme被释放，恢复活性，进而裂解底物并放大信号，实现高灵敏度检测。
🧪二、单酶激活系统：检测新冠病毒蛋白酶
研究首先构建了单酶激活的DP平台（s-DP），以新冠病毒的3CLpro蛋白酶为模型进行验证。
- 在加入3CLpro后，荧光信号显著增强，表明DNAzyme成功激活；
- 与传统非放大平台相比，s-DP的信噪比提升至11.95，是原系统的3.5倍；
- 检测限（LOD）低至0.55 nM，比传统方法提升约11.3倍；
- 对其他蛋白酶（如Furin、Caspase-3、Thrombin）无响应，表现出良好的特异性。
此外，该平台还用于筛选3CLpro抑制剂，成功评估了Ebselen、Lopinavir和Hesperetin三种药物的抑制效果，验证了其在药物筛选中的应用潜力。
🔐三、双酶逻辑门系统：提升检测特异性
为进一步降低复杂样本中的假阳性风险，研究团队构建了双酶激活的DP平台（d-DP），引入“AND逻辑门”机制：
- 肽段同时包含3CLpro和PLpro两个识别位点；
- 仅在两种酶同时存在时，DNAzyme才被激活，产生荧光信号；
- 在人类唾液和血清中验证，背景信号低，特异性高；
- 检测限分别为0.16 nM（3CLpro）和0.17 nM（PLpro），灵敏度进一步提升。
该系统在20份唾液样本中进行盲测，准确率达100%，ROC曲线AUC值为1.0，远高于传统平台（AUC仅为0.76），显示出卓越的临床诊断性能。
🧫四、平台通用性验证：结直肠癌分型分析
除了病毒检测，该平台还被拓展用于结直肠癌相关蛋白酶的检测：
- 通过转录组和蛋白质组筛选，选定MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9和Cathepsin D五种癌症相关蛋白酶；
- 为每种酶设计特异性肽段，构建五种DP传感器；
- 在癌细胞（HT-29）与正常细胞（NCM-460）中检测，癌细胞中酶活性显著升高；
- 多酶联合分析（SUM）提升诊断准确性，PCA分析可清晰区分癌与非癌样本；
- 在14份临床组织样本中检测，准确率达93%，验证了平台的临床实用性。
📦五、POCT应用：与试纸条完美兼容
DP平台的另一个亮点是其与核酸侧流试纸条（LFIA）的高度兼容性：
- DNAzyme裂解产物为核酸片段，可直接用于试纸条检测；
- 与传统肽段平台相比，背景信号更低，信噪比更高；
- 可实现快速、便携的现场检测，适用于资源受限地区。
在LFIA中，d-DP平台可实现对3CLpro和PLpro的浓度响应，检测限分别为1 nM和3 nM，展示了其在POCT场景下的强大潜力。
🧠六、总结与展望
本研究提出的DNAzyme放大蛋白酶检测平台，融合了肽段识别与核酸催化的优势，具备以下显著特点：
- 灵敏度高：检测限远低于传统方法；
- 特异性强：双酶逻辑门有效降低假阳性；
- 通用性强：可定制肽段，适配多种蛋白酶；
- 便携性好：兼容试纸条，适用于POCT；
- 应用广泛：覆盖病毒检测、癌症分型、药物筛选等领域。
未来，该平台有望在更多疾病的早期筛查、个体化治疗监测及公共卫生应急中发挥重要作用，推动精准医疗的进一步发展。