Fluolab【Angew.Chem】🔬突破性荧光探针：揭秘丙酮酸激酶调节的「37纳米」秘密
丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）作为糖酵解末端的关键酶，近年来在癌症、糖尿病及代谢疾病研究中备受关注。然而，针对其异构体（尤其是肝脏型PKL）的变构调节机制，长期缺乏高效的细胞内靶点结合检测工具。本文介绍了一种新型荧光探针——LumiPK，其结合能力高达37±5 nM，填补了PKL靶点结合技术的空白，为药物筛选和机制研究提供了强有力的工具。 
🧬一、背景：丙酮酸激酶为何重要？
丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸，并生成ATP，是糖酵解的终点反应。人体中存在四种PK异构体：
- PKL：主要在肝脏表达
- PKR：红细胞中表达
- PKM1：肌肉和脑组织
- PKM2：增殖细胞和胚胎组织中表达
这些异构体通过变构调节机制响应内源性代谢物（如果糖1,6-二磷酸）或外源性小分子调节剂，从而调控细胞能量代谢。尤其在癌症和代谢疾病中，PK的活性变化与病理过程密切相关。
💡二、技术瓶颈：变构调节剂的靶点验证难题
尽管已有多种PK调节剂问世，如Mitapivat、TEPP-46和DASA-58，但验证其在细胞内是否真正结合PKL的变构位点仍是挑战。传统方法如热转移、蛋白质组学或FRET等，存在操作复杂、通量低或特异性差的问题。 
NanoBRET技术因其高通量、低资源需求而受到青睐，但此前尚无针对PKL的NanoBRET系统，主要受限于缺乏高亲和力的荧光探针。
🌟三、LumiPK的诞生：从设计到验证
研究团队以专利中的Phthalazine类激动剂为基础，设计了四种荧光探针（I–IV），其中LumiPK（IV）表现最优。其核心设计包括： 
- 将环境敏感型SBD荧光团直接嵌入配体骨架
- 通过结构优化提升亲和力和细胞通透性
- 采用晶体结构验证其与PKL变构位点的结合模式
🔬关键数据：
- LumiPK对PKL的结合常数：KD = 37±5 nM
- 细胞内NanoBRET实验EC50：18.4 nM
- 对PKM2的选择性：约37倍
- 与PKL四聚体专一结合，不与单体或二聚体结合
🧪四、实验验证：从体外到活细胞
研究采用多种方法验证LumiPK的性能：
1. 表面等离子体共振（SPR）
- LumiPK与PKL结合紧密，解离速率快于Mitapivat
- 与PKM2结合较弱，体现良好选择性
2. 荧光滴定与竞争实验
- 与Mitapivat、TEPP-46、DASA-58竞争结合，结果与SPR一致
- 可用于筛选新型变构调节剂
3. 活细胞成像与NanoBRET
- HEK293细胞快速摄取LumiPK，4分钟内达稳定信号
- 荧光信号稳定，光稳定性良好
- 不影响细胞活性，适合活细胞实验
🧬五、结构解析：晶体学揭示结合机制
X射线晶体结构显示：
- LumiPK与PKL变构位点形成多个水介导氢键
- Pyrazole基团与Phe38形成π–π相互作用
- 结合构象稳定，有助于高亲和力
此外，Native PAGE实验进一步证实LumiPK仅与PKL四聚体结合，强调其结构选择性。 
🚀六、应用前景：开启高通量筛选新纪元
LumiPK的成功开发不仅填补了PKL靶点结合检测的技术空白，还具备以下潜力： 
- 构建高通量NanoBRET筛选平台
- 用于药物机制验证与优化
- 拓展至其他PK异构体的探针开发
- 支持代谢疾病和癌症研究中的靶点验证
🎯结语：一个37纳米的突破，连接代谢与药物研发
LumiPK的出现，标志着变构调节剂研究进入精准检测时代。其高亲和力、细胞通透性和结构选择性，使其成为研究PKL调节机制的理想工具，也为未来开发新型代谢调节药物提供了坚实基础。
在代谢调控的迷宫中，LumiPK如同一盏荧光灯，照亮了37纳米的关键通道。
【原文链接】可参考 Wiley期刊页面 获取完整研究内容。
文章信息
📚文章标题：Potent Fluorescent Probe for Target-Engagement Studies of Allosteric Pyruvate Kinase Modulators 作者：O. Nilsson, A. P. Valaka, L. Håversen, A. Bogucka, I. Köteles, P. Brear, M. Rutberg, A. Gunnarsson, M. Hyvönen, M. Grøtli 期刊：Angew. Chem. Int. Ed 链接：https://doi.org/10.1002/anie.202513969